旋转生物反应器内微载体共培养CL-1肝细胞与人肝星形细胞

目的评估CL-1肝细胞跟人肝星形细胞(HSC)的微载体微重力共培养来提高CL-1肝细胞的活力与功能的可行性。方法实验分为两组:CL-1肝细胞微载体微重力单培养组和CL-1肝细胞、HSC微载体微重力共培养组。通过倒置显微镜观察、细胞计数、MTT染色及扫描电子显微镜比较两组肝细胞的形态、细胞活力差异,并通过、培养上清中ALT、白蛋白浓度等功能指标测定,比较两组肝细胞活力和功能差异。结果共培养组较单培养组细胞生长迅速,细胞从24 h贴壁后开始增长,到第5天进入高峰。共培养组1~7 d的肝细胞密度明显高于单培养组的细胞密度(P<0.05)。两组肝细胞ALT、白蛋白从第1天开始不断分泌增加,第5天达到峰值,第6、7天有所下降。ALT功能比较,共培养组明显低于单培养组(P<0.05)。白蛋白功能比较,共培养组明显高于单培养组(P<0.05)。倒置显微镜、扫描电镜及MTT均提示共培养组肝细胞形态、活力优于单培养组。结论人肝细胞、HSC微载体微重力共培养研究有利于维持及增强旋转生物反应器的肝细胞活力及功能,对人工肝的培养模式发展具有重要意义。     

旋转生物反应器内微载体共培养CL-1 肝细胞与人肝星形细胞

目的评估CL-1肝细胞跟人肝星形细胞（HSC）的微载体微重力共培养来提高CL-1肝细胞的活力与功能的可行性。方法
实验分为两组：CL-1肝细胞微载体微重力单培养组和CL-1肝细胞、HSC微载体微重力共培养组。通过倒置显微镜观察、细胞
计数、MTT染色及扫描电子显微镜比较两组肝细胞的形态、细胞活力差异,并通过、培养上清中ALT、白蛋白浓度等功能指标测
定,比较两组肝细胞活力和功能差异。结果共培养组较单培养组细胞生长迅速,细胞从24 h贴壁后开始增长,到第5天进入高
峰。共培养组1~7 d的肝细胞密度明显高于单培养组的细胞密度（P<0.05）。两组肝细胞ALT、白蛋白从第1天开始不断分泌增
加,第5天达到峰值,第6、7天有所下降。ALT功能比较,共培养组明显低于单培养组（P<0.05）。白蛋白功能比较,共培养组明
显高于单培养组（P<0.05）。倒置显微镜、扫描电镜及MTT均提示共培养组肝细胞形态、活力优于单培养组。结论人肝细胞、HSC
微载体微重力共培养研究有利于维持及增强旋转生物反应器的肝细胞活力及功能,对人工肝的培养模式发展具有重要意义。
     

蜕皮甾酮在体外条件下对人骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的 分离培养并鉴定人骨髓间充质干细胞(hMSC),观察不同剂量蜕皮甾酮(EDS)对hMSC增殖的影响.方法 密度梯度离心法获取hMSC,检测第2代细胞CD44、CD105、CD34及CD29的表达以鉴定其为hMSC.设不同浓度EDS的细胞培养体系(10、25、50和100μg/ml)与对照组(单纯hMSC培养基,无EDS)作对比,MTT比色法测定hMSC的增殖活力,并行流式细胞周期观察.结果 EDS各浓度组hMSC的MTT吸光度值与对照组比较均有明显差异(P<0.01);EDS浓度为25 μg/ml时hMSC MTT吸光度值显著高于其余各组(P<0.01);在EDS浓度为10、50、100 μg/ml时,组间吸光度值未见明显差异(P>0.05),但显著高于对照组(P<0.01).流式细胞周期显示EDS浓度为25μg/ml时hMSC培养体中细胞S期细胞所占比例、增殖指数均明显高于对照组.结论 EDS在一定浓度范围内对体外培养条件下的hMSC具有生长促进作用,该作用在EDS浓度为25 μg/ml时最为显著,但是EDS促进hMSC增殖的作用不随剂量的增加而增加.     

