TLR2基因稳定沉默膀胱癌细胞株T739-TLR2△建立及生物学特征鉴定

目的 通过载体表达的RNA干扰技术(RNAi)阻断小鼠膀胱癌T739细胞TLR2基因的表达,建立TLR2基因稳定沉默的细胞株.方法 构建3种pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-TLR2重组质粒,脂质体法转染T739细胞,用RT-PCR法筛选干扰效果最强的重组质粒.再将该重组质粒转染T739细胞,用杀稻瘟菌素筛选抗性细胞克隆,即获得TLR2受体及其mRNA稳定表达最低的稳转细胞株,并鉴定其生物学特征.结果 测序结果显示设计合成的DNA片段已正确插入载体,将沉默效果最强的重组质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-TLR2转染T739细胞,筛选出有效沉默T739细胞TLR2基因表达的细胞株T739-TLR2△.TLR2 mRNA和受体表达分别下降95%和90%以上;T739-TLR2△细胞增殖指数降低、群体倍增时间延长,未发现明显凋亡细胞.结论 构建pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-TLR2重组质粒能稳定抑制T739细胞TLR2表达,可用于研究TLR2基因在T739细胞的功能与作用.     

基因的miRNA载体构建及其活性鉴定

目的 构建蛋白质精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)基因的miRNA真核表达载体,鉴定其转染乳腺癌MCF7细胞株后的生物活性.方法 根据PRMT2基因序列设计合成4对pre-miRNA片段,定向克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体上,采用菌落的PCR和测序分析鉴定插入序列的完整性;并将重组载体转染至MCF7细胞株中,采用Western blot方法鉴定重组载体转染MCF7细胞后对PRMT2蛋白表达的干扰效果以确定其生物活性.结果 构建的重组体插入片段的碱基序列完全正确,并且重组体瞬时定转染MCF7细胞后成功干扰PRMT2的表达.结论 成功构建了靶向PRMT2基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体,且在瞬时转染MCF7细胞后能下调PRMT2的表达.     

人NHE-1基因miRNA干扰载体构建、鉴定及干扰效应评价

目的构建人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）基因的miRNA特异性干扰表达载体并转染293细胞,筛选其有效性。方法设计4对miRNA oligo,依次通过退火、连接,构建含NHE-1前体miRNA的重组干扰质粒pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR和阴性对照质粒pcDNATM 6.2-GW/neg-miR,并转染293细胞,经Re-al-Time PCR评价干扰效应,筛选出干扰效应最佳的靶序列。结果测序证实目的片段正确插入载体中,成功构建4个人NHE-1基因miRNA干扰载体;Real-Time PCR证实完成干扰效应评价,并根据NHE-1基因转录调控区及其蛋白分子结构功能区评价结果,得到NHE1-4是最佳干扰片段。结论成功构建针对人NHE-1基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续NHE-1基因腺病毒miRNA表达载体的构建及其在调控APP裂解相关酶类的功能研究奠定了基础。     

小分子干扰RNA沉默肝癌细胞CDK2基因对RB、CyclinE、E2F1基因表达的影响

【目的】观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK2)基因后,细胞周期相关基因RB、CyclinE、E2F1在肝癌细胞SMMC7721中mRNA的表达。【方法】将前期研究中已构建成功并筛选出的最有效干扰抑制CDK2基因的siRNA序列片段,采用Lipofectamine TM2000脂质体转染法转染肝癌细胞株SMMC7721后分6组:重组质粒组190、重组质粒组191、SMMC7721肝癌组、转染试剂组、阴性对照组、空质粒组。采用实时荧光定量PCR法检测RB、CyclinE、E2F1 mRNA水平。【结果】CDK2的siRNA转染SMMC7721细胞后,RB基因mRNA表达上调,CyclinE、E2F1基因mRNA表达下调。【结论】抑制CDK2基因的表达能使肝癌细胞SMMC7721中RB基因mRNA表达上调,CyclinE、E2F1基因mRNA表达下调,提示肝癌细胞中RB、CyclinE、E2F1基因的表达与CDK2基因的表达具有明显的相关性。     

