上皮性卵巢癌组织中miR-126、EGFL7的表达与微血管密度的检测

目的:研究miR-126、类表皮生长因子域7(EGFL7)在上皮性卵巢癌组织中的表达情况及与微血管密度(MVD)的关系。方法:采用qRT-PCR法检测21例正常卵巢组织(正常组)、23例良性卵巢肿瘤组织(良性组)及45例上皮性卵巢癌组织(恶性组)中miR-126、EGFL7 mRNA表达水平,采用免疫组化法检测3种组织中EGFL7蛋白表达情况及MVD。结果:miR-126 mRNA在恶性组中表达水平低于正常组、良性组(H=43.611,P<0.001);恶性组EGFL7蛋白阳性表达率、MVD高于良性组及正常组(χ2=33.629,F=262.292,P均<0.001)。miR-126、EGFL7mRNA表达及MVD均与上皮性卵巢癌FIGO分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。上皮性卵巢癌组织中miR-126与EGFL7、MVD呈负相关(r=-0.413、-0.909,P<0.05),EGFL7与MVD呈正相关(r=0.362,P=0.015)。结论:miR-126、EGFL7可能与上皮性卵巢癌的发生发展、侵袭转移过程有关。     

microRNA-126对VEGF介导血管生成的调控作用

目的 研究microRNA-126(miR-126)对血管内皮细胞生长发育的影响,探寻miR-126可能参与的血管生成过程.方法 常规培养脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs).构建miR-126过表达载体并转染HUVECs;实验分为:正常细胞组,空载慢病毒转染组,miR-126过表达慢病毒转染组(n=6);于转染第6天后用qRT-PCR检测内皮生长负性调节因子spred1、Pik3R2的mRNA表达水平,Westem blot检测spred1、Pik3 R2的蛋白表达水平.结果 转染第6天后,对qRT-PCR及Western blot检测结果进行分析,过表达组中spread1、Pik3R2的2(-△△Ct)值较其余两组低;过表达组中spred1/GAPDH和Pik3 R2/GAPDH值也均小于其余两组,差异具有统计学意义(P＜0.05).spred1、Pik3R2的mRNA表达水平明显下调,其蛋白表达水平也明显降低.结论 miR-126能促进VEGF的内皮细胞增殖及血管生成作用.     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的构建人CD40的真核表达载体,建立持续﹑稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后,再克隆到真核表达载体pCDNA3.1中,构建重组质粒pCDNA3.1( )/CD40,并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304,G418筛选转染的细胞。RT-PCR﹑Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果经酶切鉴定,重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实,重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达,流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95%。结论成功构建了真核表达载体pCDNA3.1( )/CD40,并建立了高表达CD40的ECV-304,为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础。     

RNAi技术沉默PTHrP基因的表达诱导软骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 研究甲状旁腺相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对软骨肉瘤细胞增殖的影响.方法 本实验设置空白对照组、空质粒组和siPTHrP转染组,每组样本数均为6.空白对照组不做处理;分别将空质粒pSilencer3.1 H1 neo(空质粒组)和重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP(siPTHrP转染组)转染至SW1353软骨肉瘤细胞株,通过MTT法检测各组细胞活力并绘制细胞生长曲线,利用流式细胞技术测定细胞凋亡率,半定量RT-PCR和Western blotting法检测PTHrP基因在mRNA水平及蛋白水平表达上的变化.结果 siPTHrP转染组的细胞生长较空白对照组软骨肉瘤细胞明显缓慢;siPTHrP转染组细胞凋亡率明显升高;重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP能明显抑制软骨肉瘤细胞的PTHrP基因在mRNA转录水平和蛋白水平上的表达.结论 重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP可明显抑制软骨肉瘤细胞增殖及其内源基因PTHrP在mRNA转录水平和蛋白水平的表达,为PTHrP介导的软骨肉瘤基因沉默疗法提供了理论基础.     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的 构建人CD40的真核表达载体，建立持续、稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法 将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后，再克隆到真核表达载体pCDNA3．1中，构建重组质粒pCDNA3．1（＋）／CD40，并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304，G418筛选转染的细胞。RT-PCR、Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果 经酶切鉴定，重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实，重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达，流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95％。结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3．1（＋）／CD40．并建立了高表达CD40的ECV-304，为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础.     

