腺病毒载体在肝细胞肝癌基因治疗中的应用

腺病毒载体因其独持的优势,在肝细胞肝癌(HCC)基因治疗的研究中应用广泛。HCC基因治疗包括自杀基因、免疫基因、抑癌基因、反义基因和多基困联合治疗等。本文就腺病毒载体的结构、特点、构建、在HCC的基因治疗中的应用和存在的问题及解决方法作一综述。     

人骨形成蛋白－2重组腺病毒表达载体的构建

目的：构建人骨形成蛋白－2（MBP－2）基因的重组腺病毒表达载体,为应用BMP－2基因治疗的研究奠定基础,方法：首先构建携带BMP－2基因的腺病毒穿梭质粒pAdCMV-BMP-2在脂质体介导下,与腺病毒基因组质粒pJM17共转染293细胞,经同源热处理 组获得重组腺病毒Ad-BMP-2结果：经限制性酶切和PCR扩增鉴定,证实为复制缺陷型BMP－2重组腺病毒,结论：成功构建了BMP－2腺病毒表达载体。     

以肝脏为靶器官的基因治疗时重组腺病毒引起的急性肝炎

目的 研究腺病毒为载体的基因治疗时淋巴细胞在肝组织免疫反应中的作用,探讨免疫抑制疗法在腺病毒载体基因治疗中的可行性。方法 取8只恒河猴,经不同路径输入携带大肠杆菌lacZ基因或荧火虫荧光素酶基因luc的重组腺病毒6只。其中4只进行免疫抑制治疗。将含lacZ的质粒DNA注入2只动物作为对照。用免疫组织化学法检测β2－MG、HAL－DR、CD3、CD4、CD8及CD20。结果 腺病毒介导的基因治疗时肝脏的β2－MG、HLA－DR、CD3、CD4及CD8阳性细胞明显增多。腺病毒载体和转基因均与肝损害有关,表现为一过性,呈轻、中度无黄疸性肝炎。免疫抑制的动物只要处于免疫抑制状态下就没有肝炎的表现,基因表达的时间延长。质粒介导的基因转导效果差,无肝损害及免疫反应。所有动物B淋巴细胞抗原CD20始终阴性。结论 腺病毒介导的基因治疗时肝脏的β2－MG、HLA－DR、CD3、CD4及CD8阳性细胞明显增多,造成轻、中度一过性肝损害。使用免疫抑制药物可避免肝损害的发生并延长基因表达的时间。     

病毒载体介导的帕金森病基因治疗研究进展

帕金森病 (PD)是一种常见的神经系统变性疾病 ,其病理改变主要为中脑黑质致密区多巴胺能神经元变性和消失 ,以及体内多巴胺水平的下降。 80年代末 ,随着基因治疗概念的不断深入 ,基因治疗技术日趋成熟 ,人们开始了对PD基因治疗的尝试。近年来PD动物模型基因治疗已经取得了不少进展。在基因治疗的体外及体内两种途径中 ,研究最多的是病毒载体相关的基因导入系统。目前研究较多病毒载体有 :腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、其他逆转录病毒载体。　　一、病毒载体的制备　　用于基因治疗的病毒载体应具备以下条…     

腺病毒载体与肺癌的基因治疗

腺病毒是近年来开发出来的新型病毒载体系统，具有容量大，易于纯化，安全性高，应用范围广泛等优点。应用腺病毒介导多种肿瘤相关基因对肺癌进行基因治疗已有几例临床试验报道。这种新的治疗肺癌的方法，在某些方面优于化疗，放疗，手术等传统治疗方法。这一划时代技术向临床的引进，可能使肺癌的治疗产生革命性的变化。     

腺病毒载体与肺癌的基因治疗

腺病毒是近年来开发出来的新型病毒载体系统,具有容量大、易于纯化、安全性高、应用范围广泛等优点。应用腺病毒介导多种肿瘤相关基因对肺癌进行基因治疗已有几例临床试验报道。这种新的治疗肺癌的方法,在某些方面优于化疗、放疗、手术等传统治疗方法。这一划时代技术向临床的引进,可能使肺癌的治疗产生革命性的变化。     

介导野生型p53基因转移的重组腺病毒的构建研究

应用同源重组方法成功地构建了携带野生型ｐ５３基因的复制缺陷型重组腺病毒，通过光镜、电镜、酶切、ＰＣＲ共扩增等方法证实了构建载体的正确性，并使常规的同源重组方法进一步改进，简化了载体构建的操作程序，结果准确，成功率高。本结果可用于以腺病毒为载体进行肿瘤、心血管疾病等基因治疗的研究。     

