铜绿假单胞菌LasⅠ基因反义核酸载体的构建及生物学作用研究

目的 构建LasⅠ基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasⅠantisense,转化入铜绿假单胞菌并分析其生物学作用.方法 PCR扩增LasⅠ基因序列,反向克隆法构建LasⅠ基因的反义核酸原核表达载体pUCP18/lasⅠantisense,并转化铜绿假单胞菌.通过检测转化菌的LasB和LasR基因表达,测定外毒素的活性和绿脓菌素的表达等指标,分析pUCP18/lasⅠantisense的生物学作用.结果 成功构建pUCP18/lasⅠantisense并转化铜绿假单胞菌,且有效表达,转化菌的毒力因子弹性蛋白酶、外毒素和绿脓菌素表达水平均降低.结论 pUCP18/lasⅠantisense可以降低铜绿假单胞菌毒力因子表达,提示LasⅠ基因可作为医院内铜绿假单胞菌感染治疗的一个新的靶点.     

铜绿假单胞菌耐药基因及毒力因子分布特征分析

目的:了解我院铜绿假单胞菌毒力因子及耐药基因分布情况,为临床合理选用抗菌药物提供依据。方法:采用ROCHE COBAS E601电化学发光分析仪检测疑似细菌性感染病人降钙素原(PCT)水平,PCT显著升高病人且微生物送检标本单纯检出的12株铜绿假单胞菌为研究对象;采用PCR方法对毒力因子(tox A、exo U、exo S、exo T、Pvoein protein、nor A、las B)及耐药基因(TEM、SHV、PER、VEB1、OXA-10、Amp C、0pr D、KPC)表达情况进行分析;结果:12株铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药率为91.7%(11/12),毒力因子阳性率最高者为Tox A和exo T(91.7%),耐药基因阳性率最高者为Amp C和Opr D(91.7%)。结论:铜绿假单胞菌毒力因子Tox A、exo T及耐药基因Amp C和Opr D携带率较高,不同菌株间耐药特征差异明显,在疑似铜绿假单胞菌感染病人时应依据抗菌药物敏感试验结果针对性选择抗生素,特别对于无菌部分分离的铜绿假单胞菌。     

RON基因反义核酸真核表达载体的构建策略

目的 构建RON基因跨膜区段(RONm)的反义核酸真核表达载体。方法 用RT-PCR技术，从人肺癌细胞提取的总RNA克隆RONm eDNA序列。然后酶切鉴定与测序分析得到RONm的T载体，再将RONm反向插入peDNA3．1 中，酶切鉴定得到RONm反义真核表达载体。结果 用RT-PCR亚克隆RONm，测序结果与GenBank的RONm相应序列(X70040)一致，阅读框无改变。构建出正确的RONm反义真核表达载体。结论 成功构建RONm反义核酸真核表达载体，为进一步将RON基因反义核酸作为一种肺癌基因治疗方法的研究打下了分子生物学基础。     

neu基因反义表达载体的构建及小鼠乳癌细胞株转染

ｎｅｕ基因反义表达载体的构建及小鼠乳癌细胞株转染郝新保，张盈华，惠宏襄，梁国栋（唐都医院中心实验室，生物化学教研室）关键词ｎｅｕ基因；反义核酸；表达载体中图法分类号Ｒ７３９．９ｎｅｕ基因所编码的膜表面蛋白Ｐ１８５在哺乳动物的乳癌发生和演进中具有重要意...     

密度感知信号系统在铜绿假单胞菌致大鼠肺部感染中的作用

【论文特点介绍】本实验比较了PAO1和PAO—JP2的弹性蛋白酶活性、外毒素A的含量，结果显示：PAO—JP2株显示了弹性蛋白酶活性、外毒素A表达的完全缺失。结合体内实验结果，证实了密度感知信号系统通过控制铜绿假单孢菌细胞外重要毒性因子，如弹性蛋白酶活性、外毒素A的表达，在铜绿假单孢菌致病作用中扮演重要的角色。使用特定合成的AI或QS抑制剂，来达到抑制铜绿假单孢菌毒性因子的表达，减低其致病作用，是颇有前景的一种抗菌疗法。     

反义核酸的研究及其应用

对反义核酸的概念、作用机制及反义核酸类药物必需符合的条件等有关分子生物学研究进展进行了综述。介绍了几种人工合成的反义核酸及其应用前景,并就研究中需要解决的问题做了探讨。     

