Let-7a负性调控肺癌A549细胞中NIRF基因的表达

目的：探讨肺癌A549细胞中let-7a对其靶基因NIRF表达的调控作用.方法：运用生物信息学方法对let-7a进行靶基因预测并分析其靶基因NIRF;构建含有NIRF 3′UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR;将pRL-TK或pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞,双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定转染后A549细胞中荧光素酶的表达;A549细胞分别转染let-7a mimics和control mimics,Western Blot检测NIRF蛋白的表达.结果：NIRF3′UTR含有一个let-7a结合位点,而且该结合位点在多个物种高度保守;经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR构建成功;共转染let-7amimics,pRL-TK-NIRF3′UTR与pGL3-control的A549细胞组,荧光素酶活性明显降低（P〈0.01）,为对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组）的50%;Western Blot检测显示,与未转染的A549细胞相比,转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显著降低（P〈0.01）,而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化（P〉0.05）.结论：肺癌A549细胞中,let-7a可以结合到NIRF 3′UTR,负性调控NIRF的表达.     

Let-7d表达质粒的构建及其对卵巢癌细胞高迁移率A2蛋白及ras蛋白表达的抑制作用

目的构建let-7d真核表达载体,研究let-7d对卵巢癌细胞生物学行为及蛋白表达的影响。方法根据let-7d序列设计合成
microRNA片段,定向克隆到pcDNATM6.2GW/EmGFPmiR真核表达载体上,运用基因转染技术将其导入卵巢癌IGROV1细胞
中,使let-7d基因过表达,以实时荧光定量PCR验证let-7d及高迁移率A2（HMGA2）基因的表达,并用Western blotting检测相关
蛋白HMGA2的差异表达。以MTT绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡率,分析let-7d对IGROV1细胞增殖生长的影
响。结果成功构建针对靶向let-7d的表达质粒,将表达质粒转染人卵巢癌IGROV1细胞后,明显下调HMGA2的表达水平,而
下调ras蛋白的作用较弱,没有前者明显。细胞表型研究显示,抑制HMGA2表达可能改变该细胞的恶性表型,表现在细胞增殖
能力明显下降,自发凋亡率明显增加等。结论Let-7d通过对HMGA2的调控,在改变卵巢癌IGROV1细胞恶性表型方面可能
起重要作用。
     

Let-7a microRNA沉默c-myc基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用

目的：研究let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞株的抑制作用,并利用分子生物学实验探索其可能的作用机制。方法：用LipofectamineTM2000介导的let-7a和阴性对照siRNA转染人乳腺癌细胞株MCF-7,半定量RT-PCR检测各组细胞c-myc mRNA表达;Western blot测定转染24h后蛋白的表达水平; CCK-8检测细胞增殖和凋亡。结果: 细胞转染后,let-7a转染组的c-myc mRNA表达水平明显低于脂质体对照组和阴性siRNA转染组（0.586±0.032 vs 0.934±0.029,0.825±0.004,P<0.01);在MCF-7细胞中存在分子量62kD的特异性条带,与c-myc分子量相符,let-7a在PVDF膜上的特异性条带明显弱于对照组; let-7a对细胞增殖具有一定的抑制作用(P<0.05),且该抑制作用具有时间和浓度的依赖性;转染24h后,let-7a组的细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)。结论： LipofectamineTM2000介导的let-7a可以通过抑制c-myc的基因表达,对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖进行抑制。     

let-7a1和let-7c在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:探讨人类微小RNA let-7a1和let-7c在肺癌组织中的表达及与临床病理特征之间的关系.方法:收集53例肺组织手术标本及临床资料,其中包括肺癌组织44例(收集其癌组织和癌旁正常组织)和良性肺疾病组织9例.并收集病人吸烟史、肿瘤TNM分期、病理分化程度及有无淋巴结转移等.采用Trizol法提取总RNA,采用荧...     

MicroRNA Let-7a与p53基因在肺癌中表达的相关性

目的探讨各种不同病理类型肺癌P53基因及其蛋白与Let-7a基因的表达水平的关系及意义.方法用实时荧光定量PCR检测肺腺癌、肺鳞癌及小细胞肺癌和癌旁组织以及体外培养的肺癌细胞株A549中P53及Let-7a的基因表达,用Western Blot检测相应的P53蛋白.结果 Let-7a、P53在癌组织中的表达量均低于正常组织中表达量,差异有统计学意义. P53基因表达量与Let-7a基因表达量呈正相关关系(相关系数为0.963,P<0.001).各类型肺癌组织及肺癌细胞株A549中P53蛋白的表达水平差异不大(P>0.05),但二者均显著低于癌旁组织中的P53蛋白水平,与基因表达情况一致(t=6.488,P<0.001).结论 P53与Let-7a基因的表达在肺癌中均降低,且呈正相关关系,推测P53可能参与调控let-7a基因的表达,从而抑制癌细胞的增长.     