GDF5过表达与ZIP8基因沉默双重功能慢病毒载体的构建及鉴定

【摘要】目的 构建过表达生长分化因子5（GDF5）与基因沉默锌离子转运蛋白（ZIP8）的双重功能慢病毒载体, 检测其在诱导多能干细胞中的表达效率并建立稳定细胞系, 为骨关节炎的细胞治疗提供种子细胞奠定相关研究基础。方法 以人的GDF5 cDNA为模板合成GDF5全长序列, 设计合成靶向小鼠ZIP8的shRNA 序列, 依次分别与双酶切的载体pRNAU6.2相连, 构建双重功能慢病毒载体。将重组质粒及阴性对照质粒分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞, 收集病毒上清后感染iPSCs 细胞, 实时定量PCR和免疫印迹分别检测GDF5蛋白和ZIP8 mRNA的过表达与沉默效果。经G418筛选获得稳定高效表达GDF5与基因沉默ZIP8的诱导多能干细胞（iPSCs）稳定细胞株。 结果 成功构建了双重功能慢病毒载体pRNAU6.2-CMV-hGDF5-mshZIP8-U6, 经感染和G418筛选获得稳定表达高效表达GDF5与基因沉默ZIP8的iPSCs稳定细胞株。 结论 成功构建的pRNAU6.2-hGDF5-mshZIP8-U6慢病毒载体, 可有效上调GDF5 与下调ZIP8的蛋白和mRNA的表达, 成功建立稳定高效表达GDF5与基因沉默ZIP8的iPSCs细胞株, 为骨关节炎的细胞治疗建立可靠的细胞平台。     

人分化抑制因子3基因靶向微小分子RNA表达载体的构建及筛选

目的人分化抑制因子3(inhibitor of differentination 3,Id3)基因在A549细胞中的外源性表达能抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。文中旨在构建靶向人Id3基因的微小分子RNA(miRNA)表达载体,观察miRNA对A549细胞中Id3表达的下调作用,为进一步探讨Id3基因在A549细胞生长调控中的作用机制提供一定实验依据。方法依据miRNA设计原则,针对人Id3基因的mRNA序列,设计并合成编码miRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建含靶向人Id3基因的miRNA表达质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3),DNA测序验证后,采用Lipofectamine2000TM脂质体转染技术将该质粒导入A549细胞。荧光倒置显微镜下观察miRNA干扰质粒转染A549细胞后EGFP的表达情况,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测miRNA干扰后Id3mRNA及蛋白水平的表达。结果DNA测序表明重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3构建正确,将其成功导入A549...     

RNAi沉默IBP基因表达对乳腺癌细胞的抑制作用

目的 构建IRF-4结合蛋白(IBP)基因RNA干扰 (RNAi) 的真核表达载体,观察其对MDA-MB-231乳腺癌细胞内IBP基因表达及细胞增殖和侵袭力的影响.方法 以IBP为靶基因,以pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR质粒为载体,设计构建4对重组体,并进行DNA测序鉴定.重组载体转染MDA-MB-231细胞后,选择转染效果最好的1对重组体建立稳定转染的细胞株,经RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对IBP mRNA和蛋白表达的抑制效果;MTT法检测对各组细胞生长的影响;细胞体外侵袭实验测定对侵袭力的影响.结果 重组体测序结果与目的序列完全一致;重组体转染MDA-MB-231细胞后IBP的mRNA和蛋白表达降低约70%;IBP表达下调后乳腺癌细胞增殖减缓(P<0.05);同时体外侵袭实验显示转染后乳腺癌发生迁移细胞数明显低于未转染组和空质粒对照组[分别为(25±7)、(67±6)、(68±5),P<0.05].结论 下调IBP能有效降低乳腺癌细胞的增殖和侵袭力.     