CASK下调表达对人血管内皮细胞ECV-304增殖能力的影响

目的 建立CASK下调表达细胞株,研究钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium,calmodulin-associated serine/threonine kinase,CASK)下调表达对ECV-304细胞增殖能力的影响.方法 将包含针对CASK基因干扰siRNA片段的pGenesil-1-hCASK重组质粒转染人ECV-304细胞株,经G418加压筛选,成功筛选出CASK下调表达的细胞株.用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中CASK基因的表达水平.采用流式细胞技术、MTT法观察CASK下调表达对ECV-304细胞增殖能力的变化.结果 成功筛选出CASK下调表达ECV-304细胞株(siCASK细胞株),这些细胞在传代过程中绿色荧光蛋白能维持表达,细胞株中转染阳性率在90%以上;经蛋白免疫印迹法检测CASK表达明显降低;siCASK细胞株中G0/G1细胞比率下降,G2M期细胞比率明显上升,增殖指数明显提高,生长曲线左移.结论 成功建立了CASK下调表达的ECV-304细胞株,CASK下调表达可导致细胞增殖能力增强.     

系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞miR-126及宿主基因EGFL7DNA甲基化状态分析

目的: 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者CD4⁺T细胞miR-126宿主基因EGFL7的甲基化水平对miR-126表达的调控。方法: 采用实时qPCR检测SLE患者CD4⁺T细胞miR-126及EGFL7 mRNA表达水平;亚硫酸氢钠基因组测序法检测EGFL7基因启动子区甲基化状态。结果: miR-126及其宿主基因EGFL7在SLE患者CD4⁺T细胞表达上调(P<0.01),EGFL7 mRNA表达水平与miR-126的表达呈正相关(r=0.538,P=0.015)。miR-126是一个内含子miRNA,位于宿主基因EGFL7基因座第7个内含子中,其自身的基因序列中包含29个CpG位点。但该区域甲基化水平在SLE患者CD4⁺T细胞和正常对照组间差异无统计学意义(P=0.907)。而SLE患者CD4⁺T细胞中EGFL7基因启动子区甲基化水平显著降低(P<0.05)。结论: SLE患者CD4⁺T细胞miR-126宿主基因EGFL7启动子区甲基化状态调控宿主基因本身及其miR-126的表达。     

靶向人EGFL7基因的短发夹结构RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响

目的 研究类表皮生长因子域7(EGFL7)基因特异性短发夹结构RNA(shRNA)对胶质母细胞瘤细胞系U251细胞体外增殖的影响。方法 在筛选出人EGFL7基因的有效RNA干扰靶序列并设计构建其重组慢病毒表达载体的基础上,感染胶质母细胞瘤细胞系U251细胞,荧光显微镜观察转染效率,实时荧光定量多聚酶链反应和蛋白质印迹分别检测EGFL7基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测其增殖能力。结果 EGFL7基因的特异性shRNA转染U251细胞后,EGFL7的mRNA和蛋白表达水平明显降低;细胞的增殖受到明显抑制。结论 EGFL7基因的特异性shRNA可明显抑制胶质母细胞瘤细胞系U251的增殖,提示EGFL7基因在胶质母细胞瘤细胞的增殖中发挥重要作用。     

人VIGILIN的shRNA真核表达质粒的构建及其对肝癌细胞周期影响的初探

目的构建靶向人高密度脂蛋白结合蛋白(VIGILIN)的shRNA真核表达载体,并初步探索VIGILIN与人肝癌细胞系HepG2细胞周期是否有关联。方法构建人VIGILIN的shRNA重组质粒,并将重组质粒pSIREN-VIG转染HepG2细胞,采用RT-PCR和Western-blot检测HepG2细胞VIGILIN mRNA和蛋白的表达,并用流式细胞术检测细胞周期是否有所改变。结果1HepG2细胞转染pSIREN-VIG后,VIGILIN的表达被特异、有效地抑制。转染48h后,VIGILIN的表达从mRNA和蛋白的水平都有明显的减少;2VIGILIN表达抑制后,G2/M期细胞所占比例增加:相对于三个对照组(未转染组2.4%,脂质体转染组4.9%和转染pSIREN-GFP组6.5%),实验组(转染pSIREN-VIG组)G2/M期细胞增加到9.4%。结论我们成功的构建了能特异、有效的抑制人VIGILIN表达的shRNA表达质粒,人VIGILIN能够影响到细胞周期的正常运行,导致G2/M期阻滞。     

