哺乳动物细胞表面展示全长类风湿关节炎抗体库的构建

目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源类风湿关节炎抗体库。方法分离类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体全长轻链基因和重链可变区基因,分别插入哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOPO-10,分别构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库,然后将抗体轻链、重链基因库联合转染293T细胞,用流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达。结果成功构建了类风湿关节炎患者来源的IgG1-Kappa型抗体基因库,随机挑选单克隆经DNA序列分析显示轻链库、重链库的序列正确率分别为80%和60%,可表达的抗体库多样性为6.13×1010。结论类风湿关节炎抗体基因库转染293T细胞后能够在细胞表面表达全长人源抗体,所展示的抗体库具有良好的多样性,能够为下一步筛选特异性抗体奠定基础。     

快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库

目的快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法分离外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区(VH)和全长Kappa型轻链(LCκ)基因库,分别插入载体pDGB-HC-TM,化学转化感受态大肠杆菌DH5α,构建抗体的轻、重链基因库,然后将其联合转染CHO细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在CHO细胞表面的表达。结果构建的非特异性IgG1-Kappa抗体基因库,重链库容量达2.6×105,轻链库容量达2.0×105,理论库容量高达5.2×1010。随机从重链库和轻链库各挑选10个克隆送测序,重链10个克隆的DNA序列分析显示8个含有正确的阅读框架,轻链10个克隆的DNA序列分析显示全部含有正确的阅读框架。流式细胞仪分析显示来自轻链库的10个克隆、重链库的8个克隆均可检测到抗体在CHO细胞表面的表达。用所构建的轻重链抗体库共转染CHO细胞,流式细胞仪分析可检测到抗体在细胞表面的表达,阳性细胞比例达到31.5%,说明所构建的抗体库能够在CHO细胞表面成功展示全长抗体。结论采用本研究建立的哺乳动物细胞展示技术,可在2周内成功构建库容量大且多样性好的全人源抗体基因库,用于高亲和力特异性抗体的筛选。     

系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析

目的构建系统性红斑狼疮(SLE)儿童个体特异性哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法采集SLE确诊患儿外周血,分离外周血淋巴细胞,提取外周血淋巴细胞总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因、构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库,将抗体基因库转染293T细胞,流式细胞仪分析抗体在293T细胞表面的表达。结果以0.8μg总RNA为模板,用6套引物成功扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,构建获得的重链基因库容量为9.4×104,轻链基因库容量为8.4×104。随机挑选的10个重链克隆有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,10个轻链克隆7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析挑选的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在293T细胞表面的表达,理论上抗体库中可表达的抗体多样性可以达到109。结论以0.8μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建SLE儿童特异性全长人抗体基因库,并在293T细胞表面成功展示SLE儿童个体抗体库中的全长抗体,为进一步研究SLE儿童自身抗体的特点及自身抗体在SLE发病机制中的作用及临床应用打下良好基础。     

采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源膀胱癌特异性抗体基因库

目的构建大容量且能高效展示于哺乳动物细胞表面的全长人源膀胱癌特异性抗体基因库。方法分离膀胱癌患者的外周血单核细胞（PBMC）,提取PBMC的总RNA,用RT-PCR方法扩增全套IgG1重链可变区（VH）和Kappa型轻链全长（LCκ）基因,经过相应的限制性内切酶酶切后分别插入pDGB-HC-TM载体,分别构建膀胱癌特异性的抗体重链基因库和轻链基因库（一级抗体库）。随机挑取20个单克隆测定抗体基因序列,并瞬时转染FCHO细胞,结合流式细胞仪检测细胞表面抗体的表达。将上述构建好的轻重链基因库通过4片段连接方法插入双表达载体pDGB4,构建二级抗体库,转染FCHO后用流式细胞仪检测细胞表面抗体表达。结果分别成功构建了膀胱癌特异性的重链基因库和轻链基因库,随机挑取的轻重链单克隆各有7个和9个含有正确的抗体基因编码序列,且能展示于哺乳动物细胞表面,理论库容量达到3.32×10¹¹[（1.7×10⁶×70%）×（3.1×10⁵×90%）]。成功构建了膀胱癌二级抗体库,库容量为9×10⁵。结论利用哺乳动物细胞表面展示技术,我们成功构建了膀胱癌特异性的全长人源抗体基因库,一级抗体库的库容量达到3.32×10¹¹,二级抗体库库容量达到9×10⁵,为下一步筛选特异性、高亲和力抗膀胱癌抗体奠定了基础。     

