自体组织工程化全层皮肤缺损修复实验研究

目的 为制成含表皮细胞与成纤维细胞的双层皮肤替代物，直接用于修复全层皮肤缺损。方法 选用长枫杂交仔猪10只，酶消化法获取皮肤表皮细胞与成纤维细胞，将原代培养处于对数生长期的表皮细胞、成纤维细胞分别与30％氧化异丙烯F－127混匀成细胞悬液后，种植聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA)形成细胞－生物材料复合物，用于修复自体动物背部直径4cm全层皮肤缺损，以单纯生物材料（PGA＋氧化异丙烯）充填的创面作为对照组。修复术后1，2，4，8周取材，通过组织学和基底膜特殊染色等方法对新生组织进行评价。结果 第1周新生组织即出现表皮与真皮2层结构，特殊染色观察到连续的基底膜。第2周表皮与真皮均较前增厚。修复后第8周组织工程化皮肤的形态结构均与正常皮肤相似。对照组则无皮肤形成，仅见大量肉芽组织。结论 应用组织工程技术，以PGA 氧化层丙烯为表皮细胞、成纤维细胞载体构建的组织工程化皮肤可修复全层皮肤缺损。     

自体组织工程化皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的为制成含表皮细胞与成纤维细胞的双层皮肤替代物,直接用于修复全层皮肤缺损.方法选用长枫杂交仔猪10只,酶消化法获取皮肤表皮细胞与成纤维细胞,将原代培养处于对数生长期的表皮细胞、成纤维细胞分别与30%氧化异丙烯F-127 混匀成细胞悬液后,种植聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)形成细胞-生物材料复合物,用于修复自体动物背部直径4 cm全层皮肤缺损,以单纯生物材料(PGA+氧化异丙烯)充填的创面作为对照组.修复术后1,2,4,8周取材,通过组织学和基底膜特殊染色等方法对新生组织进行评价.结果第1周新生组织即出现表皮与真皮2层结构,特殊染色观察到连续的基底膜.第2周表皮与真皮均较前增厚.修复后第8周组织工程化皮肤的形态结构均与正常皮肤相似.对照组则无皮肤形成,仅见大量肉芽组织.结论应用组织工程技术,以PGA+氧化异丙烯为表皮细胞、成纤维细胞载体构建的组织工程化皮肤可修复全层皮肤缺损.     

含表皮细胞和成纤维细胞的复合皮构建及移植实验

目的 探讨成纤维细胞在构建复合皮中的作用，并观察复合皮对全层皮肤缺损创面的修复效果。方法 将表皮细胞与成纤维细胞种植于无细胞真皮替代物表面，于体外培养构建复合皮，观察种植成纤维细胞对表皮细胞与无细胞真皮替代物间粘附性的影响。然后将复合皮移植于裸鼠（16只）全层皮肤缺损创面，观察存活率及新生皮肤组织结构。结果 表皮细胞种植于无细胞真皮表面可形成复合皮，当种植少量成纤维细胞修饰无细胞真皮表皮面后，表皮细胞与真皮基质粘附紧密，在移植等操作过程中，表皮细胞膜片不易脱落。复合皮移植可封闭全层皮肤缺损创面，完全存活者最高达10只（62.5%)，新生皮肤基底膜结构完整，可见层粘连蛋白、Ⅳ型胶原形成。结论 以无细胞真皮替代物为载体的复合皮可修复全层皮肤缺损创面，种植成纤维细胞可增强表皮细胞的粘附性，有利于移植存活率的提高。     

组织工程化皮肤低温保存的研究进展

<正>组织工程化皮肤,是指有机体分离出来的表皮细胞或成纤维细胞在一种三维生长支架上进行体外复合培养,形成再生的表皮或真皮等同物。组织工程化皮肤作为一种皮肤创伤修复材料和损伤皮肤的替代品,不仅被覆在创伤表面、保护     