重组腺病毒Ad-ES对人脐静脉内皮细胞的体外抑制作用

目的 构建携带人内皮抑素(ES)的重组腺病毒Ad-ES,体外感染人脐静脉内皮细胞ECV-304,观察抑制作用.方法 以Pshuttle-ES质粒为模板PCR扩增ES基因片断,利用AdEasy-1系统及AAV293细胞构建并包装出Ad-ES,感染ECV-304细胞,病毒感染48 h后,Western blot检测ES蛋白表达,流式细胞术及DNA ladder检测ECV-304细胞凋亡情况,绘制细胞生长曲线.结果 ECV-304细胞在感染Ad-ES后生长受到抑制,感染3 d后出现细胞凋亡.结论 重组腺病毒Ad-ES在体外可抑制ECV-304细胞的生长并诱导其凋亡.     

miR-126-3p.1通过SLC7A5调控间变性甲状腺癌细胞糖酵解的作用机制

目的 探讨miR-126-3p.1对间变性甲状腺癌(ATC)细胞糖酵解的作用,并分析其潜在的机制。方法 通过TCGA数据库检索miR-126-3p.1在甲状腺癌中的表达及与甲状腺癌诊断、预后的关系。运用荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)实验检测人正常甲状腺细胞Htori-3、人间变性甲状腺癌细胞SW1736、人乳头瘤状甲状腺癌细胞TPC-1中miR-126-3p.1、溶质运载家族7成员5(SLC7A5)的表达;将TPC-1细胞分为agomiRNA(转染agomiRNA)组、agomiR-126-3p.1(转染agomiR-126-3p.1)组、si-NC(转染si-NC)组、si-SLC7A5(转染si-SLC7A5)组、agomiR-126-3p.1+pcDNA(共转染agomiR-126-3p.1和pcDNA)组、agomiR-126-3p.1+pcDNA-SLC7A5(共转染agomiR-126-3p.1和pcDNA-SLC7A5)组,各组细胞用脂质体法转染至SW1736细胞。细胞计数试剂(CCK8)、5-溴-2-脱氧尿嘧啶(EdU)法检测细胞增殖能力;ELISA法检...     

低温缺氧条件下脂质体介导的寡核苷酸对人脐静脉内皮细胞-304的转染

目的 研究在Euro-Collins溶液(ECs)中,低温(4 ℃)缺氧条件下体内阳离子脂质体转染剂(In vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)在人脐静脉内皮细胞株ECV-304中的转染效率。方法 (1) 将ECV-304在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中以37 ℃、5% CO₂的条件培养,待生长至单层融合后,进行试验。(2) 使用前配制脂质体-ODN复合物,脂质体与ODN 的+/-电荷比率为2。(3) 应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在ECs中、4 ℃条件下,ODN浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25 μmol/L时,缺氧保存2、4、6、8 h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照组,观察对ECV-304的转染效率。结果 在ECs中、4 ℃缺氧保存条件下,随着保存时间的延长和脂质体-ODN浓度的升高,ECV-304的MFI增强,保存6 h后MFI基本达到了最大强度,并且大部分ODN均位于细胞核内;而ODN的细胞摄取率无差异。但与裸转染相比,MFI和细胞摄取率均有显著差异性。结论 在ECs中和低温缺氧条件下,脂质体可以高效地将NF-κB decoy ODN转染到ECV-304细胞核,为供体器官在基因调控水平的保护研究提供了实验依据。     