应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库

目的应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库。方法采集登革确诊患者恢复期外周血,分离外周血淋巴细胞并提取其总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库;将抗体基因库转染CHO细胞、用流式细胞仪分析抗体在CHO细胞表面的表达。结果以1.2μg总RNA为模板,用6套引物扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,轻链基因库容量为1.45×104,重链基因库容量为1.8×105;随机挑选的10个轻链克隆和10个重链克隆,经过测序鉴定,轻链有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,重链有7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析含有正确阅读框架的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达,抗体库中可表达的抗体多样性达到109。结论以1.2μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建可表达库容量达到109的登革病毒特异性全长人抗体基因库。     

应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库

目的应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库。方法采集登革确诊患者恢复期外周
血,分离外周血淋巴细胞并提取其总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链（LCκ）和重链可变区（VH）基因,构建抗体轻链基因
库和抗体重链基因库;将抗体基因库转染CHO细胞、用流式细胞仪分析抗体在CHO细胞表面的表达。结果以1.2 μg总RNA
为模板,用6 套引物扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,轻链基因库容量为1.45×104,重链基因库容量为
1.8×105;随机挑选的10个轻链克隆和10个重链克隆,经过测序鉴定,轻链有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序
列,重链有7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析含有正确阅读框架的单克隆和抗体基因库,
均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达,抗体库中可表达的抗体多样性达到109。结论以1.2 μg 总RNA为模板,通过
RT-PCR扩增,成功构建可表达库容量达到109的登革病毒特异性全长人抗体基因库。
     

抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株（克隆号：2F5）中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。     

鼠-人嵌合抗粘蛋白1 IgG1全抗体的构建及其功能初步分析

目的获得鼠-人嵌合抗粘蛋白1(mucin1,MUC1)IgG全抗体,降低鼠源抗MUC1单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)的异种免疫原性,并在哺乳动物细胞中表达制备,初步分析其特性。方法 PCR扩增鼠mAb-6E3可变区编码基因,通过特异性限制性酶切位点克隆入含有人源IgG1抗体恒定区的哺乳动物细胞重组表达载体,获得IgG全抗体表达质粒,瞬时转染293T哺乳动物细胞,直接免疫荧光法确定细胞内人源IgG抗体表达,收获转染细胞培养上清,经亲和层析纯化后,经SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot、流式细胞仪检测和表面等离子共振技术等分析所制备IgG抗体分子特点及其与MUC1抗原的结合活性及动力学参数。结果所构建鼠-人嵌合IgG表达质粒能够在哺乳动物细胞中有效表达并分泌到细胞上清,纯化后蛋白质电泳分析与预期IgG抗体分子大小一致,能够与变性或天然状态下的T47D肿瘤细胞表面MUC1特异性结合,经表面等离子共振技术分析表明抗体的亲和力约为KD=2.8×10-7M。结论获得鼠-人嵌合抗MUC1 IgG抗体,具有与MUC1特异性结合的生物学活性。     

人源化Fab段噬菌体抗体库的构建

目的构建人源化Fab噬菌体抗体基因库。方法利用反转录PCR和PCR技术从B细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞中扩增人IgG抗体重链Fd基因及κ、λ轻链基因,将之克隆入噬菌体载体pComb3,构建人源性Fab噬菌体抗体库,并进行鉴定。结果构建完成了库容量为6.0×108的噬菌体抗体库。结论成功地构建了人源化噬菌体抗体库,为下一步抗CD20抗体的筛选和表达奠定了基础。     