人miRNA let 7a2质粒的构建及其表达

目的构建人miRNA let 7a2真核表达质粒,检测其在肺癌细胞A549中的表达。方法以人肺腺癌A549细胞总RNA为模板,将RT PCR扩增let 7a2的前体（pre let7a2）序列, 克隆至pSilencer4.1 CMV neo表达载体中,构建pSilencer4.1 let7a2重组质粒,转染A549细胞,采用RT PCR法检测pre let7a2的表达;构建let 7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR Report let7a2T,与pSilencer4.1 let7a2质粒共转染A549细胞,测定相对荧光素酶活性,以检测成熟let7a2在A549细胞中的表达及作用;采用MTT比色法检测pSilencer4.1 let7a2转染对A549细胞增殖的影响。结果构建的人let 7a2真核表达质粒pSilencer4.1 let7a2和let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR Report let7a2T经酶切及测序鉴定正确;pSilencer4.1 let7a2质粒转染A549细胞后,RT PCR检测pre let7a2表达较对照组明显增强;MTT比色法显示let 7a2对A549细胞增殖有抑制作用。pSilencer4.1 let7a2 质粒和pMIR Report let7a2T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测相对荧光素酶活性较对照组降低,显示let 7a2表达质粒转染A549细胞后,可有效表达let 7a2并转变为成熟的具有生物学活性的let 7a2。 结论成功构建了人let 7a2真核表达质粒,并在肺腺癌细胞A549中有效表达。     

microRNA let-7a对人晶状体上皮细胞凋亡的调控及其在白内障中的作用

目的 探讨micro RNA let-7a对人晶状体上皮细胞凋亡的调控作用及其在白内障中的作用。方法 利用Real time q-PCR方法,检测年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜和正常人眼晶状体前囊膜、人晶状体上皮细胞凋亡模型和正常人晶状体上皮细胞系let-7a的表达情况;利用Lipofectamine 2000瞬时转染let-7a mimic和let-7a inhibitor,分别上调和下调人晶状体上皮细胞中let-7a的表达,并利用Real time q-PCR方法验证转染效率,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果 年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜组let-7a的表达显著低于正常对照组;人晶状体上皮细胞凋亡模型组let-7a的表达显著低于正常对照组;let-7a mimic转染组let-7a的表达显著高于对照组,let-7a inhibitor转染组let-7a的表达显著低于对照组;let-7a mimic转染组细胞凋亡率显著低于对照组,let-7a inhibitor转染组细胞凋亡率显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 micro RNA let-7a能够调控人晶状体上皮细胞凋亡,从而在白内障发病过程中发挥重要作用,micro RNA let-7a可能成为白内障非手术治疗的新靶点。     

Let-7a稳定转染尤文肉瘤细胞系的建立

目的：构建携带let-7a基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的尤文肉瘤（Ewing’s sarcoma,ES）细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。方法：通过 Gateway克隆技术,扩增attB1-K-eGFP-let-7a-1-attB2片段,与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与母载体———pLV.Des2d.P/neo进行LR重组反应,生成目的质粒———pLV.Des2d.P/neo-EF1A>eGFP/let-7a;通过PCR及测序验证目的质粒;将携带let-7a的重组慢病毒质粒稳定转染ES细胞株 A673和 SK-ES-1获得A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞株;通过real-time PCR检测稳定转染细胞株内 let-7a的表达水平,Western blot检测其靶基因CDK6的表达。结果：PCR证实获得的目的条带与理论值相符,测序分析证实携带 let-7a 的真核表达载体插入序列及位点正确;real-time PCR及Western blot检测结果显示,与转染空载质粒及未处理组的 A673、SK-ES-1细胞株相比,稳定转染重组目的基因的A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞高表达let-7a,分别达到8.5倍（P=0.000）和6.5倍（P=0.001）,差异具有统计学意义;且细胞内let-7a靶基因CDK6的表达量明显减少。结论：成功构建稳定表达let-7a的ES细胞株 A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。     