腺病毒载体在小鼠肝脏的分布及其表达规律研究

目的研究腺病毒载体介导的β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因在小鼠肝脏的分布及表达情况,评价腺病毒载体作为基因治疗转导系统的有效性及安全性,为进一步的目的基因导入及表达奠定基础。方法将Balb/cJ小鼠随机分为正常组及暴发性肝炎组,给小鼠经尾静脉注射2×108PFU腺病毒,收集24h、48h、72h、96h、120h和第7天小鼠血清,检测谷丙转氨酶和总胆红素,同时取肝脏、肺脏、心脏、肾脏标本进行X-gal染色,以观察腺病毒载体在各脏器的表达情况。取MHV-3诱导的暴发性肝炎组小鼠24h、48h、72h、96h肝脏,检测腺病毒载体在肝脏的表达情况。结果腺病毒载体主要在小鼠肝脏表达,并于72小时表达最高,在正常小鼠及暴发性肝炎小鼠肝脏中表达效率分别约55.7%和25.7%,之后逐渐消减;正常组小鼠注射腺病毒载体后,肝功能无明显变化。结论腺病毒载体介导的报告基因可在肝脏高效表达且未见明显的肝损害,可作为基因治疗中安全有效的基因传递系统用于治疗肝脏疾病。     

腺病毒介导CD基因对人胰腺癌细胞株的体外杀伤作用

目的　探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因 (CD)对人胰腺癌细胞株体外杀伤作用。方法　构建含CD基因的腺病毒穿梭载体 pAdTrack CMV CD与骨架载体 pAdEasy 1,在细菌内重组为pAd CD ,经 2 93细胞包装、扩增 ,氯化铯密度梯度离心制备纯化高效的含绿色荧光蛋白 (GFP)的CD腺病毒 ,体外转染人胰腺癌细胞株Patu 8988、SW 1990 ,并给予前药 5 氟胞嘧啶 (5 FC) ,观察其体外杀伤效果。结果　含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确。包装纯化后 ,检测病毒滴度为 2× 10 11PFU/ml,将重组腺病毒转染胰腺癌细胞株Patu 8988、SW 1990后 ,可见 5 FC对转染CD基因的Patu 8988、SW 1990细胞及混育细胞有明显毒性作用 ,而对未导入CD基因的人胰腺癌细胞毒性较低。结论　体外腺病毒介导CD基因 ,不仅转染效果强 ,而且可直接或通过旁观者效应以杀伤胰腺癌细胞 ,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法     

基因治疗动脉粥样硬化及高脂血症的研究现状

基因治疗的基本原理和作法是 ,将编码具有某种生物活性的物质 (一般是蛋白质或肽 )的基因用某种载体 (消除了感染性的腺病毒或其他病毒、脂质体、或人体细胞 )人为地转移到人体器官或组织细胞内 ,使其在局部表达该活性物质 ,从而达到相应的治疗或预防目的。这种疗法已在某些遗传性疾病 ,特别是单基因异常造成的遗传性疾病的治疗中取得了成功。但将基因疗法用于治疗动脉粥样硬化和高脂血症尚处于研究阶段。大量的动物实验和很少量的临床试验已表明 ,基因疗法对动脉粥样硬化和高脂血症的治疗有着极大的潜力和广阔的前景。因而广大临床医师也十…     

以骨骼肌为靶组织的基因治疗研究进展

以骨骼肌为靶组织的基因治疗具有操作简便、安全、易于在临床上推广等特点。通过质粒DNA载体、腺病毒和逆转录病毒载体的介导，已获得肌性和非肌性蛋白的稳定表达，不仅适用于感染性疾病的多核苷酸免疫接种及遗传性肌病、血浆蛋白缺乏症等单基因疾病的防治研究，也为包括动脉粥样硬化在内的多基因疾病的治疗开辟了一个新的途径。     

KAI1复制缺陷型腺病毒载体抑制人胰腺癌细胞迁移实验研究

目的 构建携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体并初步研究其对体外肿瘤细胞迁移的影响。方法 用Ad—EasyTM系统大肠杆菌中同源重组的方法，构建Ad—KAI1腺病毒载体，并在293细胞中包装、扩增和纯化，用其感染人胰腺癌细胞并检测KAI1的表达。结果 构建的Ad—KAI1可以高效感染人胰腺癌细胞系PANCl，并检测到感染Ad-KAI1的PANCl细胞中KAI1的高表达；同时观察到Ad-KAI1可以抑制胰腺癌细胞系PANCl的迁移。结论 携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体可抑制人胰腺癌细胞转移，为KAI1抗胰腺癌转移基因治疗提供依据。     

基因治疗进展及其在心血管疾病中的应用

随着分子生物学理论和技术的进展,特别是在载体的构建、靶基因的界定和活体内基因转移技术等方面所取得的重要进展,使许多因基因结构或表达异常引起的心血管疾病利用基因治疗可获得根治。自1992年人类首次成功地应用低密度脂蛋白受体基因治疗家族性高胆固醇血症,揭开了心血管疾病基因治疗的序幕,近十年时间内,心血管疾病基因治疗取得了一系列令人瞩目的成就。本文就基因治疗方法学及其在心血管领域的应用进展作一综述。1　基因治疗方法学及进展1.1　基因治疗的概念:基因治疗指将正常和野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中,以补充缺失基…     

腺病毒载体在呼吸系统疾病基因治疗中的应用

腺病毒载体因具有高滴度、转染效率高、可转染至非分裂期及分裂期细胞、给药途径多等优点,广泛应用于疾病的基因治疗。呼吸系统疾病是一类严重影响人类生命健康的疾病,近年来关于呼吸系统疾病基因治疗的研究引起了国内外学者的关注。现对腺病毒载体在呼吸系统疾病基因治疗中的应用作一综述。     

