汉滩病毒结构蛋白与该病毒感染诱导表达的多种热休克蛋白的研究

目的：研究汉滩病毒(HTNV)感染乳鼠诱导其脑组织表达热休克蛋白(HSPs)及其与病毒结构蛋白的相互关系．方法：选出生2～3d的昆明乳鼠实验性感染HTNV，取感染后8d的乳鼠脑组织制成组织匀浆液，用双特异性抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫共沉淀方法分析病毒核衣壳蛋白(HTNVNP)和囊膜糖蛋白G2(HTNVG2)与94000葡萄糖调节蛋白(GRP94)、HSP70、HSP273种HSPs的关系．结果：HTNV感染乳鼠诱导其脑组织表达GRP94、HSP70；HTNVNP同时与GRP94、HSP70、HSP27相互作用，呈复合物形式存在；HTNVG2也与HTNVNP和HSP27存在相互作用，     

汉坦病毒诱导非洲绿猴肾上皮细胞热休克蛋白70的表达规律及意义

目的 :旨在研究汉坦病毒 (Hantavirus,HTV)感染非洲绿猴肾上皮 (Vero E6 )细胞后应激反应的规律及意义。　方法 :采用免疫细胞化学染色法、免疫荧光激光共聚焦及RT PCR方法观察热体克蛋白 (HSP) 70的表达规律。　结果 :HTV感染Vero E6细胞后 ,免疫细胞化学染色法可检出HSP 70阳性信号。感染后不同时间点 ,免疫荧光激光共聚焦显微镜及RT PCR观察结果表明 ,HSP 70及HSP 70mRNA的水平在感染后迅速升高 ,并持续高表达 (P <0 .0 5 )。　结论 :HTV可诱导Vero E6细胞HSP 70高表达 ;HSP 70可能具有抑制病毒复制和保护细胞的作用     

汉坦病毒感染体外诱导VeroE6细胞热休克蛋白的表达

目的 研究汉坦病毒（HTV）感染后对细胞应激基因表达的影响。方法 用HTV感染其敏感细胞株VeroE6细胞,用Western印迹杂交、RNA斑点杂交及原位杂交分别分析热休克蛋白（HSP）的表达及编码HSP的mRNA水平的变化。结果 病毒感染后细胞内HSP70及热休克蛋白mRNA水平均有增高,而HSP65及HSP27的表达则无明显改变。结论 HTYV感染可以直接诱导HSP70的高表达,可能在保护细胞免受病毒感染损伤方面具有一定意义。     

针对汉坦病毒S基因反义寡核苷酸抗病毒效应的研究

目的：研究反义寡核苷酸（asON）体外抗汉坦病毒（HV）的效应。方法：设计合成了分别针对HV S基因片段5′端手柄状结构区的asON1和针对mRNA翻译起始区的asON2，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测asON作用后HV感染细胞培养上清中HV核蛋白（NP）的表达水平，免疫荧光试验（IFA）检测asON作用后感染细胞膜上NP的表达水平，空斑减少中和试验（PRNT）测定asON作用和HIV感染细胞培养上清液中病毒滴度。结果：asON可抑制NP的合成以及病毒活恬。结论：asON具有一定的抗HV作用，有可能作为一种治疗人HV感染的新途径。     

热休克蛋白70和糖调节蛋白94在人胃癌细胞BGC-823中的表达

目的 :探讨热休克蛋白 70 ( HSP70 )和糖调节蛋白 94( grp94)在人胃癌细胞BGC- 82 3中的表达及其意义。方法 :利用 En Vision免疫细胞化学、双抗体标记免疫荧光和流式细胞仪方法检测和分析人胃癌细胞 BGC- 82 3中 HSP70和grp94的表达及其与细胞周期的关系。结果 :胃癌细胞存在 HSP70和 grp94的高表达 ,免疫细胞化学显示 HSP70和 grp94主要定位于胞浆 ;免疫荧光法和流式细胞仪检测显示 HSP70的表达阳性率为 84.9% ,grp94为 79.7% ,与阴性对照组存在明显的差异 ;在整个细胞周期均存在 HSP70和 grp94的持续表达。结论 :胃癌细胞存在 HSP70和 grp94的高表达 ,在整个细胞周期 HSP70和 grp94均持续表达 ,其表达与细胞周期无明显关系。 HSP70和 grp94在人胃癌细胞中的表达特点为瘤苗的研究奠定了基础。     