人肝细胞系CL—I的微载体成功培养及功能检测

本研究采用微载体培养技术进行人肝细胞系CL－I的高密度培养。使用微载体浓度为5mg／ml，细胞接种浓度为2×105／ml，在100ml的Bellco搅拌培养瓶中，以30rpm的转速进行持续搅拌培养，光镜和电镜动态观察细胞生长情况，并监测CL－I人白蛋白合成量及安定转化量。结果表明，在培养的第七天，细胞总量达到最高峰为2．13×108，人白蛋白合成量达71．23μg，安定转化量为619．7μg。本实验为进一步使用微载体培养技术培养人肝细胞系作为人工肝生物材料的动物实验打下基础。     

C-Met基因转染对喉癌细胞生长的影响

目的 初步探讨C-Met基因对喉癌细胞生长的影响.方法设实验组和对照组.实验组以携带C-MetcDNA的重组腺病毒载体Ad-C-Met转染喉癌Hep2细胞,对照组以空腺病毒载体转染喉癌Hep2细胞.转染后,观察两组喉癌Hep2细胞培养12d后的克隆形成率,培养第1、3、5、7天的存活细胞数和培养第7天的细胞周期.结果实验组细胞生长速率高于对照组(P＜0.05);实验组克隆形成率(31±5)%高于对照组的(15±3)%(t=12.321,P＜0.01);实验组G0/G1期细胞比例0.67±0.16,低于对照组的0.79±0.11(t=4.836,P＜0.05);S期细胞比例0.19±0.02,高于对照组的0.06±0.01(t=15.357,P＜0.01).结论 C-Met参与了喉癌细胞内的TGF-β信号通路,可以阻断TGF-β对喉癌细胞的生长抑制作用.     

高磷对大鼠血管平滑肌细胞钙化及核心结合因子α1表达的影响

[目的]研究高磷对体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙沉积以及核心结合因子α1 (Cbfα1)的影响.[方法] 体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,根据培养基中磷浓度分为:正常磷浓度(磷浓度1.4 mmol/L)和高磷浓度(磷浓度2.4 mmol/L)组,培养第3 d、6 d、9 d后,BCA法检测细胞内钙含量,放射免疫方法检测培养液骨钙素含量,ELISA检测细胞Cbfα1与DNA结合活性.[结果] 正常磷浓度组VSMCs钙含量在9 d内无明显变化.高磷浓度组第3、6、9天细胞钙含量比第0天明显增高(P<0.01).高磷浓度组细胞钙含量在第3、6、9天均明显高于相同时间点正常磷浓度组(P<0.05).培养3 d后,高磷浓度组培养上清液骨钙素水平明显高于正常磷浓度组,(14.62±2.93)pg/μg蛋白vs (2.83±0.64)pg/μg蛋白,P<0.01.Cbfα1活性在正常磷浓度组细胞9 d内无明显变化;但在高磷浓度组6、9天与第0天比明显增强(P<0.05).高磷浓度组在第6、9天细胞Cbfα1活性与相同时间点正常磷浓度组比明显增强(P<0.05).[结论] 高磷可直接刺激大鼠VSMC的钙沉积和骨钙素产生,其作用可能与高磷上调VSMC的Cbfα1表达有关.     

