构建含人血管内皮细胞生长因子121腺病毒表达载体的体外表达实验

目的:构建携带人血管内皮细胞生长因子121cDNA的腺病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子基因治疗缺血性疾患的可行性。方法:实验于2003-05/2004-02于解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室(创伤烧伤复合伤国家重点实验室)完成。穿梭质粒pDC315和Ad5腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre由解放军第三军医大学免疫学教研室邹强博士惠赠。pUC18-血管内皮细胞生长因子由第三军医大学高原医学教研室惠赠。BamHI,XbaI,NcoIDNA限制性内切酶均购自Takara公司;鼠抗人血管内皮细胞生长因子121单克隆抗体购自ROCHE公司;用双酶切法将pUC18-人血管内皮细胞生长因子121质粒中的人血管内皮细胞生长因子121cDNA克隆到穿梭质粒pDC315中,与腺病毒质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre共同转染293细胞并反复扩增,构建携带目的基因的重组腺病毒,并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NTH3T3细胞,用免疫组化方法检测人血管内皮细胞生长因子121在NTH3T3细胞中的表达。结果:①重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121的鉴定:重组质粒经XbaI和NcoI酶切后,得到酶切片段长度为651bp的正向连接重组质粒。测序结果也证实作者重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121序列正确。②Ad-血管内皮细胞生长因子重组腺病毒构建及滴度测定:pDC315-人血管内皮细胞生长因子121重组质粒和pBHGloxdeltaE1,3Cre质粒共转染293细胞后7d,部分293细胞出现CPE,10d后出现CPE的细胞明显增多,约2周时绝大多数细胞出现CPE,而对照组未转染质粒的细胞未见CPE现象。最终重组腺病毒Ad-人血管内皮细胞生长因子121滴度为1.0×1010～4.3×1011PFU/mL。③血管内皮细胞生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达:重组腺病毒转染NIH3T3细胞48h后行细胞免疫组织化学染色,结果显示细胞人血管内皮细胞生长因子121染色阳性,阳性染色主要位于细胞浆中,而未转染病毒的细胞染色极弱。结论:构建的携带人血管内皮细胞生长因子121基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗。     

以红色及绿色荧光蛋白为标记基因的血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2真核表达载体的构建及其在293-T细胞中的共表达

背景：血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白具有协同促进血管生成的作用。 目的：构建在真核细胞中表达人血管内皮生长因子165的红色荧光蛋白表达载体和携带人骨形态发生蛋白2的绿色荧光蛋白表达载体，共转染真核细胞以研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2日在293-T细胞内的表达和定位。 设计：随机对照实验。 单位：解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室。 材料：实验于2002-09/2004-03在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室完成。pCDNA3.1（＋）/骨形态发生蛋白2由美国UCLA大学Dr.Bostrom惠赠；pDsRed1-N1由Professor Roger Y.Tsien,University of Califormia,San Diego,USA惠赠。pUC18/血管内皮细胞生长因子165，293-T cells由本实验室保存。 方法：根据已知的人血管内皮生长因子165序列，设计在目的片段两端分别携带酶切位点的两条引物，用聚合酶链反应从质粒pUC18/血管内皮生长因子165中扩增出去除终止密码子的人血管内皮生长因子165片段，定向克隆至含报告基因的质粒pDsRed1-N1中，构建重组质粒pDsVEGF165Red1-N1；同时，构建pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白表达载体。以DOTAP为介导，将重组质粒共转染293-T细胞，48h后用激光共聚焦显微镜检测报告基因红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白的表达，使用反转录聚合酶链反应及免疫印迹方法检测血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内表达。 主要观察指标：质粒的酶切鉴定及重组质粒在293-T细胞中mRNA及蛋白水平的表达。 结果：重组质粒经酶切，聚合酶链反应和DNA序列测定证明构建正确，目的基因在293-T细胞中在mRNA及蛋白水平获得表达，激光共聚焦显微镜观察到红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白在细胞中共定位的情况。 结论：成功构建pDsVEGF165Red1-N1和pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白2种含报告基因的真核表达载体，两者共转染后能在真核细胞中表达，为研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内的相互作用提供了一个重要而方便的工具。     