汉坦病毒诱导人脐静脉内皮细胞HSP70的表达及意义

目的: 研究人脐静脉内皮细胞(HUVEC)感染汉坦病毒 (Hantavirus, HTV)后应激反应的规律及意义. 方法: 采用免疫细胞化学染色法和核酸分子原位杂交, 检测热休克蛋白 70(HSP70)的表达; 用RT PCR观察HSP70mRNA水平变化的规律. 结果:HTV感染HUVEC后, 免疫细胞化学染色法可检出HSP70呈高表达, 原位杂交发现细胞质内有HSP70mRNA的阳性信号. 感染后不同时间点RT PCR的结果表明, 与对照组相比较, HSP70mRNA的水平在感染后迅速升高并持续高表达(P<0. 05). 结论:HTV可诱导HUVEC高表达HSP70. HSP70可能具有抑制病毒复制和保护内皮细胞的作用.     

RT-PCR检测汉坦病毒的感染

目的：探讨逆转录-聚合酶链庄应（RT-PCR）检测汉坦病毒（Hantaviru，HV）感染的准确性和敏感性。方法：以陈株汉坦病毒感染培养的Vero-E6细胞和小鼠乳鼠，用RT-PCR和免疫荧光（immunofluorescence，IF）的方法分别予以检测。结果：RT-PCR和IF对病毒感染细胞的检测结果均为阳性，8只接种病毒的乳鼠肺组织RP-PCR检测均为阳性，而免疫荧光检测仅5例阳性。结论：RT-PCR是一种比较准确的检测汉坦病毒感染的方法，其敏感性高于IF。     

HSP70在化学性缺氧诱导毛细胞损伤中的作用

目的：探讨热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）在氯化钴（cobalt chloride,CoCl2）诱导听细胞损伤中的作用。方法：应用CoCl2处理HEI-OC1听细胞,建立化学性缺氧诱导耳蜗外毛细胞损伤的体外模型。细胞计数试剂盒-8（cell count kit 8,CCK-8）比色法检测细胞存活率,免疫印迹法（Western blot）检测HSP70的蛋白表达。结果：在150-750μmol/L浓度范围内,不同浓度的CoCl2处理听细胞24 h可引起明显的细胞毒性,使细胞存活率呈剂量依赖性地降低。300μmol/L CoCl2作用听细胞30-240 min可时间依赖性地上调HSP70的蛋白表达。HSP70抑制剂槲皮素（quercetin,Quer）可在蛋白水平下调CoCl2引起的听细胞内HSP70表达增加。Quer通过抑制HSP70的表达可加重CoCl2诱导的听细胞缺氧性损伤。结论：适应性HSP70表达增加可保护听细胞对抗缺氧诱导的损伤。     

氧化应激对热休克蛋白70核仁分布的影响

目的：探讨氧化应激对热休克蛋白70（heat shock protein 70, HSP70）核仁分布的影响。方法：采用热休克反应（42℃ 1h，37℃恢复12h）诱导C2C12细胞中HSP70的高表达；构建HSP70与增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒。将重组质粒瞬时转染C2C12肌原细胞后，用免疫印迹技术分别检测热休克反应及基因转染诱导的HSP70表达；在分离纯化核仁和胞质蛋白组分后，分别采用免疫细胞化学、荧光技术及免疫印迹检测氧化应激（0.5mmol/L H2O2）诱导的HSP70的分布改变。结果：免疫印迹显示，热休克反应和瞬时转染重组质粒，均能导致C2C12细胞中HSP70的高表达；荧光示踪显示，过氧化氢处理1h后，可见胞核有较强的荧光；免疫细胞化学及细胞组分蛋白质免疫印迹显示，热休克处理的细胞暴露于过氧化氢1h后，HSP70从细胞质向细胞核及核仁移位。结论： 氧化应激能导致HSP70从胞质向核仁移位。     

苯并（a）芘、预热及其联合作用对人胚肺细胞HSP70合成的影响

用Western blot方法探讨苯并（a) 芘、预热及其联合作用对人胚肺（HEL）二倍休细胞热应激蛋白70（HSP70）合成的影响。结果表明未经S9活化的HEL细胞,在不同剂量的BaP处理后,可轻度诱导HSP70的表达;经S9尖化的BaP作用HEL细胞3hHSP70表达抑制,呈剂量－反应关系,在较高浓度染毒时抑制作用表现明显（P＜0．05）;预热应激的HEL细胞HSP70表达增加,但BaP染毒3h后HSP70表达并不规律,具体表现为低剂量（10－50）μmol/L诱导,而高剂量（50－200）μmol/L呈抑制趋势。结果提示 ,体外未经代谢活化的BaP可以作为应激原诱导热休克反应;HSP70表达降低可能是BP代谢活化产物作用的结果,预热诱导HSP70表达增加很可能掩盖了低浓度时BaP对HSP70合成的抑制作用。     