组织工程化颌下腺细胞与支架材料复合培养最佳细胞浓度的实验研究

目的 :研究颌下腺细胞与支架材料体外复合培养中 ,细胞接种浓度对复合培养物的影响。方法 :体外原代培养SD鼠颌下腺细胞 ,并传代至第 2代 ,细胞计数 ,按细胞浓度为 10 ,2 0 ,30 ,4 0 ,5 0 ,6 0 ,70× 10 6/ml接种于 5mm× 5mm× 2mm胶原海绵表面 ,并置于 2 4孔培养板内 ,形成颌下腺细胞 胶原海绵复合物。继续培养 ,于接种细胞后 1,3,5 ,7d取材 ;HE染色、免疫组化、扫描电镜观察及细胞计数检测等 ,评价颌下腺细胞 -胶原海绵复合物形成的最佳细胞接种浓度。结果 :5 0 ,6 0 ,70× 10 6/ml细胞浓度的复合物中颌下腺细胞在支架材料上黏附、伸展及生长良好。 10 ,2 0 ,30 ,4 0× 10 6/ml细胞浓度的复合物中颌下腺细胞在支架材料上增殖分化及生长较差。细胞计数显示接种 7d时 ,各组材料细胞数均只有 10 4/ml数量级 ,5 0 ,6 0 ,70× 10 6/ml接种浓度时 ,细胞粘附数量是 10 ,2 0 ,30 ,4 0× 10 6/ml的 2倍。结论 :颌下腺细胞与胶原海绵复合培养最佳接种细胞浓度为 5 0× 10 6/ml。与其它组织细胞复合培养的最佳接种浓度相似     

阳离子脂质体Lipofectamine2000对人胰腺癌Capan-2细胞的毒性作用

目的 探讨阳离子脂质体Lipofectamine2000(Lipo)在一定浓度下对细胞毒性的作用机制.方法 应用一定毒性浓度的Lipo作用于胰腺癌Capan-2细胞,利用细胞直接记数法和流式细胞术检测其对Capan-2细胞生长、细胞凋亡和周期的影响.结果 Lipo与siRNA的浓度均影响转染率的高低.在2 ml转染体积中,Lipo在5μl的浓度下,使Capan-2细胞生长明显减慢,以第3天后更加明显(P<0.001).随着转染细胞按常规培养的时间延长,早期凋亡细胞明显增多(P<0.05),活性细胞明显减少(P<0.01),而损伤细胞和死亡细胞明显增多(P<0.001),以48 h后更明显:G0～G1期细胞明显增多(P<0.05),Gz-M期细胞明显减少(P相似文献   

模拟微重力环境促进人间充质干细胞体外高效增殖

目的观察人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)在模拟微重力环境中的体外增殖情况.方法在旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)模拟的微重力环境中,用Cytodex-3微载体技术培养hMSCs,通过相差显微镜、细胞计数、MTT法、CCK-8(cell counting Kit-8)观察检测hMSCs的增殖状况.结果试验组hMSCs较平皿培养组延长指数生长期提高2倍,细胞增殖速度提高近2倍,培养密度增加15.8倍.结论模拟微重力环境能促进hMSCs的体外增殖速度,利于体外规模化扩增组织工程的种子细胞.     