低温缺氧条件下脂质体介导的寡核苷酸对人脐静脉内皮细胞-304的转染

目的 研究在Euro-Collins溶液(ECs)中，低温(4℃)缺氧条件下体内阳离子脂质体转染剂(In vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)在人脐静脉内皮细胞株ECV-304中的转染效率。方法 (1)将ECV-304在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中以37℃、5％CO2的条件培养，待生长至单层融合后，进行试验。(2)使用前配制脂质体-ODN复合物，脂质体与ODN的 ／-电荷比率为2。(3)应用荧光显微镜和流式细胞仪，观察在ECs中、4℃条件下，ODN浓度分别为0．50、0．75、1．00、1．25μmol/L时，缺氧保存2、4、6、8h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和ODN的胞内分布；同时设立裸ODN转染为对照组，观察对ECV-304的转染效率。结果 在ECs中、4℃缺氧保存条件下．随着保存时间的延长和脂质体-ODN浓度的升高，ECV-304的MFI增强，保存6h后MFI基本达到了最大强度，并且大部分ODN均位于细胞核内；而ODN的细胞摄取率无差异。但与裸转染相比，MFI和细胞摄取率均有显著差异性。结论 在ECs中和低温缺氧条件下，脂质体可以高效地将NF-κB decoy ODN转染到ECV-304细胞核，为供体器官在基因调控水平的保护研究提供了实验依据。     

巨噬细胞对血管内皮细胞增殖、Hoxb2、血管内皮生长因子受体和整合素ανβ3表达的影响

目的 建立人巨噬细胞系U937与人脐静脉血管内皮细胞系ECV-304体外共培养模型,以刀豆蛋白A(ConA)作为U937激活剂,研究巨噬细胞调节血管生成的机制。方法 实验分4组:ECV-304、ConA+ECV-304、U937+ECV-304和ConA+U937+ECV-304。将ECV-304细胞接种,待60%融合时按照不同的分组进行共培养48h后,流式细胞仪检测细胞周期的变化;采用3H-TdR掺入试验检测内皮细胞DNA合成变化;RT-PCR技术检测内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR和同源盒(homebox)Hoxb2基因mRNA表达水平的变化;免疫荧光在流式细胞仪上检测整合素受体ανβ3表达的变化。结果 ConA激活的U937细胞可使内皮细胞S期、DNA合成明显增加(P<0.01);ConA刺激的U937细胞使内皮细胞VEGF受体KDR(0.879±0.003)、Hoxb2基因mRNA的表达水平(0.947±0.003)和整合素受体ανβ3的表达水平(10.26±1.73)明显上调(P<0.01)。结论 ConA活化的巨噬细胞可通过影响内皮细胞的细胞周期、DNA合成、VEGF受体KDR、Hoxb2及整合素受体ανβ3的表达来促进内皮细胞的增殖、迁移及与基质的黏附,从而调节血管的生成。     

hSulf-1基因腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖、迁移能力的影响

目的 构建携带人硫酸酯酶1基因(hSulf-1)的腺病毒载体,研究其对于人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖、迁移能力的影响。方法 通过基因操作技术将hSulf-1基因插入到腺病毒基因组中,构建重组腺病毒Ad5-hSulf1;应用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1蛋白在ECV-304细胞中的表达及细胞内磷酸化Akt、ERK的表达变化;MTT实验检测hSulf-1过表达对于ECV-304细胞增殖的影响;采用划痕实验研究hSulf-1过表达对于ECV-304细胞迁移的影响。结果 成功构建携带目的基因hSulf-1的腺病毒载体;免疫印迹结果表明hSulf1基因过表达会下调ECV-304细胞Akt和ERK信号分子的磷酸化水平;细胞增殖实验结果表明hSulf1基因过表达抑制了ECV-304细胞增殖,感染复数为50、100时细胞存活率下降至(68.49±0.05)%以及(67.78±0.06)%(P<0.05);划痕实验结果表明hSulf1基因过表达能够抑制细胞的迁移,相比于对照组细胞迁移能力减弱(P<0.01)。结论 重组腺病毒Ad5-hSulf1介导的hSulf-1基因在ECV-304细胞中的过表达明显抑制细胞增殖及迁移,为hSulf-1用于肿瘤及血管生长相关疾病的基因治疗奠定了基础。     