含有人热休克蛋白基因的重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞的实验研究

目的:研究含有人热休克蛋白70(HSP70)基因的重组腺病毒对乳鼠心肌细胞的转染效率以及基因转染后HSP70的表达。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)体外感染心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建的腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。结果:Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法以及免疫组化染色法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。结论:重组腺病毒Ad.HSP70能够在体外高效、安全地感染心肌细胞,并成功地表达HSP70。     

Increased expression of Hsp70 and co-localization with nuclea r protein in cells infected with the Hantaan virus

目的　研究汉滩病毒 (HTV)感染对应激基因表达的影响。方法　病毒感染 ,Westernblot,免疫组化 ,免疫荧光双标记 ,激光扫描共聚焦显微镜观察 ,RNA斑点杂交 ,原位杂交。结果　HTV感染细胞中Hsp70高表达 ,病毒感染后Hsp70从细胞浆转位至细胞核 ,病毒感染后不同时间点Hsp70的分布不一 ,间接免疫荧光双标记显示感染细胞的胞浆中NP与Hsp70有共定位。结论　汉滩病毒能直接诱导Hsp70的高表达 ,可能与病毒的装配有关 ,感染细胞中汉滩病毒蛋白与Hsp70共定位 ,并可能形成一种物理复合物     

不同血清型汉坦病毒基因重排的研究

目的探明汉坦病毒HTN型与SEO型、HTN型与PHV型之间基因重排的频率和特点。方法分别用相同滴度的汉坦病毒HTN型与SEO型(76-118株与SR-11株),及汉坦病毒HTN型与PHV型(76-118株与PHV株)毒株分别混合感染VeroE6细胞,用空斑形成试验挑选子代病毒克隆,挑得的单个病毒克隆在VeroE6细胞上扩增。分别用分型引物对子代病毒进行RT-PCR实验,以确定子代病毒L、M、S片段核酸的来源,鉴定子代病毒基因型。结果发现76-118株与SR-11株混种的子代病毒株基因30/44株来源于亲代病毒,9/44株子代病毒发生了基因片段重排。76-118株与PHV株混种的子代病毒株基因26/36株来源于亲代病毒,3/36株子代病毒发生了基因片段重排。76-118株与SR-11株混种的子代病毒株的基因重排率(20.45%)明显高于76-118株与PHV株混种的子代病毒株(8.33%)。结论这种重排率的差异可能是由于HTN型与SEO型HV基因核酸序列之间的同源性较高,而更容易发生基因重排。而HTN型与PHV型HV基因核酸序列之间的同源性较低,发生基因重排的机会显著降低。     

内质网分子伴侣家族成员在幽门螺杆菌感染者胃黏膜中的表达和意义

目的探讨内质网分子伴侣家族成员Grp94、Grp78和PDI在幽门螺杆菌感染者胃黏膜组织中的表达及意义。方法应用半定量RT-PCR方法及Westernblot方法分别检测感染与未感染幽门螺杆菌的人胃黏膜组织中Grp94、Grp78和PDI的mRNA及蛋白的表达情况。结果未感染组28例,Grp94、Grp78和PDI的mRNA表达量分别为(0.427±0.0360)、(0.8038±0.500)和(0.5198±0.0379),感染组32例,Grp94、Grp78和PDImRNA表达量为(0.882±0.082)、(1.1586±0.0839)和(1.0642±0.1533)。两组相比,感染组的Grp94、Grp78和PDImRNA的表达量明显高于未感染组(P<0.01);未感染组Grp94、Grp78和PDI蛋白表达量分别为(0.427±0.0360)、(0.4345±0.0545)和(0.5198±0.0379),感染组Grp94、Grp78和PDI蛋白表达量为(0.671±0.072)、(0.6204±0.0412)和(0.8252±0.032)。两组相比,感染组Grp94蛋白的表达量明显高于未感染组(P<0.01)。结论幽门螺杆菌感染可使人胃黏膜增加Grp94、Grp78和PDImRNA的表达及蛋白的合成,这可能有利于胃黏膜的自身保护作用。     