重组人骨形成蛋白成熟肽4对急性放射损伤小鼠造血系统的修复作用

目的探讨重组人骨形成蛋白成熟肽-4(rhBMP-4m)对~(60)Coγ射线照射引起的小鼠造血系统损伤的修复作用。方法 90只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组和rhBMP-4m治疗组,每组30只。模型组和rhBMP-4m治疗组小鼠接受~(60)Coγ射线照射,照射剂量7 Gy,全身照射200 s;正常对照组小鼠不接受照射。模型组小鼠每日腹腔注射生理盐水1.0 mL,rhBMP-4m治疗组小鼠每日腹腔注射rhBMP-4m 0.5 mg,连续治疗6 d。分别于照射后第1、3、5、7、9天检测小鼠外周血白细胞数、骨髓单个核细胞数、骨髓单个核细胞中CD34~+细胞比例;照射后第9天进行脾结节计数,并计算脾脏质量与体质量的比值(脾体比)。结果照射后第1天3组小鼠外周血白细胞计数比较差异均无统计学意义(P>0.05);照射后第3、5、7、9天模型组小鼠外周血白细胞计数低于正常对照组(P<0.01);照射后第3、5天rhBMP-4m治疗组小鼠外周血白细胞计数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),照射后第7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠外周血白细胞计数高于模型组(P<0.05)。模型组小鼠照射后各时间点骨髓单个核细胞计数均低于正常对照组(P<0.01)。照射后第1、3天rhBMP-4m治疗组小鼠骨髓单个核细胞计数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),照射后第5、7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠骨髓单个核细胞计数高于模型组(P<0.05)。模型组小鼠照射后各时间点的单个核细胞中CD34~+细胞百分率均低于正常对照组(P<0.01)。rhBMP-4m治疗组小鼠照射后第1、3天单个核细胞中CD34~+细胞百分率与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05),照射后第5、7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠单个核细胞中CD34~+细胞的百分率高于模型组(P<0.05)。照射后第9天,模型组小鼠脾结节计数高于正常对照组,脾体比低于正常对照组(P<0.05);rhBMP-4m治疗组小鼠脾结节计数和脾体比高于模型组(P<0.01)。结论辐射可引起小鼠骨髓造血系统损伤,rhBMP-4m能够促进骨髓造血系统的重建。     

玉竹提取物B诱导人结肠癌CL-187细胞凋亡的实验研究

目的 研究中药玉竹提取物B(EB—PAOA)诱导人结肠癌CL—187细胞凋亡的作用。方法 将体外培养的人结肠癌CL—187细胞与不同浓度的EB—PAOA共育，通过倒置显微镜和透射电镜对活细胞及固定染色后的细胞进行了观察，确认有无凋亡细胞；通过流式细胞仪检测了CL—187细胞周期的变化和凋亡率。结果 在倒置显微镜和透射电镜下，可见到大量具有典型特征的凋亡细胞；流式细胞仪DNA直方图上出现了凋亡峰，凋亡率呈时间--剂量依赖性。细胞周期分析结果显示，G0／G1期细胞减少，S期细胞减少，G2／M期细胞增多。结论 EB-PAOA能够诱导人结肠癌CL—187细胞凋亡，这可能是EB—PAOA抗肿瘤的作用机制之一。     

PRL-2真核表达载体的构建及其致侵袭和粘附的研究

目的 构建PRL-2真核表达载体并观察其致侵袭和粘附的能力.方法 用RT-PCR法从肝癌细胞系HepG2总RNA中扩增编码PRL-2基因全长阅读开放框DNA,构建真核表达载体.以脂质体转染法将重组质粒稳定转染至正常永生化肝细胞系CL1中,筛选阳性克隆.分别应用RT-PCR、Western blotting免疫印迹和免疫组化法分析PRL-2在阳性细胞中mRNA、蛋白表达及其定位.MTT法观察转染20 min和120 min后与底物粘附的细胞数,评价PRL-2对CL1肝细胞粘附能力的促进作用,观察6 h后细胞穿透多聚碳膜上层粘蛋白的细胞数,分析PRL-2对肝细胞浸润迁移的影响.结果 经RT-PCR扩增出大小为504 bp的基因片断,序列测定正确并经亚克隆酶切鉴定.经过8周G418筛选后,获得稳定表达PRL-2的细胞亚系PRL-2-CL1,经RT-PCR、Western blotting印迹和免疫组化证实,PRL-2-CL1细胞系表达PRL-2 mRNA及蛋白.PRL-2使CL-1细胞在20 min和120 min时对纤连蛋白的粘附率明显升高(P＜0.05),PRL-2使CL-1细胞穿透迁移小室多聚碳膜的细胞数由(10.0±3.7)个显著升高至(44.8±2.6)个(P＜0.05).结论 成功构建重组PRL-2真核表达载体并可在永生化肝细胞中稳定表达,PRL-2具有致肝癌细胞侵袭和转移的能力.     