铜绿假单胞菌mexA基因原核表达载体的构建

目的 构建mexA基因的原核载体,为进一步表达MexA蛋白奠定基础.方法 从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexAl基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再以PUC/mexA1质粒为模板PCR扩增mexA目的 基因,克隆至质粒pQE30中,构建表达质粒pQE30/mexA,构建的表达质粒pQE30/mexA转化大肠杆菌M15,培养后提取纯化重组质粒pQE30/mexA酶切鉴定.结果 获得长约1.5 kbPCR mexA1产物,酶切结果显示所构建的重组质粒PUC/mexA1已成功地克隆了mexA1(1.5 kb)基因,序列分析结果与PA01/mexA1序列相同,构建的表达质粒pQE30/mexA酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因mexA(1.2 kb)片段相符.结论 含mexA(1.2 kb)基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达MexA蛋白奠定了基础.     

针对HBV－X基因的反义核酸体外抗病毒作用

针对ＨＢＶ－Ｘ基因的反义核酸体外抗病毒作用冯志华，周永兴，姚志强，陈勇，焦建中，李光玉（第四军医大学唐都医院传染病科西安７１００３８）关键词反义核酸，ＨＢＶ－Ｘ基因，基因治疗中图号Ｒ５１２．６２ＨＢＶ－Ｘ基因的表达产物ＨＢｘＡｇ具有反义激活功能．Ａｒ...     

Survivin反义核酸真核表达载体的构建及在胶质瘤细胞中的表达

目的构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并检测其在恶性胶质瘤细胞SHG-44中的表达。方法构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并用脂质体介导转染入SHG-44细胞,通过RT-PCR及western blot检测细胞中survivin mRNA和蛋白的表达。结果构建了survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SWas,并成功导入SHG-44细胞中,且有效表达,使SHG-44细胞中survivin mRNA和蛋白表达水平均降低。结论Survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-sVVas可以降低SHG-44细胞survivin基因的表达。     

密度感知信号系统在体内铜绿假单孢菌感染中的作用机制

铜绿假单孢菌是一种机会致病菌，可以导致很多种类型的感染。细胞一密度一依赖信号传递的机制被称为密度感知机制，在角膜、肺部、烧伤的感染发病机制中起重要作用。此外，密度感知信号系统与铜绿假单孢菌形成的生物被膜关系密切。已有初步的证据密度感知信号系统可能通过控制细菌毒性因子的产生或者调节宿主免疫系统来发挥其效应。     

铜绿假单胞菌lasR基因反义肽核酸序列筛选及其抑制生物被膜形成的研究

目的 筛选靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸序列,探讨其对铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力的影响.方法 针对铜绿假单胞菌lasR基因设计4条反义寡核苷酸序列,利用斑点杂交筛选出与lasR基因结合最佳的反义寡核苷酸序列,以此合成与穿膜肽连接的肽-肽核酸序列.分别用不同浓度的肽-肽核酸导入铜绿假单胞菌生物被膜模式菌PAO1中,测定不同时相点细菌生长光密度[D(600)]值并进行菌落计数,观察肽-肽核酸对其生长的抑制作用.利用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜形成情况.qPCR方法检测lasR mRNA表达.结果 斑点杂交实验结果显示:4条反义寡核苷酸序列中3条有杂交信号产生,其中第1条序列信号最强,以此为基础合成反义肽核酸.不同浓度的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌表现出不同程度的体外抗菌活性,且随着浓度增加,抗菌活性增强.结论 有效筛选出高效反义核苷酸序列,经筛选出的靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸对铜绿假单胞菌的生长及生物被膜形成能力有明显抑制作用,同时抑制lasR mRNA的表达.     

医院内铜绿假单胞菌耐药基因分布特点的研究

目的分析山东省两所三级甲等医院铜绿假单胞菌药物敏感性以及耐药基因分布特点。方法采用ATB系统进行细菌分离鉴定及药物敏感试验;聚合酶链反应检测三类耐药基因分布情况。结果 A医院菌株对哌拉西林-他唑巴坦和亚胺培南耐药性较高,B医院菌株对阿米卡星和妥布霉素耐药性较高。两所医院铜绿假单胞菌aac(3)-Ⅱa、ac(6′)-Ⅰa、ac(6′)-Ⅱ和parC耐药基因检出率差异有显著性(χ2=7.57~10.27,P<0.05);oprD2耐药基因缺失率均较高,差异无显著性(P>0.05)。黏液型和非黏液型菌株耐药基因检出率差异无显著性(P>0.05)。结论不同医院铜绿假单胞菌临床分离菌株均表现出多重耐药,但其耐药基因分布以及耐药情况有所不同。     