表皮细胞、成纤维细胞、毛囊同时移植修复全层皮肤缺损的实验研究

我们利用组织工程技术，在修复全层皮肤缺损时，除移植自体表皮细胞与成纤维细胞外，同时移植自体毛囊，在组织工程化皮肤中增加毛囊成分，使其与正常皮肤更加接近。     

人皮肤成纤维细胞与PGA进行组织构建的适宜接种浓度

目的 可吸收生物材料聚羟乙酸(PGA)与成纤维细胞已被证实可以应用于体外组织工程肌腱的构建,本试验旨在探讨应用人皮肤成纤维细胞与PGA在体外进行组织构建时的适宜接种浓度.方法 酶消化法获得人皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增至第2代,按照低、中、高三种浓度接种于PGA材料分别作为实验组1、2、3,传统浓度细胞接种的作为对照组,各组样本数n均为3,分别于接种后3天、1周、2周和4周进行观察和检测.结果 接种后3天实验各组无明显差异,细胞在材料上黏附伸展良好.1周和2周时,各组细胞均有明显增殖,并分泌细胞外基质(ECM extra cellular matrix),但实验组1、2的ECM不如实验组3和对照组丰富,此后该现象更为明显.至第4周时,实验组1仅形成厚薄不均的薄膜状物,其余三组均形成组织样结构,但实验组2形成的细胞--材料复合物结构略为松散.结论 应用本实验组中高浓度接种皮肤成纤维细胞在体外构建工程化组织可以达到传统所用更高浓度的接种效果,以节约细胞,减少取材.     

组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的 探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性. 方法 将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养.将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5 mL与纤维蛋白支架(0.5 mL)混合凝固构建组织工程皮肤.取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3 g,平均20.0 g,制备背部全层皮肤缺损模型.随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤.术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察. 结果 细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6 d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞.构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞.移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻.术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为(0.460 ±0.049)、(0.480 ±0.055)、(0.540 ±0.043)、(0.510 ±0.032)及(0.60 ±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P＜0.05).术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见. 结论 用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤.     

构建含血管结构的组织工程皮肤的研究

目的　探讨应用组织工程方法构建含有血管结构的组织工程皮肤。　方法　以新生儿脐带静脉和包皮作为细胞来源 ,用消化法获得血管内皮细胞、皮肤角朊细胞和成纤维细胞 ,用设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。实验组 :真皮层含有 1∶ 1的成纤维细胞和血管内皮细胞 ,在真皮表面种植角朊细胞以形成表皮 ;对照组 :真皮层只含有成纤维细胞 ,不含血管内皮细胞 ,在真皮表面种植角朊细胞以形成表皮。 HE染色和免疫组织化学染色检测第 因子抗体 ,观察两种组织工程皮肤真皮层中血管结构的形成情况。用所构建的两种组织工程皮肤修复裸鼠的全层皮肤缺损。　结果　所构建的组织工程皮肤结构完整 ,细胞状态良好 ,实验组真皮层内含有血管样结构 ,对照组未见到血管样结构。修复裸鼠全层皮肤缺损 ,肉眼观察皮肤缺损愈合 ,染色显示移植部位有大量血管长入。　结论　构建的组织工程皮肤结构完整 ,细胞状态良好 ,真皮层中形成了微血管样结构。采用所构建的组织工程皮肤成功修复了裸鼠的皮肤缺损     

同基因细胞源组织工程皮肤修复皮肤缺损的实验研究

目的利用近交系大鼠实验模型评价同基因细胞源组织工程皮肤修复大鼠全层皮肤缺损的效果,为其临床应用奠定基础。方法取近交系F344大鼠乳鼠皮肤,采用Dispase-胰蛋白酶两步消化法分离培养表皮细胞;取SD大鼠皮肤,按照高渗盐-SDS-胰蛋白酶化学处理法制备脱细胞真皮基质;依次利用浸没式培养和气液分离培养法将第2代表皮细胞与脱细胞真皮基质复合体外培养构建组织工程皮肤。取4～5周龄近交系F344大鼠36只,于大鼠背部两侧对称制备全层皮肤缺损,缺损面积为预实验确定的1.5 cm×1.5 cm。将72个创面随机分为3组(n=24),两侧移植不同修复材料:实验组移植组织工程皮肤、阴性对照组移植同种异体脱细胞真皮基质、阳性对照组移植自体全层皮肤(非原位移植)。术后行大体观察、皮片成活率、创面收缩率测量及组织学观察,评价修复效果。结果实验组术后4周创面可达到Ⅰ期愈合,与周围组织紧密连接,外观接近周围正常皮肤。术后4周,阴性对照组皮片成活率为0;实验组为62.5%(15/24),与阳性对照组91.7%(22/24)比较差异有统计学意义(χ2=5.779,P=0.016)。术后4周,实验组和阳性对照组创面收缩率显著低于阴性对照组(P<0.05),实验组与阳性对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。组织学观察示实验组术后1周有轻微炎性反应;术后2周真皮层小血管和成纤维细胞大量增生,表皮层逐渐分化成熟;术后4周时伴随新生胶原纤维沉积,移植物真皮层出现胶原改建。结论同基因细胞源组织工程皮肤能够有效修复大鼠全层皮肤缺损,在防止创面收缩和促进创面愈合等方面均可达到类似于自体全层皮肤移植的效果。     