血浆miR-20a和let-7a在卵巢癌中的表达及其临床意义

目的检测miR-20a和let-7a在卵巢癌患者血浆中的表达,探讨其临床意义。方法选取卵巢癌患者50例为实验组,另选择同期与其年龄性别相匹配的健康体检者20例为健康对照组,采用实时定量荧光定量酶链反应(qRT-PCR)检测血浆miR-20a和let-7a表达水平,同时采用电化学发光法测定其血浆中糖类抗原125(CA125)的含量并进行统计分析。结果卵巢癌患者血浆中miR-20a和let-7a的相对表达量分别为(4.02±3.77)、(0.42±0.34),卵巢癌患者血浆中miR-20a和CA125的表达均高于对照组(P<0.01),let-7a表达低于对照组(P<0.01)。临床病理分期Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期卵巢癌患者血浆let-7a相对表达量的中位数分别为0.39、0.21,差异有统计学意义(P<0.01),而血浆miR-20a的表达与临床病理分期无关(P>0.05),miR-20a和let-7a的相对表达量与年龄、淋巴结转移和组织学分类均无关(P>0.05)。miR-20a、let-7a和CA125的ROC曲线下面积为0.898(95%CI:0.802~0.957)、0.876(95%CI:0.775~0.942)、0.819(95%CI:0.708~0.900)。结论卵巢癌患者血浆中miR-20a和let-7a均表达异常,提示能够成为辅助诊断卵巢癌的标志物。     

microRNA-Let-7a及microRNA-34a在肺癌细胞中的抗癌效应及其分子机制研究

目的：体外研究分析基因调控因子微RNA（microRNA）-Let-7a和microRNA-34a在肺癌细胞系中的抗癌效应及其相应的分子机制。方法在适当的培养基及温度环境中培养A549和NCI-H446两株肺癌细胞系,培养过程中分别转染microRNA-Let-7a和microRNA-34a的2组作为试验组,并设定阴性对照组和未转染组,比较每组的细胞周期及细胞凋亡的情况。结果在转染的肺癌细胞系中抑制了细胞的增殖,A549细胞系let-7a、34a转染组细胞增殖在48 h后明显被抑制,细胞凋零百分比分别为（11.25±0.252）、（14.07±2.133）,NCI-H 446两株细胞系内let-7 a、34 a转染组细胞凋零百分比分别为（10.53±2.171）、（11.97±0.315）。细胞停滞于G0/G1期的百分比明显升高（P<0.05）,同时诱导了细胞的凋亡。结论基因调控因子microRNA-Let-7 a和microRNA-34 a在肺癌细胞中能抑制细胞周期,引起细胞凋亡,抗癌效应通过下调bcl 2和C-myc及上调P 53的表达水平的分子机制得以实现。     

Let-7a沉默c-myc基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长的抑制作用

目的 探讨let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞株的抑制作用及可能的作用机制.方法 用lipofectamineTM2000介导let-7a和阴性对照siRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞株,半定量RT-PCR检测各组细胞c-myc mRNA表达;Western blot测定转染24 h后c-myc蛋白的表达水平; CCK-8检测细胞增殖和凋亡.结果 细胞转染后,let-7a转染组的c-myc mRNA表达水平明显低于脂质体对照组和阴性siRNA转染组(0.586±0.032, 0.934±0.029,0.825±0.004,P<0.01);在MCF-7细胞中存在分子量62 kD的特异性条带,与c-myc蛋白分子量相符,let-7a组的特异性条带明显弱于对照组; let-7a对细胞增殖具有一定的抑制作用(P<0.05),且该抑制作用具有时间和浓度的依赖性.结论 Let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖有明显抑制作用,其机制可能与抑制c-myc的基因表达有关.     

miRNA let-7a靶向抑制ACVR1B表达

目的：探讨miRNA let-7a对ACVR1B表达的影响。方法：生物信息学分析表明activin receptor type 1B（ACVR1B）是一个let-7a的潜在靶基因。构建ACVR1B 3’UTR野生型（ACVR1B 3’UTR-WT）和ACVR1B 3’UTR突变型（ACVR1B 3’UTR-MUT）双荧光素酶报告载体,分别与let-7a模拟物（let-7a mimic）或let-7a阴性对照（let-7a NC）共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组细胞的荧光素酶活性。分别转染let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC至HEK293T细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测ACVR1B的mRNA和蛋白表达水平。结果：ACVR1B 3’UTR含有let-7a潜在的高度保守的结合靶点（77～83位点）。在HEK293T细胞中共转染ACVR1B 3’UTR-WT报告载体的let-7a mimic组比let-7a NC组荧光素酶活性组明显降低（P＜0.05）;而共转染ACVR1B 3’UTR-MUT报告载体的let-7a mimic与let-7a NC组其荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。在HEK293T细胞中let-7a mimic转染组中ACVR1B的mRNA和蛋白水平均低于let-7a NC组和let-7a inhibitor组（P＜0.05）。结论：ACVR1B是let-7a潜在调控的靶基因,miRNA let-7a可以直接抑制HEK293T细胞中ACVR1B基因的表达。     