抗DR5单链抗体的构建与表达

目的:构建抗DR5单链抗体的真核表达载体,以实现真核表达。方法:RT-PCR法从分泌抗DR5抗体的杂交瘤细胞中合成第一链cDNA,用通用引物钓取单克隆抗体的轻、重链可变区基因。经测序和BLAST比对,证实为一株新的鼠源性抗体基因。利用overlapping PCR方法构建单链抗体真核表达载体pCMV-express-scFv,Lipofectamine2000法转染宿主细胞293T,72 h后ELISA法检测细胞培养上清,检测抗体表达。结果:经序列鉴定和BLAST比对证实克隆的抗体轻、重链可变区基因为新鼠源抗体基因。ELISA实验结果显示抗体有效表达在细胞培养上清中。结论:成功得到抗体轻、重链可变区基因,实现了抗DR5单链抗体的真核表达,为进一步的研究和开发奠定了基础。     

干细胞与肿瘤干细胞

目的了解干细胞、肿瘤干细胞和恶性肿瘤关系的研究进展。方法复习国内外相关文献,综述肿瘤干细胞与干细胞的关系、肿瘤干细胞与恶性肿瘤发生发展的关系、研究现状、前景及存在的问题。结果正常干细胞和肿瘤干细胞之间存在很强的相似性,其中淋巴造血系统恶性肿瘤和少数实体瘤干细胞分离鉴定的成功有力支持了肿瘤干细胞理论。结论肿瘤干细胞理论可解释很多恶性肿瘤的生物学行为,但目前仍迫切需要相关分离、纯化、鉴定实体瘤干细胞的思路和方法。     

ACAT-1在单核细胞向泡沫细胞分化过程中的表达变化

目的研究单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中脂酰CoA胆固醇酯酰转移酶-1(ACAT-1)表达及活性的变化。方法复苏、培养人单核细胞株THP-1细胞,与乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)、PMA+氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育1～4 d,RT-PCR方法检测单核细胞分化过程中ACAT-1 mRNA表达,Westernblotting检测ACAT-1蛋白表达的变化。结果(1)单核细胞复苏后加入PMA诱导48 h后,分化为巨噬细胞。经PMA+ox-LDL诱导24 h后分化为泡沫细胞。(2)与无血清培养单核细胞对照组比较,在PMA诱导单核细胞株THP-1向巨噬细胞分化过程中,ACAT-1 mRNA、蛋白表达及酶活性水平明显增高(P<0.05),呈时间依赖效应。(3)巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中,ACAT-1 mRNA、蛋白表达及酶活性水平增高,呈时间依赖效应。但和无血清培养巨噬细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论单核细胞株THP-1经PMA,PMA/ox-LDL诱导后,可分化为巨噬细胞、泡沫细胞。ACAT-1的表达及活性增高在单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中起着重要作用。     

miR-622抑制肺癌细胞的生长

目的探讨miR-622对H460肺癌细胞增殖的影响及其作用机制。方法利用脂质体瞬时转染方法将miR-622模拟物及其对照核苷酸转染至肺癌细胞内。miRNA定量试剂盒检测miR-622的表达。CCK-8试剂盒检测细胞增殖。生物信息学分析miR-622的靶点。蛋白印迹方法检测K-Ras蛋白的表达。构建含K-Ras mRNA的3'非翻译区的报告基因载体,检测萤火虫/Renilla荧光素酶活性。结果转染miR-622模拟物可提高miR-622的表达,并使H460和16HBE-T的细胞增殖率分别降至(58.60±4.27)%和(65.17±4.67)%,P均<0.01。生物信息学分析K-Ras为miR-622的一潜在靶点。转染miR-622模拟物可明显抑制K-Ras蛋白的表达。共转染miR-622模拟物和K-Ras-3'UTR报告基因,可使萤火虫/Renilla荧光素酶的活性降低至(60.22±2.50)%。结论 miR-622可通过负性调控靶点K-Ras抑制肺癌细胞的增殖。     

肝星状细胞和胰腺星状细胞的比较

肝星状细胞和胰腺星状细胞在各自纤维化疾病中都发挥着重要作用,两者在诸多方面存在相似之处。文章就两者的生物学特性、凋亡、信号转导通路方面进行总结和比较,以探讨它们之间的关系。     

肝星状细胞和胰腺星状细胞的比较

肝星状细胞和胰腺星状细胞在各自纤维化疾病中都发挥着重要作用,两者在诸多方面存在相似之处.文章就两者的生物学特性、凋亡、信号转导通路方面进行总结和比较,以探讨它们之间的关系.     