以肝脏为靶器官的基因治疗时重组腺病毒引起的急性肝炎

目的 确定以肝脏为靶器官的基因治疗时急性肝炎的机制。方法 用HE法和免疫组织化学法对8只恒河猴通过不同径路接受以腺病毒或Lipofectamine为载体的基因治疗时的免疫反应进行了研究。结果 经静脉或胆管注入除去E1,携带lacZ基因的腺病毒后1至3周发生了轻到中度急性肝炎。有病变的肝脏内CD3^ ,CD4^ 和CD8^ T细胞明显增多而B细胞缺如。肝细胞表面β2-MG和HLA－DR也增多。免疫抑制治疗使急性肝炎和伴随的免疫反应延迟。结论 腺病毒介导的基因治疗时肝脏的免疫反应是T细胞介导的,主要受Ⅰ型MHC限制。腺病毒载体和转基因均与肝损害有关。肝脏损害呈轻、中度,是可逆的。免疫抑制药物可延迟免疫性肝损害的发生并延长基因表达的时间。     

第三讲 肝病的基因治疗

基因治疗是指把目的基因导入细胞内 ,并通过调控目的基因表达 ,抑制、替代或补偿缺陷基因 ,从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能 ,达到疾病治疗目的的一种方法。近十年来 ,从动物模型的研究到临床试验 ,肝病的基因治疗取得了很大的进展。本文试对目前肝病基因治疗的方法与策略、基本概念和想法作一概述。一、肝病基因治疗的方法(一 )基因转移方法　基因转移方法分为物理、化学和生物学三大类。生物学方法主要指病毒介导的基因转移 ,包括逆转录病毒 (ＲＶ)、腺病毒 (ＡＶ)、腺病毒相关病毒 (ＡＡＶ)、ＳＶ4 0、单纯疱疹病毒 (ＨＳＶ)和细…     

KAI1 复制缺陷型腺病毒载体抑制人胰腺癌细胞迁移实验研究

目的 构建携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体并初步研究其对体外肿瘤细胞迁移的影响.方法 用Ad-EasyTM系统大肠杆菌中同源重组的方法,构建Ad-KAI1腺病毒载体,并在293细胞中包装、扩增和纯化,用其感染人胰腺癌细胞并检测KAI1的表达.结果 构建的Ad-KAI1可以高效感染人胰腺癌细胞系PANC1,并检测到感染Ad-KAI1的PANC1细胞中KAI1的高表达;同时观察到Ad-KAI1可以抑制胰腺癌细胞系PANC1的迁移.结论 携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体可抑制人胰腺癌细胞转移,为KAI1抗胰腺癌转移基因治疗提供依据.     

慢病毒载体及其在基因治疗中的研究进展

基因治疗作为一种相对理想、高效、特异的治疗手段,已成为目前生命科学领域最重要的研究之一.如何选择一个合适的基因转移载体,是基因治疗的一个重要方面.目前,病毒载体的应用非常广泛.包括反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等.本文拟就慢病毒载体系统及其在基因治疗中的应用和研究进展作一综述.     

厌氧菌作为实体瘤基因治疗载体的研究进展

实体瘤内存在低氧代谢区，故可利用趋低氧的厌氧菌作为肿瘤基因治疗的载体。厌氧菌作为基因治疗的载体，具有肿瘤靶向性强、安全性高等特点，是一种新型的基因治疗载体。当厌氧菌携带具有治疗作用的目的基因时，可有效的抑制实体瘤细胞的生长。现综述双歧杆菌、乳酸杆菌和梭状芽孢等厌氧菌作为肿瘤基因治疗载体的研究进展。     

野生型p^53基因导入对培养的兔血管平滑肌细胞生长的抑制作用

为探索腺病毒载体重组野生型ｐ５３基因转染平滑肌细胞的效率及其应用于动脉粥样硬化和动脉再狭窄的基因治疗的可能性，构建了野生型ｐ５３基因的生长缺陷型重组腺病毒载体。在体外培养条件下转染兔血管平滑肌细胞。应用生化染色法、免疫组化法及聚合酶链技术等检测了外源基因的转染效率及表达效果。应用细胞计数及同位素参入技术测定了ｐ５３基因对平滑肌细胞的抑制效果。流式细胞仪检测了平滑肌细胞。结果显示：腺病毒载体可快速有效地将外源基因转导进入平滑肌细胞，在转染细胞内可检测到外源性ｐ５３ｃＤＮＡ，并可高效表达ｐ５３蛋白。ｐ５３重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制细胞生长，细胞计数减少，ＤＮＡ合成减少，并可导致细胞死亡。流式细胞仪检测有部分细胞体积缩小，ＤＮＡ减少。结果提示，野生型ｐ５３基因重组腺病毒载体转染平滑肌细胞可有效抑制细胞生长，有可能成为动脉粥样硬化和再狭窄的基因治疗手段。