巨噬细胞对血管内皮细胞增殖、Hoxb2、血管内皮生长因子受体和整合素αvβ3表达的影响

OBJECTIVE: To explore the mechanism by which macrophages regulate angiogenesis by co-culturing human umbilical vein endothelial cells (ECV-304) with human macrophage cells (U937) stimulated by concanavalin A (ConA). METHODS: Monolayer ECV-304 cells growing to 60% confluence were co-cultured with 1 x 10(5)/ml U937 cells in the presence or absence of ConA (ConA+U937+ECV-304 and U937+ECV-304 groups, respectively), with non-treated and ConA-treated ECV-304 cells serving as the control groups (ECV-304 and ConA+ECV-304 groups, respectively). Forty-eight h later, U937 cells were removed from the cell co-culture for examining changes in DNA synthesis of ECV-304 cells with (3)H-TdR incorporation assay and for cell cycle analysis with flow cytometry. RT-PCR was employed to assess the influence of macrophages stimulated by ConA on the expression of the target genes. With immunofluorescent method, the changes in the expression of integrin receptor alphavbeta3 of ECV-304 were determined. RESULTS: A significant increase in S-phase ECV-304 cells with enhanced DNA synthesis was observed after co-culture of the cells with ConA-stimulated U937 cells (P<0.01), which also resulted in significant up-regulation of the expressions of KDR mRNA (0.879+/-0.003), Hoxb2 mRNA (0.947+/-0.003) and integrin receptor alphavbeta3 (10.26+/-1.73). CONCLUSION: Macrophages can accelerate the proliferation, migration and adhesion of the vascular endothelial cells to the basilar membrane matrix by affecting their cell cycle, DNA synthesis, expression of KDR mRNA, Hoxb2 mRNA and integrin alphavbeta3, so as to modulate the angiogenetic process of the latter cells.     

血管内皮细胞氧化应激损伤对骨髓间质干细胞趋化作用的体外观察

目的 探讨氧化应激损伤血管内皮细胞定向趋化人骨髓间质干细胞(hMSC)的可能性.方法 体外分离和培养hMSC,分别加入不同条件培养基进行成脂肪细胞、成骨细胞和成血管内皮细胞诱导分化;以免疫组织化学染色和流式细胞仪检测hMSC抗原表达.利用人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞建立氧化应激损伤趋化hMSC的细胞模型:在Transwell培养板下腔接种5×105 ECV-304细胞并用3%H2O2(终浓度为0.01 ml/ml)处理1 h后,上腔内接种1×105 hMSC,为损伤细胞+hMSC组;同时设未损伤细胞+hMSC组(Transwell板下腔接种未经H2O2处理的ECV-304细胞,上腔内接种hMSC)和单纯hMSC组(Transwell板下腔不接种ECV-304细胞)作为对照.培养12 h后苏木精染色,倒置相差显微镜下计数各组细胞Transwell上腔迁移的hMSC数.另以酶联免疫吸附试验检测H2O2处理1 h的ECV-304细胞(H2O2处理组)和未予H2O2处理ECV-304细胞(对照组)培养上清液中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)浓度.结果 hMSC经加入不同条件培养基诱导后可以分化为脂肪细胞、成骨细胞和血管内皮细胞.免疫组织化学染色和流式细胞仪检测显示hMSC CD29、CD44、CD90和CD106抗原呈阳性表达,CD31、CD34、CD45和CD49b抗原呈阴性表达.损伤细胞+hMSC组发生迁移的hMSC数为(8.00±0.22)个/高倍视野,明显高于未损伤细胞+hMSC组[(0.20±0.05)个/高倍视野,P<0.01]和单纯hMSC组[(0.00±0.00)个/高倍视野,P<0.01].H2O2处理组细胞培养上清液中MCP-1和VCAM-1浓度分别为(69.2±3.5)、(114.0±7.5)ng/ml,均明显高于对照组[(62.5±3.6)ng/ml,P<0.05;(97.2±5.0)ng/ml,P<0.01].结论 血管内皮细胞氧化应激损伤可趋化hMSC定向迁移到损伤血管,其机制可能与氧化应激损伤导致的趋化因子MCP-1和VCAM-1浓度升高有关.