hTERT及CMV双调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨hTERT启动子及CMV增强子双调控表达载体调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的效应.方法 将双调控增强型载体及hTERT单启动子载体(作为对照组)分别转染两种端粒酶(+)的人鼻咽癌5-8F细胞及对照组人乳腺癌MCF-7细胞及端粒酶(-)的正常人血管内皮ECV细胞,Stretch PCR法验证5-8F细胞、MCF-7细胞及ECV细胞中端粒酶活性,荧光显微镜下观察TK基因绿色荧光蛋白表达差异,MTT法分析杀灭鼻咽癌细胞的效果.结果 ①Stretch PCR法验证人鼻咽癌细胞5-8F、人乳腺癌细胞MCF-7端粒酶活性星阳性,人血管内皮ECV细胞端粒酶活性呈阴性.②增强型表达栽体转染上述两种端粒酶(+)肿瘤细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,单启动子亦有较强的荧光表达,但比增强型表达载体要弱,而ECV细胞几乎无绿色荧光.③加入GCV后,增强型表达载体对两种端粒酶(+)肿瘤细胞体外增殖均有明显抑制作用,且均高于单启动子组、空载体组及空白对照组,而增强型表达载体转染ECV细胞体外增殖无明显抑制作用.结论 以hTERT启动子及CMV增强子双调控TK基因的表达载体能够靶向杀灭鼻咽癌细胞,且作用明显强于单启动子载体组.这种新型高效、靶向增强型载体有可能成为一种鼻咽癌临床靶向基因治疗的新策略.     

Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体的构建及其肿瘤靶向干扰作用研究

目的：构建带有肿瘤特异性Survivin启动子、hTERT基因靶向的shRNA表达载体pYr-Survivinp-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法：化学合成hTERT基因shRNA寡核苷酸序列,克隆至质粒pYr-CMV-Mir30-shRNA,构建重组质粒pYr-CMV-Mir30-hTERT;克隆Survivin启动子序列,取代该质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pYr-Survivinp-miR30-hTERT,同时构建阴性对照质粒pYr-CMV-Mir30-NC,以上质粒均进行酶切及测序鉴定。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞及293T细胞,荧光显微镜下观察细胞转染情况,并采用半定量RT-PCR、western blot 技术检测MCF-7细胞和Hela 细胞中hTERT mRNA和蛋白的表达。结果：重组质粒经酶切及测序鉴定证实均符合设计要求,构建成功;荧光检测结果表明,CMV组在三种细胞中均有荧光蛋白的表达,而Survivin组质粒仅在MCF-7细胞和Hela细胞中表达绿色荧光,转染效率均能达到70%以上,而在293T细胞中则未见荧光;RT-PCR和Western blot的结果均显示MCF-7细胞和Hela细胞的Survivin组和CMV组中hTERT mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制（P<0.05）,两组之间无明显差异（P>0.05）。结论：Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体能有效抑制Survivin阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,而对正常细胞不产生影响。     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

OBJECTIVE: To study the killing effect of adenovirus-mediated double suicide gene under the regulation of kinase domain-containing receptor (KDR) promoter on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). METHODS: The sequences of human KDR promoter gene, CD gene and TK gene were amplified by PCR, and the plasmid pKDR-CDglyTK was constructed. A two-step transformation protocol was employed for the construction of a recombinant adenoviral plasmid pAdKDR-CDglyTK that was transfected into 293 packaging cells to further multiply and purify the adenovirus. HUVECs were infected by the resultant recombinant adenovirus of different multiplicities of infection (MOI), and the infection rate was measured by observing the expression of green fluorescence protein (GFP). The infected cells were cultured in the culture media containing ganciclovir (GCV) and/or 5-fluorocytosine (5-FC) at different concentrations, and the killing effects were evaluated. RESULTS: Recombinant adenovirus AdKDR-CDglyTK were successfully constructed, which could efficiently infect HUVEC cells, with the infection rate associated with the MOI of the recombinant adenovirus. HUVEC cells infected with AdKDR-CDglyTK were highly sensitive to the prodrugs, their survival rate correlated to both the concentration of the prodrugs and the MOI of the recombinant adenovirus. The killing effect of the two produrgs used in combination was much stronger than that of exclusive use of GCV or 5-FC. CONCLUSIONS: Prodrug/KDR-CdglyTK system is effective in killing HUVEC cells, and its killing effect is correlated with the concentration of the prodrugs and the MOI of the recombinant adenovirus. Combination of the two prodrugs produces stronger killing effect on the cells.     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究