刺梨提取单体CL-1对胃癌细胞系增殖的抑制作用

目的观察刺梨提取物CL-1对抗胃癌细胞系SGC-7901和MKN-45体外增殖的抑制作用.方法采用MTT检测法和生长曲线的绘制,观察CL-1对胃癌SGC-7901和MKN-45细胞增殖的影响.结果MTT法检测显示,CL-1(10-8-10-4mol·L-1)对SGC-7901和MKN-45细胞生长的抑制作用均呈现剂量依赖性和时间依赖性.细胞生长曲线显示:随CL-1剂量的增加,SGC-7901和MKN-45细胞的生长曲线逐渐右移.结论CL-1具有体外抗肿瘤作用.     

玉竹提取物B对人结肠癌CL-187细胞的抑制作用

目的：研究中药玉竹提取物B（EB－PAOA）对人结肠癌CL－187细胞株的抑制作用。方法：体外培养结肠癌CL－187细胞，绘制生长曲线，然后将其与不同浓度的EB－PAOA共育，用MTT比色分析法测定EB－PAOA对CL－187细胞的抑制率，结果：EB－PAOA抑制了CL－187细胞的增殖，且呈时间－剂量依赖性，结论：EB－PAOA有一定的抗肿瘤作用。     

Effect of miR-296 on the Apoptosis of Androgen-independent Prostate Cancer Cells

Objective To investigate the miR-296＇s function in prostate carcinoma（PCa） cells. Methods In order to profile the miRNA expression in LNCaP cells, the cultured cells were stimulated with androgen after 48-h starvation, miRNA microarray analysis and Q-RT-PCR assay were performed. To characterize the effects of miR296 on PCa cells, CL-1 and PC-3 cells were transfected with miR-296 and antisense-miR-296, cell growth and apoptosis were then analyzed. Results The miR-296-5p expression was up-regulated by 2.22 folds in the CL-1 cells, which do not express significantly androgen receptor, than in LNCaP cells. Knockdown of miR-296-5p induced apoptosis of CL-1 cells, but not LNCaP cells. However, knockdown of miR-296-5p inhibited the growth rate of LNCaP cells cultured in absence of androgen. Conclusion MiR-296-5p could be important for development of prostate cancer from androgen dependence to androgen independence.     

重组人生长激素对肾癌细胞株细胞周期动力学影响

目的　本实验试图阐明生长激素对于肾癌细胞有无促增殖和分化作用。方法　取对数生长期的人肾癌细胞株GRC -1,以氟尿嘧啶和 /或不同浓度的重组人生长激素 (rhGH)体外培养 ,2 4小时以后流式细胞仪测定细胞增殖周期和细胞凋亡等指标。结果　在空白对照组 ,G0 ～G1期的细胞数约占 5 3%,S期细胞数次之 ,G2 ～M期占不足 4%。在生长激素组 ,G0 ～G1期细胞数率降低 (P <0 .0 5 ) ,S期细胞百分率增高 (P <0 .0 1)。在单纯氟尿嘧啶组 ,G0 ～G1期细胞数增高 ,S期细胞数降低 ;同时加氟尿嘧啶和生长激素组与单纯氟尿嘧啶组相比 ,G0 ～G1期细胞数进一步增加 ,S期细胞数进一步降。结论　rhGH在体外作用于GRC -1细胞 ,能诱导细胞分化 ,促使静止细胞群进入增殖周期 ,并使处于DNA合成期的细胞增多 ,说明rhGH在体外有促进肾癌细胞生长增殖的作用 ,所以 ,我们推断肾癌细胞膜表面可能存在生长激素受体。氟尿嘧啶能使S期细胞数降低即抑制细胞的增殖 ,与氟尿嘧啶的作用机理相符。生长激素和氟尿嘧啶合用 ,S期细胞数进一步降低 ,说明生长激素能增强氟尿嘧啶抗肿瘤细胞生长增殖作用。     

Preparation and Identification of Rat Monoclonal Anti-idiotope Antibody to the Antibody against Erythrocytic Stages of Plasmodium Falciparum