PDGF-B基因表达在组织工程化皮肤移植后血管重建中的作用

目的构建含有血小板衍化生长因子B(PDGFB)基因的组织工程化皮肤,进行动物移植实验,研究PDGFB基因表达在真皮血管重建中的作用。方法构建PDGFB真核表达质粒,用脂质体LipofectAMINE介导转染成纤维细胞。分别构建3种不同类型的组织工程化皮肤角质形成细胞 脱细胞猪真皮基质(A组),角质形成细胞 脱细胞猪真皮基质 成纤维细胞(B组),角质形成细胞 脱细胞猪真皮基质 PDGFB基因转染的成纤维细胞(C组),分别移植于大鼠背部创面,观察术后2、4、6周真皮血管重建情况。结果术后2周C组真皮浅层内可见较多新生毛细血管长入,B组次之,A组毛细血管长入较少(P<005);术后4周各组真皮浅层内毛细血管数逐渐增加,但C组毛细血管数仍明显高于B、A两组(P<005);术后6周各组织工程化皮肤内毛细血管数差异无显著性意义。结论PDGFB基因在组织工程化皮肤移植后早期真皮血管重建中发挥了重要的作用,为移植后皮片成活提供了保障。     

Use of autologous tissue engineered skin to treat porcine full-thickness skin defects

Iinn irteiaceln ta uyteoagrrsa,ft sk iann dgra fatlilnoggr hafats e pvroelvpaedra tfiroonms th toebiosynthetic and tissue-engineered living skinreplacements.The production of bioengineered humantissues has led to fascinating diversity of medicalapplications,notably for permanent burn woundcoverage.1For a few decades,various skin substituteshave been introduced for extensive full-thickenss burnmanagement,and also provided new approaches forreconstructive surgery.2-7In addition,allografting ofcu…     

Transplantation of autologous cells and porous gelatin microcarriers to promote wound healing

Definitive treatment to achieve wound healing in major burns frequently include skin transplantation, where split-thickness skin grafts is considered gold standard. This method is associated with several drawbacks. To overcome these hurdles, efforts have been made to develop tissue engineered skin substitutes, often comprised of a combination of cells and biomaterials. In the present study, we aimed to investigate transplantation of autologous keratinocytes and fibroblasts seeded on porous gelatin microcarriers using a porcine wound model. Pre-seeded microcarriers were transplanted to a total of 168 surgical full-thickness wounds (2 cm diameter) on eight adult female pigs and covered with occlusive dressings. The experimental groups included wounds transplanted with microcarriers seeded with the combination of keratinocytes and fibroblasts, microcarriers seeded with each cell type individually, microcarriers without cells, each cell type in suspension, and NaCl control. Wounds were allowed to heal for one, two, four or eight weeks before being excised and fixated for subsequent histological and immunohistochemical analysis. In vitro, we confirmed that viable cells populate the surface and the pores of the microcarriers. In vivo, the microcarriers were to a large extent degraded after two weeks. After one week, all treatment groups, with the exception of microcarriers alone, displayed significantly thicker neo-epidermis compared to controls. After two weeks, wounds transplanted with microcarriers seeded with cells displayed significantly thicker neo-epidermis compared to controls. After four weeks there was no difference in the thickness of neo-epidermis. In conclusion, the experiments performed illustrate that autologous cells seeded on porous gelatin microcarriers stimulates the re-epithelialization of wounds. This method could be a promising candidate for skin transplantation. Future studies will focus on additional outcome parameters to evaluate long-term quality of healing following transplantation.     

New grafts for old? A review of alternatives to autologous skin.

Immediate resurfacing of skin defects is a challenging prospect, especially in patients with extensive full-thickness burns. Currently, split-thickness autografts offer the best form of wound coverage, but limited donor sites and their associated morbidity have prompted the search for alternatives. The application of allogeneic skin is restricted by availability and the risk of transmission of infection, whilst synthetic skin substitutes are simply expensive dressings. The problems of limited expansion may be overcome by culturing keratinocytes in vitro. Unlike autologous cells, allogeneic keratinocytes are available immediately, although they survive for less than a week when applied to full-thickness skin defects. Moreover, the absence of a dermal component in these grafts predisposes to instability and contracture. A cross-linked collagen and glycosaminoglycan dermal substitute, covered with thin split-skin grafts or cultured autologous keratinocytes, shows promise in burns patients. An alternative is a collagen matrix populated by allogeneic fibroblasts and overlaid with cultured autologous or allogeneic keratinocytes. The clinical application of cultured grafts remains imperfect but offers the prospect of immediate coverage and massive expansion.     