目的 研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果.方法 ①用已构建的hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;②MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;③将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用.结果 ①转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;②GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK 和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照, 转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;③pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%).结论 hTERT启动子可以调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向性表达,HSV-TK/GCV治疗系统在hTERT启动子调控下对肺癌细胞A549的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用.     

含hTERT启动子和Fcy::Fur基因重组质粒的构建及其对卵巢癌细胞的体外杀伤作用

目的 构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和融合型自杀基因Fcy::Fur的重组真核表达质粒并探讨它对卵巢癌细胞的体外杀伤作用.方法 ①从pORF5-Fcy::Fur质粒中PCR扩增Fcy::Fur片段,业克隆进p2XEB质粒,构建含hTERT肩动了和Fcy::Fur基因的重组真核表达质粒p2XEB-Fcy::Fur;同理,将Fcy::Fur亚克隆进pGL3-Promoter质粒,构建含猿猴病毒40(SV40)启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒pGL3-Pro-Fcy::Fur,重组子经酶切鉴定、测序;②RT-PCR检测卵巢癌细胞SKOV3和人胚肺成纤维细胞MRC-5中hTERT mRNA的表达,荧光素酶活性分析检测hTERT启动子在2种细胞中活性;③用超声微泡作载体,将上述2种质粒分别转染SKOV3和MRC-5,与前药5-氟胞嘧啶(5-FC)共培养后,CCK-8测定转染细胞增殖抑制率;吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色观察细胞凋亡;RT-PCR检测Fcy::Fur mRNA的表达.结果 p2XEB-Fcy::Fur和pGL3-Pro-Fcy::Fur 2种重组质粒酶切和测序结果 与预期完全相符,hTERT启动子和Fcy::Fur片段测序与GenBank报道一致,且插入方向正确;SKOV3和MRC-5中hTERT mRNA表达分别为阳性和阴性,hTERT肩动子在SKOV3中活性为26.2%,在MRC-5中为0.65%;p2XEB-Fcy::Fur/5-FC系统对SKOV3的增殖抑制率明显高于MRC-5(P=0.036),而pGL3-Pro-Fcy::Fur/5-Fc系统对2种细胞的增殖抑制率无明显区别(P=0.87);转染pGL3-Pro-Fcy::Fur的SKOV3、MRC-5细胞以及转染p2XEB-Fcy::Fur的SKOV3细胞,均见大量凋亡细胞和Fcy::Fur mRNA表达,而转染p2XEB-Fcy::Fur的MRC-5少见凋亡细胞,也无Fcy::Fur mRNA表达,与前三者比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 含人端粒酶逆转录酶启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒p2XEB-Fcy::Fur成功构建,p2XEB-Fcy::Furl/5-FC系统能靶向杀伤端粒酶逆转录酶阳性的卵巢癌细胞.     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法 应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果 成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论 KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联?     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

端粒酶与肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一．端粒的磨耗限制大多数体细胞的复制,肿瘤细胞主要通过转录上调端粒酶限制成分催化亚基端粒酶逆转录酶（hTERT）维持端粒长度．由于hTERT启动子区域已被克隆,其特点也已被鉴定,hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗成为研究的热点．我们综述了hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗最新研究进展．     

肿瘤基因靶向治疗载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因核心启动子调控的EGFP基因表达载体。方法从体外培养的HepG2细胞中提取全基因组DNA,以此为模板,克隆得到hTERT基因启动子核心区基因片段(hTERTp)。设计引物以质粒pEGFP-N1为模板利用PCR扩增得到EGFP基因片段,将两者通过搭桥PCR扩增得到hTERTp-EGFP片段,经SacⅠ、XbaⅠ双酶切定向插入到pGL3-Enhancer载体中,得到重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。将该表达载体瞬时转染HELF细胞和HeLa细胞后观察EGFP蛋白表达情况。结果重组质粒经测序后确认插入序列正确无误,瞬时转染48h后在HeLa细胞中可以看到EGFP蛋白的大量表达,而在HELF细胞中未见表达。结论成功构建了可以通过hTERT核心启动子调控治疗基因在肿瘤细胞中特异表达的重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。     