组织微阵列方法检测let-7b在乳腺癌组织中的表达

目的:探讨let-7b在乳腺癌组织中的表达。方法:建立组织微阵列,应用原位分子杂交检测80例人乳腺癌组织和22例乳腺良性病变组织中let-7b的表达。结果:乳腺癌组织中let-7b阳性率为35.0%,低于乳腺良性病变组织中的59.1%(P0.05)。结论:let-7b低表达可以促进乳腺癌的发生、发展。     

miR let-7b抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移及其机制

目的： 观察miR let-7b对乳腺癌MCF-7细胞迁移能力的影响并探讨其作用机制。方法： 合成miR let-7b并转染乳腺癌MCF-7细胞,以miR-control作参照。通过划痕实验观察转染前后细胞迁移能力的变化,运用 PCR和蛋白质印迹法检测转染miR let-7b前后MCF-7细胞内IL-6表达水平的变化。最后通过信息生物学软件及双荧光酶素报告基因方法验证miR let-7b与IL-6结合。结果： 与对照组比较,转染miR let-7b的MCF-7细胞迁移能力明显降低,而anti-miR let-7b明显促进细胞迁移。转染miR let-7b的乳腺癌MCF-7细胞中IL-6的表达水平较对照组明显降低,而转染anti-miR let-7b的细胞内IL-6的表达水平明显提高。信息生物学软件和双荧光酶素报告基因证实miR let-7b与IL-6结合。结论： miR let-7b在转录水平抑制乳腺癌MCF-7细胞IL-6的表达从而抑制MCF-7细胞的迁移。     

MicroRNA let-7与肿瘤关系的研究进展

microRNA(miRNA)是一种长度约为22 nt的非编码的单链小分子RNA,作用广泛,与肿瘤的发生、发展密切相关。miRNA let-7是最早发现的miRNA之一,是线虫时序性发育的关键性调控因子,在哺乳动物中调节多种细胞的增殖、分化和凋亡,而且在正常组织和肿瘤组织中的表达显著不同,并参与肿瘤的发生、发展。现主要讨论let-7在肿瘤方面的研究进展。     

let-7和HMGA2在肺癌发生发展中作用的Meta分析

目的：采用Meta分析方法评价let-7低表达在肺癌预后中的作用及高迁移率旋蛋白A2（HMGA2）表达与肺癌关系的临床意义。方法：计算机检索PubMed、Web of Science、Medline、Cochrane Library、Google、Scholar、CNKI、CBM、万方和维普等数据库,收集关于let-7低表达与肺癌预后及HMGA2与肺癌发生发展的关联性研究,采用StataSE12.0软件进行Meta分析。结果：共纳入10篇关于let-7低表达与肺癌预后关系的文献用于Meta分析,均为非小细胞肺癌患者。let-7低表达预示着肺癌患者较差的总生存率,风险比（HR）的合并值为1.55（95% CI：1.16~2.09,P<0.05）。共纳入9篇关于HMGA2表达与非小细胞肺癌发生发展关系的病例对照研究用于Meta分析,肺癌组织中HMGA2表达阳性率明显高于癌旁正常组织（OR=5.92,95% CI：3.96~8.85,P=0.000）。HMGA2在肺癌组织的表达与肺癌TNM分期、有无淋巴结转移有明显关联（OR=0.26,95% CI：0.16~0.41,P<0.05;OR=0.29,95% CI：0.12~0.71,P<0.05）。结论：肺癌患者中let-7低表达是肺癌患者预后的危险因素。HMGA2表达阳性率越高,肺癌发生的概率就越高,越具有侵袭性。     

miRNA-451表达质粒的构建及对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响

目的：探讨miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响。方法：Hsa-miRNA-451序列通过miRBase数据库查找,根据此序列设计出2条寡核苷酸片段,将目的基因经过退火处理后克隆至真核表达载体pGenesil-1.1质粒中,从而构建成为miRNA-451真核表达载体（pGenesil-1.1-miRNA-451 质粒）。将 pGenesil-1.1-miRNA- 451 及pGenesil-1.1-control 质粒分别转染人A549肺癌细胞,经过G418的筛选,建立pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control 稳定表达的细胞株。流式细胞术分析检测细胞凋亡的情况;Transwell小室检测miRNA-451对细胞侵袭能力的影响;细胞划痕实验检测细胞的迁移情况。结果：经测序证实miRNA-451真核表达质粒构建成功,与未处理的人A549肺癌细胞和稳定表达 pGenesil-1.1-control 的细胞相比,稳定表达了pGenesil-1-miRNA-451的人A549肺癌细胞的侵袭和迁移能力均明显受到抑制影响,而细胞凋亡无明显变化（P >0.05）。结论：miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移具有显著的抑制作用,但对细胞凋亡作用不明显。