重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达

目的：制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞，观察过氧化氢酶表达水平。方法：将过氧化氢酶cDNA亚克隆至pShuttle-CMV中，将其和pAdEasy-1在细菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-Cat，再转染Ad-293细胞，包装成重组腺病毒颗粒；经纯化获取重组腺病毒AdCat。转染血管平滑肌细胞，Westem blot鉴定细胞中过氧化氢酶表达。结果：正确构建了重组腺病毒载体，获得高滴度重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞后过氧化氢酶高表达。结论：重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达，为用过氧化氢酶基因进行再狭窄的防治打下了基础。     

重组腺病毒载体pDC316-hIL-24的构建及病毒滴度测定

目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达hIL-24基因的重组腺病毒载体（pDC316-hIL-24）,获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体（pDC315-hIL-24）的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。      

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与质粒pBHGE3共转染293细胞获取重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,PCR鉴定构建的重组腺病毒。扩增、浓缩纯化重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应构建重组质粒PDC315-VEGF,酶切分析和测序证明构建正确。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,PCR扩增421bpVEGF165片段,证实VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/mL。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒,为动物试验奠定基础。     

人瘢痕疙瘩成纤维细胞中P53蛋白对血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的：观察人瘢痕疙瘩成纤维细胞中的P53蛋白对血管内皮细胞生长因子表达的影响作用。 方法：实验于2005-05／11在哈尔滨医科大学第二临床医学院实验室完成。成纤维细胞来源哈尔滨医科大学附属第二医院整形美容激光中心收治的烧伤患者的瘢痕疙瘩组织（临床病理证实）。将瘢痕疙瘩切成1mm&;#215;1mm组织块，用含体积分数为0．2的胎牛血清的1640培养液，置于37℃，体积分数为0．05的CO2条件下培养，取3-6代细胞。采用腺病毒介导法将野生型p53基因转染至人瘢痕疙瘩成纤维细胞中，非转染细胞为对照组。应用间接免疫荧光法和western blott法检测P53蛋白；应用酶联免疫吸附法检测血管内皮细胞生长因子表达。 结果：①间接免疫荧光法检测P53蛋白：P53蛋白表达在细胞核内，转染组和非转染组细胞中均有P53蛋白表达，转染组细胞内P53蛋白表达明显高于非转染组细胞。②Westem blot法检测P53蛋白：转染组和非转染组细胞中均有P53蛋白表达，但非转染组细胞内P53蛋白表达量很少；转染组细胞在转染48h后，细胞中P53蛋白表达量高；明显高于非转染组细胞。③酶联免疫吸附法测定血管内皮细胞生长因子：转染组和非转染组细胞中均检测出血管内皮细胞生长因子表达，但转染组细胞血管内皮细胞生长因子表达显著低于非转染组细胞（P〈0．01）。 结论：P53蛋白能够明显抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞血管内皮细胞生长因子表达。     

以红色及绿色荧光蛋白为标记基因的血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2真核表达载体的构建及其在293-T细胞中的共表达