MDR1启动子调控的双自杀基因靶向杀伤耐药胶质瘤细胞的研究

目的探讨多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD、TK双自杀基因系统并加前体药物丙氧鸟苷及5 氟胞嘧啶（pcDNA3.MDR1P.CDTK/GCV+5-FC）对耐药胶质瘤细胞（C6/ADR细胞）的靶向杀伤作用。方法利用脂质体介导法将含有MDR1启动子调控的CD、TK双自杀基因的真核表达载体PcDNA3.MDR1P.CD.TK转染入C6/ADR细胞（C6/ADR/CDTK），利用PCR鉴定CD、TK基因的整合，利用RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达；然后以转染了质粒pcDNA3.MDR1P.CDTK的C6细胞（C6/CDTK）和正常C6/ADR细胞作为对照，分别加前体药物，利用生长曲线、流式细胞仪、平板克隆形成等方法研究双自杀基因对耐药胶质瘤细胞生长、细胞周期及增殖的影响。结果PCR结果显示，CD、TK基因均整合入C6和C6/ADR细胞中；RT-PCR结果显示，C6/ADR/CDTK细胞中CD、TK基因有特异性表达，而C6/CDTK细胞无特异性表达。应用前体药物后，C6/ADR/CDTK细胞增殖明显受抑；C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞经流式细胞仪检测G1期的细胞比例分别为32.68%、47.57%、99.93%（P＜0.05，其平板克隆形成率分别为(96.7±2.1)%、(86.7±1.9)%、(16.7±0.9)%（P＜0.05）。结论pcDNA3.MDR1P.CDTK/GCV+5-FC系统对C6/ADR具有较强的靶向杀伤作用。     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp~+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

RNAi靶向人端粒酶逆转录酶对人肝癌细胞的生长抑制作用

目的 利用RNAi技术降低人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达,抑制其活性,研究其对人肝癌细胞的增殖和凋亡影响.方法 构建针对hTERT基因的siRNA真核表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT,制备靶向hTERT的重组逆转录病毒;用重组逆转录病毒感染HepG2人肝癌细胞,以TRAP法检测端粒酶活性变化;流式细胞仅检测细胞凋亡率;MTT法检测肿瘤细胞生长抑制情况.结果 成功制备出hTERT siRNA逆转录病毒表达载体;重组病毒感染HepG2细胞24、48、72 h后端粒酶活性分别下降了23.84%、58.03%和85.01%(P＜0.05);感染后24 h细胞凋亡率29.05%;MTT实验结果显示肿瘤生长受到抑制,并存在一定量效和时效关系.结论 hTERT siRNA能特异性使hTERT基因表达抑制,端粒酶活性下降,肝癌细胞增殖受到抑制.     

白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT表达及其启动子的影响

目的：观察白藜芦醇对大肠癌细胞生长增殖的影响,并从人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcfiptase,hTERT）表达及其启动子方面探讨可能的抗癌机制。方法：以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS-174T细胞后,收集细胞,分别采用荧光实时定量RT—PCR和蛋白质印迹法检测癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至大肠癌LS-174T细胞中后,加入不同浓度的白藜芦醇,孵育48h后,检测报告基因萤虫素酶活性。结果：白藜芦醇处理大肠癌细胞后,增殖明显受到抑制,且与浓度有关。癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。白藜芦醇处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论：hTERT启动子活性和hTERT表达下调,可能是白藜芦醇抑制癌细胞增殖的重要机制之一。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