Lingual squamous cell carcinoma surrounded by granular cell tumor

The granular cell tumor (GCT) is an uncommon, benign lesion with a preference for subcutaneous sites. In the head and neck, the tongue is the most common site, followed by the larynx. We experienced a case of a 27-year-old woman with lingual squamous cell carcinoma (SCC) surrounded by GCT. The pathological findings established that the lesion was SCC covered by GCT in the midline of the tongue. The size of the mass was very small, however, so we excised it in a diamond shape. There is an interesting association between GCTs and other malignant neoplasms. However, no causal relationship between GCT and these other carcinomas has been established. Here we report on an SCC coexisting with GCT at the same site as a median tongue lesion and review the literature.     

Huge clear cell squamous cell carcinoma of the head

To the editor:An 85-year-old woman,presented with a macula in the front region of parietal bone one year ago,which was slightly protruding from the epidermis without pain and pruritus.After scratching,ulceration and the scope was increasing gradually.A month ago,the tumor was about walnut size,and now about egg size,accompanied with bleeding when knocked,without special feeling.Apart from this,the patient has been suffering from hypertension,diabetes for many years.The size of the tumor was 6 cm × 7 cm × 8 cm,dark red,hard shell,endoplasmic soft.The surface was contaminated,oozy,scabing,poor activity,the boundary was not clear,and pressing with no feeling.The pathological examination showed squamous cell carcinoma (SCC),as shown in Figure 1.Immunohistostaining revealed positive staining for PAS and ABPAS in the tumor tissue.We also performed immunohistostaining analysis,such as keratins AE1/AE3,EMA,cytokeratin 7,cytokeratin 18,cytokeratin 20,vimentin,S-100,HMB45,CD68,CKH and CD34.Of which,keratins AE 1/AE3,cytokeratin 18,CKH,CD34 and EMA were positive,others were negative.The tumor was diagnosed as huge clear cell SCC.After expansion excision,skin grafting,abdominal skin surgery,postoperative recovery was uneventful,and flakiness has survived well.     

透明细胞乳头状肾细胞癌的研究进展

2016年WHO正式将透明细胞乳头状肾细胞癌作为一种肾细胞癌新类型。该肿瘤可以为散发性也可以发生于终末期肾病或Von Hippel?Lindau综合征（VHL综合征）,具有相对特征性的病理组织学形态、免疫表型和分子遗传学特点,诊断时应与透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌以及Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌相鉴别。鉴于透明细胞乳头状肾细胞癌生物学行为相对惰性或低度恶性,因此准确诊断对指导临床治疗和判断预后具有十分重要的意义。     

多发肾透明细胞癌11例磁共振影像分析

目的 描述多发肾透明细胞癌的MR影像表现.方法 回顾性分析2008年1月至2010年12月解放军总医院共11例经病理证实的多发肾透明细胞癌的MR影像资料及临床资料,重点分析病灶的分布、大小、外形、信号,增强特点.结果 11例多发肾细胞癌患者,其中6例女性,5例男性,年龄36 ～ 69岁,平均50.6岁,共发现24个病灶.9例患者为双肾多发病变,单侧肾多发病变为2例.T2加权图像高信号的有16个病灶(16/24),所有病变均可见假包膜,出血的有4例(4/24),含有脂质的为12例(12/24),囊变的有18例(18/24),动态增强扫描各期持续强化的有22例(22/24),快进快出的有2例(2/24).所有病变呈现中度至明显强化.5例患者的多发病变MR表现一致,6例患者的多发病变MR表现并不一致.结论 多发肾细胞癌通常为两肾多发.同一患者的多发病变即使病理类型一致,MR表现可能不同.