背景:血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白具有协同促进血管生成的作用。目的:构建在真核细胞中表达人血管内皮生长因子165的红色荧光蛋白表达载体和携带人骨形态发生蛋白2的绿色荧光蛋白表达载体,共转染真核细胞以研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在293-T细胞内的表达和定位。设计:随机对照实验。单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室。材料:实验于2002-09/2004-03在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室完成。pCDNA3.1( )/骨形态发生蛋白2由美国UCLA大学Dr.Bostrom惠赠;pDsRed1-N1由ProfessorRogerY.Tsien,UniversityofCalifornia,SanDiego,USA惠赠。pUC18/血管内皮细胞生长因子165,293-Tcells由本实验室保存。方法:根据已知的人血管内皮生长因子165序列,设计在目的片段两端分别携带酶切位点的两条引物,用聚合酶链反应从质粒pUC18/血管内皮生长因子165中扩增出去除终止密码子的人血管内皮生长因子165片段,定向克隆至含报告基因的质粒pDsRed1-N1中,构建重组质粒pDsVEGF165Red1-N1;同时,构建pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白表达载体。以DOTAP为介导,将重组质粒共转染293-T细胞,48h后用激光共聚焦显微镜检测报告基因红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白的表达,使用反转录聚合酶链反应及免疫印迹方法检测血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内表达。主要观察指标:质粒的酶切鉴定及重组质粒在293-T细胞中mRNA及蛋白水平的表达。结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应和DNA序列测定证明构建正确,目的基因在293-T细胞中在mRNA及蛋白水平获得表达。激光共聚焦显微镜观察到红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白在细胞内共定位的情况。结论:成功构建pDsVEGF165Red1-N1和pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白2种含报告基因的真核表达载体,两者共转染后能在真核细胞中表达,为研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内的相互作用提供了一个重要而方便的工具。     

人胰岛素样生长因子腺病毒表达载体构建及其在C17．2神经干细胞的表达

目的：构建人胰岛素样生长因子腺病毒表达载体、并观察其在C17．2神经干细胞的表达。方法：实验于2004-03／11在中山大学附属第二医院林百欣医学中心完成。将胰岛素样生长因子克隆人复制缺陷性腺病毒穿梭质粒得到含胰岛素样生长因子的腺病毒穿梭质粒，再与腺病毒骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组得到含胰岛素样生长因子的整合质粒，在HEK293A细胞中包装加膜，聚合酶链反应鉴定，大量扩增病毒。将含目的基因的病毒转染C17．2神经干细胞，原位杂交检测胰岛素样生长因子mRNA，蛋白印迹检测胰岛素样生长因子蛋白的表达，酶联免疫吸附实验检测胰岛素样生长因子蛋白的表达曲线：结果：经酶切鉴定及聚合酶链反应鉴定证实腺病毒载体构建正确。原位杂交检测到胰岛素样生长因子mRNA，蛋白印迹分析检测到胰岛素样生长因子蛋白在转染了重组腺病毒的C17．2神经干细胞内表达。酶联免疫吸附实验结果显示胰岛素样生长因子蛋白在病毒转染5～7d达高峰，13d仍高于转染前。结论：成功构建了含胰岛素样生长因子的重组腺病毒载体．转染了该腺病毒的C17．2神经干细胞可稳定表达胰岛素样生长因子。     

血管内皮生长因子表达载体的构建及在内皮祖细胞中的表达

背景：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有很强的促进血管生成作用，但构建其真核表达质粒是否可转染缸管内皮祖细胞并完整表达还不清楚。目的：构建VEGF表达载体，并观察其在内皮祖细胞中的表达情况。设计、时间及地点：观察性试验，于2007-12／2008-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心实验室完成。材料：质粒PDC315-VEGFl65自备，质粒pIRES2-EGFP由美国国立卫生研究院Stanko Stojilkovic教授惠赠。方法：运用DNA重组技术构建VEGF表达载体pIRES2-EGFP-VEGF，应用脂质体包裹的方法将载体转染猪外周血血管内皮祖细胞。主要观察指标：采用荧光显微镜观察VEGF在内皮祖细胞内的表达，反转录．聚合酶链反应法检测VEGFmRNA表达水平，ELISA检测VEGF165蛋白表达情况。结果：成功构建VEGF真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF。转染重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF后，在内皮祖细胞内有VEGF的表达，VEGFmRNA和VEGF165蛋白表达水平均明显增加。结论：VEGF表达载体转染猪外周血血管内皮祖细胞后能有效增加VEGF基因的表达，能够获得较高水平的VEGF蛋白。