利用聚羟基乙酸构建组织工程皮肤的实验研究

目的 以聚羟基乙酸(PGA)为培养支架，用组织工程方法在体外构建双层、有活性皮肤。方法应用酶消化法分别获取人成纤维细胞(FB)和表皮角质形成细胞(KC)，体外扩增培养。接种HF与PGA上1周后，在复合物表面接种KC，共培养1周将复合物置于气-液界面继续培养。于不同时间段取材。行组织学、超微结构及免疫组织化学检测。结果接种表皮角质形成细胞在“FB-PGA”复合物表面1周后可见2～3层连续的HK在复合物上生长良好；4周时PGA已部分降解，表皮分层分化较完善，抗involucrin染色阳性，透射电镜观察可见表皮细胞分层分化良好。细胞的相邻面有桥粒连接。结论 采用组织工程技术可以在体外构建双层、有活性的人工皮肤；组织工程皮肤具有和正常皮肤相似的组织学特征及生化成分。     

用毛囊隆突细胞构建复合皮的实验观察

目的 以人毛囊隆突细胞为种子细胞体外构建组织工程复合皮，在体观察其功能性修复全层皮肤缺损的可行性。方法 胶原酶消化法体外分离培养人毛囊隆突细胞和毛乳头细胞，实验分为A、B两组。A组将毛囊隆突细胞与毛乳头细胞按1：2混合，接种于胶原包被的聚羟基乙酸纤维支架中；B组单纯接种相同数量的毛乳头细胞。而后覆盖角质形成细胞膜片，构成组织工程复合皮，移植于裸鼠全层皮肤缺损创面。观察创面愈合情况，分别于术后2、4、6周在光学显微镜下观察移植物组织学变化。结果 组织工程复合皮能够有效修复A、B两组裸鼠全层皮肤缺损。术后2周，A、B组创面均可见完整的表皮及真皮结构。术后4-6周，A组复合皮表皮层明显增厚并形成基膜的钉突，可见毛囊样结构；B组仅表皮层有所增厚但基膜平整，未见钉突和毛囊结构形成。结论 以聚羟基乙酸真皮基质为支架，用角质形成细胞、毛囊隆突细胞和毛乳头细胞共同构建的组织工程复合皮，可以有效修复裸鼠全层皮肤缺损。其中毛囊隆突细胞参与了创面解剖修复，同时可能引导组织结构和功能的修复。     

构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究

目的 探讨运用组织工程方法构建含有黑色素细胞的组织工程皮肤。方法 以包皮组织作为细胞来源，采用消化法获得角朊细胞、成纤维细胞和黑色素细胞，在自行设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。行Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测构建的皮肤中黑色素细胞的分布和状态。结果 构建的组织工程皮肤结构完整，细胞状态良好，Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测均显示含有大量黑色素细胞并处于良好状态。结论 构建了含黑色素细胞的组织工程皮肤，可用于下一步的动物实验和临床实验。     

Autologous keratinocytes cultured on benzylester hyaluronic acid membranes in the treatment of chronic full-thickness ulcers

Keratinocytes were obtained from three patients with chronic full-thickness ulcers of different aetiologies. The cells were isolated, cultured and then seeded on to a membrane composed of benzylester hyaluronic acid. Once the keratinocytes had become subconfluent, the keratinocyte-containing matrix sheets were then applied as autologous grafts to the patients' ulcers. Results indicate that autologous grafting of keratinocytes cultured on benzylester hyaluronic acid membranes provides improved graft handling, reduces total time required for tissue cultivation and enhances cellular vitality because of the possibility of grafting at a subconfluent non-differentiated stage.     

In vivo cultured skin composed of two-layer collagen sponges with preconfluent cells.

Although various kinds of cultured skin substitutes have been developed, it takes several weeks to produce them before grafting. In their previous study, the authors succeeded in producing cultured skin easily in a short period of time by layering two collagen sponges. In the current study, to shorten this period even further, they grafted the cell-preconfluent artificial skin immediately after seeding the cells. They used two collagen sponges with different pore sizes and crosslink densities. They seeded 1,000,000 cells per square centimeter of fibroblasts and 1,000,000 cells per square centimeter of keratinocytes on the respective collagen sponges and grafted them on a full-thickness, excised wound on the back of severe combined immunodeficient mice. Two weeks after grafting, epithelium and dermislike tissue were formed. They then decreased the number of keratinocytes and grafted them. Four weeks after grafting, at seeding densities of 50,000 to 1,000,000 cells per square centimeter of keratinocytes, the preconfluent artificial skin took histologically, and human type IV and type VII collagen were stained immunohistochemically. This cell-preconfluent artificial skin composed of two-layer collagen sponges seems promising for widespread clinical use.