慢性阻塞性肺疾病患者血清 HSP27和 HSP70与肺功能及生活质量的相关性

目的：探讨慢性阻塞性肺疾病（ chronic obstructive pulmonary disease ,COPD）患者血清HSP27和HSP70水平与肺功能及生活质量的关系。方法选取2015年2月至2016年4月COPD急性加重患者45例（观察组）,健康者50例（对照组）,采集2组患者血清,采用酶联免疫吸附试验（ ELISA ）检测血清HSP27和HSP70水平,采用COPD评估测试量表（ CAT量表）评估COPD患者的生活质量,并对血清HSP27和HSP70水平与COPD患者肺功能及生活质量的相关性分析。结果与对照组比较,观察组患者血清 HSP27和HSP70表达明显升高[（3590．25±503．42） ng／L vs（1974．08±527．38） ng／L]和[（331.82±18．61）ng／L vs（162．73±51．52）ng／L],差异有统计学意义（P＜0．01）。采用Spearman 秩相关分析发现,血清HSP27、HSP70与FEV1呈负相关（r＝－0．674、－0．569,P＜0．05）;观察组CAT量表评分与FEV1呈负相关（ r＝－0．43, P＜0.05）;血清HSP27、HSP70水平和CAT量表评分呈正相关（r＝0．622、0．53,P＜0．05）。结论 CAT量表能有效的评价COPD患者生活质量。 HSP27和HSP70参与了COPD的炎症和氧化应激反应,在COPD急性加重患者中具有一定的诊断价值和临床意义。     

HBVX基因在HL-7702肝细胞中的表达促进细胞凋亡并上调HSP70基因的表达

目的研究乙型肝炎病毒X（HBVX）基因在肝细胞HL-7702中的稳定表达对其细胞凋亡和表达HSP70的影响,并探讨二者之间的关联。方法将已构建好的HBVX基因真核表达载体pcDNA3-X转染人肝细胞HL-7702,48h后经G418筛选出稳定表达HBVX基因的肝细胞株（L02/HBx）。RT-PCR、蛋白印迹实验鉴定L02/HBx细胞HBVX基因的稳定表达。以转染空质粒肝细胞（L02/pcDNA3）为对照,运用流式细胞分析、TUNEL分析和DNA ladder观察检测L02/HBx细胞凋亡情况。基因芯片技术筛查L02/HBx和L02/pcDNA3两组肝细胞差异表达的凋亡相关基因,并运用蛋白印迹实验技术对差异表达的HSP70基因进行蛋白水平验证。 结果RT-PCR和蛋白印迹实验显示,L02/HBx细胞中有HBVX基因mRNA和蛋白的表达。流式细胞和TUNEL分析显示,L02/HBx细胞组的凋亡率显著高于对照组L02/pcDNA3,DNA ladder可观测到L02/HBx的凋亡现象,而对照组未观测到。两次基因芯片结果筛查出L02/HBx细胞组与对照组差异表达基因HSP70,蛋白印迹实验进一步证实HSP70在L02/HBx细胞中的蛋白表达显著高于未表达X基因的肝细胞组。结论HBVX基因在肝细胞HL-7702中的表达促进了肝细胞的凋亡,上调了肝细胞中HSP70基因的表达,从而在乙型肝炎病毒致肝细胞癌变的过程中起重要作用。     

热休克蛋白27在大肠癌中的表达及其与淋巴结转移的关系

目的 探讨热休克蛋白27(HSP27)表达与大肠癌淋巴结转移的关系.方法 应用免疫组化方法检测68例临床大肠癌组织标本中Hsp27的表达情况.应用RT-PCR、Western blotting和免疫组化方法检测不同转移潜能大肠癌细胞株中Hsp27 mRNA和蛋白的表达情况.结果 在大肠癌组织中,热休克蛋白27的表达率与年龄、性别、淋巴结转移、临床分期无相关性(χ2test,P＞0.05),但其过表达和大肠癌淋巴结转移显著负相关(Fisher's exact test,P=0.035).应用RT-PCR、Western blotting和免疫组化方法检测结果显示Hsp27基因和蛋白在高淋巴结转移潜能的SW620细胞中呈低表达,在低淋巴结转移潜能的SW480细胞中呈高表达.结论 Hsp27和大肠癌肿瘤细胞的转移行为可能为负相关,可能在阻止其转移中发挥重要作用.