铜绿假单胞菌适应性及毒力相关基因分析

铜绿假单胞菌（PA）是一种常见的医院内获得性感染致病菌,其能在人群中引起大范围的感染与它的适应性和根据环境条件调节关键致病基因表达的能力有关。本文从基因调节水平,就PA适应性及毒力相关的调节基因作一综述。     

反义人PCNA基因真核表达载体pDR－PCNA的构建及鉴定

反义人ＰＣＮＡ基因真核表达载体ｐＤＲ－ＰＣＮＡ的构建及鉴定戴林，张学庸，惠宏襄，赵永同，王成济（西安西京医院消化内科西安７１００３３西安生物化学教研室）关键词ＰＣＮＡ基因；反义核酸；真核细胞；表达载体中图号Ｑ５２７．５增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）是ＤＮ...     

铜绿假单胞菌毒力基因与耐药性关系分析

目的:了解临床分离铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒力基因exoT、exoY、exoS和exoU的携带情况及其与细菌耐药性的关系。方法:收集上海市奉贤区中心医院2016年4月-2018年4月临床样本中非重复分离的157株铜绿假单胞菌,使用Phoenix 100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药敏试验,PCR检测毒力基因exoS、exoU、exoT和exoY,并分析不同毒力基因型组合与细菌耐药性的关系。结果:157株铜绿假单胞菌中,携带exoT、exoY、exoS和exoU基因的阳性率分别为100.00%(157/157)、95.54%(150/157)、70.06%(110/157)和28.03%(44/157)。共检测出6种毒力基因型组合,以exoT+/exoY+/exoS+/exoU-(68.79%,108/157)和exoT+/exoY+/exoS-/exoU+(25.48%,40/157)为主。多重耐药菌株以exoT+/exoY+/exoS+/exoU-型为主,耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌以exoT+/exoY+/exoS-/exoU+型为主。exoT+/exoY+/exoS-/exoU+型菌株对亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率高于exoT+/exoY+/exoS+/exoU-型菌株。结论:exoT和exoY基因普遍存在于铜绿假单胞菌中,不同毒力基因型组合与铜绿假单胞对常用抗菌药物的耐药率密切相关。?     

反义核酸抑制RON基因表达对A549的体外作用

目的探讨针对人RON基因跨膜区段(RONm)反义核酸对肺癌细胞系A549活性和细胞增殖的抑制作用,研究以RONm为靶的肺癌基因治疗的可能性?方法将人RONm cDNA反向插入到真核表达载体pcDNA3.1中,转染肺癌细胞A549,利用ELISA检测细胞模型RON基因表达水平,同时利用MTT和细胞计数方法监测细胞生物学活性的变化.结果转染后的肺癌细胞RON基因表达量和细胞活性明显降低,并出现明显的细胞凋亡?结论RONm反义核酸明显抑制RON基因的表达,同时对肺癌细胞的生长有抑制作用,促进细胞凋亡?     

乙肝病毒X基因反义核酸抑制HLA─I表达的研究

乙肝病毒Ｘ基因反义核酸抑制ＨＬＡ┐Ｉ表达的研究冯志华周永兴姚志强陈从新张文彬（第四军医大学唐都医院传染病科西安７１００３８）关键词乙型肝炎病毒反义核酸ＨＢＶ－Ｘ基因ＨＬＡ－Ｉ中图号Ｒ３７３．２１主要组织相容性抗原（在人类称ＨＬＡ）中Ｉ类抗原很少或不表...     

Stathmin基因反义核酸对人成骨肉瘤细胞系的生长抑制作用

目的　探讨 Stathmin基因的反义核酸 (AS- ODN)对人成骨肉瘤细胞系的生长抑制作用 ,并观察与化疗药物合用后的协同作用 .方法　以高表达 Stathm in的人成骨肉瘤细胞系 SOSP- 96 0 7为靶细胞、反义 Stathmin(AS- ODN)为阻断剂 ,通过 MTT试验观察 AS- ODN对成骨肉瘤细胞的生长抑制作用及与紫杉醇 (PTX)的协同作用 ,流式细胞仪分析细胞增殖周期的影响 .结果　 AS- ODN及 AS- ODN与 PTX联合应用均明显抑制成骨肉瘤细胞的生长 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1) .SOSP- 96 0 7在 AS- ODN作用下 ,细胞分裂阻滞在分裂期的中期 ,并诱导细胞发生凋亡 .结论　 Stathmin基因的反义核酸(AS- ODN)对成骨肉瘤细胞的生长可能起十分重要的作用 ,它有望成为成骨肉瘤治疗的新靶点 ,与抗癌药联合应用有协同作用