A hybridoma cell line secreting monoclonal antibody to idiotope of the monoclonalantibody 94D1 specific for asexual erythrocytic stages of Plasmodium falciparum was established byfusion of SP2/0 mouse myeloma cells with spleen cells of Wistar rats immunized with monoclonalIgG of 94D1 purified from ascitic fluid of BALB/C mouse by affinity chromatography on ProteinA- Sepharose CL- 4B. Specificity of the anti - idiotope antibody (anti - Id), 41RF5, was deter-mined with indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showedthat 41RF5 reacted only with 94D1 IgG2b, not with normal mouse IgG and other seven mousemonoclonal antibodies - five specific for erythrocytic stages of P. falciparum, one for erythrocyticstages of P. inui, and one for Dengue fever virus type III, which indicates that 41RF5 does recognizespecifically the idiotope of 94D1 monoclonal antibody. In 41RF5 heterohybrid culture supernatant,anti-Id titre measured by ELISA was above 1:1 280. Up to the present, the heterohybrid cell linehas been cultured stably for 16 months.     

高密度微载体培养人肝癌细胞

目的研究人肝癌细胞在高密度微载体培养时的生长条件与培养方式,建立实验室规模高效、简便培养人肝癌细胞的方法。方法应用微载体CuhiSpher-S和Cytodex-1在1 L SuperSpinner搅拌瓶中培养人肝癌细胞THCC-98,采用批式换液连续培养的方式,对细胞生长及营养物质葡萄糖利用、代谢产物乳酸生成进行分析。结果人肝癌细胞THCC-98在CultiSpher-S和Cytodex-1培养中葡萄糖13消耗量高达2mmol／10^6。细胞（2．17和2．3）,乳酸日生成率为0．75—1．08mmol／10^6。细胞,最高浓度为9mmol／L（9．2比9．5）。通过实施批式换液连续培养,换液0．3—0．9V／d,可使细胞最高密度达（1．04比0．89）×10^7cells／ml。就两种微载体培养比较,CultiSpher-S由于具有更大的表面积／体积比,提供给细胞更大的生长空间,其所能达到的细胞密度高且营养物质利用更为有效。结论用1 L SuperSpinner搅拌瓶Cultisphere微载体批式换液连续高密度培养人肝癌细胞,细胞密度可达10^7cells／ml,批式收获细胞〉10^10。     

小鼠内淋巴囊原代上皮细胞L型钙离子通道定位表达

目的 探讨C57BL/6小鼠内淋巴囊原代上皮细胞中电压门控钙离子通道定位表达。 方法 选取2日龄C57BL/6(P2B6)小鼠60只,P2B6小鼠8只麻醉处死取得颞骨标本,体视显微镜下定位内淋巴囊位置,提取内淋巴囊原代细胞并在低血清状态下培养。P2B6小鼠52只处理同上,颞骨标本用4%甲醛固定后脱钙包埋,采用免疫组织荧光技术和免疫细胞荧光技术定性原代内淋巴囊上皮细胞并确定L型钙离子通道表达。 结果 内淋巴囊上皮细胞在P2B6小鼠内淋巴囊中排列紧密,可见细胞聚集呈嵴状突起,胞体较小,细胞呈椭圆状,以扁平上皮为主,细胞培养光镜观察为不规则铺路石样,细胞形态大小不一,胞浆丰富,核椭圆形且大。免疫荧光检测显示L型Ca²⁺通道在内淋巴囊上皮细胞膜上均呈均匀表达,细胞核上高表达。 结论 小鼠原代内淋巴囊上皮细胞中L-型电压依赖钙离子通道α1C亚基(CACNA1C)、L-型电压依赖钙离子通道α1S亚基(CACNA1S)、L-型电压依赖钙离子通道α1D亚基(Cav1.3/ CACNA1D)表达为阳性,为细胞功能学实验提供依据,有利于进一步研究内淋巴囊维持稳态的机制。