hTERT及c-myc蛋白在宫颈癌中的表达

目的探讨宫颈癌及癌前病变中端粒酶逆转录酶（hTERT）和c-myc蛋白的表达及相互关系。方法以44例宫颈癌、18例宫颈上皮内瘤变（CIN）和6例正常宫颈组织为研究对象，采用免疫组化SP方法检测c-myc蛋白、hTERT蛋白，并对各指标阳性表达率和相关性进行比较分析。结果正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变（CIN）、宫颈癌组织中，c-myc蛋白的阳性率分别为0，38．9％，72．7％；hTERT蛋白为0，33．3％，77．3％。二者在CIN、宫颈癌中分别与正常组织相比差异有显著性（P〈0．05）。宫颈癌组织中的表达较CIN高，差别有显著性（P〈0．05）。宫颈癌中，c—myc蛋白和hTERT蛋白的表达在有周围组织浸润、有淋巴结转移和远处转移时显著增高，其阳性表达随期别的增加而增高（P〈0．05）。二者的表达呈正相关。结论hTERT基因的过度表达在宫颈癌的发生发展过程中具有重要作用；c-myc蛋白和hTERT的过表达是宫颈癌发生中的早期事件，其表达水平随着宫颈癌恶性程度的增加而增加; c-myc在转录水平上激活hTERT的表达，可能是宫颈癌发生发展的重要阶段。     

鼻咽癌患者外周血端粒酶hTERT mRNA的定量检测及其临床意义

目的定量检测鼻咽癌患者外周血中端粒酶逆转录酶催化亚单位（hTERT）mRNA的表达,并探讨其在鼻咽癌中的诊断及
治疗意义。方法采用实时荧光定量PCR技术（QPCR）检测33例鼻咽癌患者治疗（放疗或化疗）前后血浆中hTERT mRNA的表
达,并分析其与临床病理因素的关联,以24例健康志愿者作为对照。结果结果显示,健康志愿者血浆中hTERT mRNA相对表
达量为0.95±0.37,鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA含量达到10.75±4.29（P<0.05）。鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA的表达
与年龄、性别无统计学差异（P>0.05）,而与临床分期、T分期及N分期有显著性差异（P<0.05）。早期患者（Ⅰ、Ⅱ期）,放疗后其表
达量3.43±1.42 较治疗前5.60±2.33 明显下降;晚期患者（Ⅲ、Ⅳ期）诱导化疗及放疗后其表达量较治疗前12.68±3.08 分别降为
10.68±2.48、3.13±1.69（P<0.05）。结论鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA的表达明显升高,放化疗能够有效抑制该基因的表达,
而且该基因的含量与肿瘤的临床分期、大小及淋巴结浸润范围等临床病理因素密切相关,从而提示检测鼻咽癌患者外周血中
hTERT mRNA的含量,有可能为鼻咽癌患者早期诊断及疗效判断提供重要信息。
     

人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（hTRT）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术,构建hTRT正比、反义真核表达载体,采用脂质体法导入SGC－790细胞、反义真核表达载体,并导入SGC－790胃癌细胞株中,获得稳定表达正、反义基因的细胞系7901－S、7901－AS1和7901－AS2。7901－AS1和7901－AS2出现显著生长抑制现象,端粒酶活性明显下降,细胞凋亡增加,异型性减小,G0／G1期细胞增加,S和G2M期细胞减少,增殖指数减小,软琼脂中克隆形成,裸鼠体内成瘤消失。结论 hTRT反义基因治疗可以明显抑制SGC－7901细胞的增殖,部分逆转肿瘤细胞的恶性表型,其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的,提示hTRT基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。     

hTERT在肾癌中的表达及临床意义

目的 检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)在肾癌中的表达及其临床意义.方法 采用RT-PCR及Western blot方法检测45例肾癌组织、45例配对的癌旁肾组织及786-0细胞系中hTERT mRNA及蛋白的表达情况,观察其表达与肿瘤大小、临床分期、病理组织分型、分级之间的关系.结果 hTERT mRNA及蛋白在肾癌组织中呈高表达(P=0.000),其表达与肾癌的肿瘤大小、临床分期、病理组织分型、分级之间无关(P＞0.05).结论 肾癌组织中hTERT表达较高,可尝试用于肾癌的诊断和预测,并为基因治疗提供了思路.