Ｌｉｖｉｎ特异性ｓｉＲＮＡ表达载体在胃癌细胞中的稳定表达

目的:构建以Livin基因为靶基因的siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo/Livin,获得稳定沉默Livin基因的胃癌细胞SGC-7901/siRNA-Livin.方法:化学合成siRNA,Livin寡核苷酸,将其分别克隆进载体pGPU6/GFP/Neo,进行核酸序列测定.脂质体法转染SGC-7901细胞,半定量RT-PCR和Western blot检测Livin基因在SGC-7901细胞中的沉默效率,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆.结果:酶切分析显示,所有质粒均为阳性重组载体,核酸测序表明合成的序列准确插入pGPU6/GFP/Neo载体,G418筛选基因转染SGC-7901细胞后形成稳定克隆.其中pGPU6/GFP/Neo/Livin-4转染后Livin mRNA沉默效率大于70%.结论:成功获得Livin特异性siRNA表达载体,SGC-7901细胞Livin基因的表达受到抑制,转染胃癌细胞后获得SGC-7901/siRNA-Livin细胞克隆.     

siRNA介导的E2F-1基因沉默对胃癌细胞MGC803中Rb蛋白表达水平的影响

目的 应用RNA干扰技术研究E2F-1基因沉默在人胃癌MGC803细胞中对Rb蛋白表达的影响.方法 将重组质粒E2F-1-siRNA转染MGC803细胞,筛选稳定株,利用RT-PCR检测转染前后细胞E2F-1 mRNA表达水平,并通过蛋白免疫印记法（Western blot）检测各组细胞E2F-1蛋白的表达水平来验证质粒转入胃癌细胞的情况.采用Western blot检测三组细胞中总Rb蛋白和磷酸化Rb蛋白的表达情况,计算出非磷酸化Rb蛋白表达情况,统计各组间的差异.结果 重组质粒E2F-1-siRNA成功转入胃癌细胞中;有效抑制了E2F-1 mRNA的表达,E2F-1蛋白水平显著下降,与阴性对照组及未转染组相比分别降低了83.2%和84.6%,去磷酸化Rb蛋白分别增加了61.22%（P〈0.05）和66.60%（P〈0.05）,差异有统计学意义.结论 沉默表达E2F-1基因后,可以有效降低Rb蛋白的水平,促进其活化形式去磷酸化Rb蛋白的产生.     

HIF-1α基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建人HIF-1α的miR RNAi慢病毒载体.方法 利用已经构建成功的针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR,通过BP/LR反应,将EmGFP-HIF-1α-miR表达框整合重组到产毒质粒pLenti6/V5-DEST中测序鉴定,用PLP1、PLP2和PLP/VSVG质粒共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.结果 经测序鉴定证实成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒干扰载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α miR.结论 成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒RNA干扰载体.     

HyTK基因转导联合丙氧鸟苷对鼠膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的　探索HyTK基因转导丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对鼠膀胱癌细胞的影响。方法　脂质体介导法将PL(HyTK)SN质粒转染PA3 17细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,用逆转录病毒上清液感染T73 9细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,命名为T73 9 TK。RT PCR对T73 9 TK细胞进行鉴定。然后观察其在体外膀胱癌细胞的杀伤作用。结果　RT PCR证实HyTK基因已插入T73 9细胞并有其mRNA的表达 ,经不同浓度GCV处理后的T73 9 TK细胞均表现出有杀伤作用 ,而T73 9细胞在各个剂量的GCV作用下生长均良好。结论　GCV对转导了HyTK基因的T73 9细胞有显著杀伤作用     

自杀基因引导的旁观者效应对鼠膀胱癌的作用

目的研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSVtk)基因联合丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)治疗对膀胱癌的旁观者效应.方法用逆转录病毒载体HSVtk转染鼠源性膀胱癌细胞株T739,体外检测其对GCV的敏感性.将不同比例的T739和T739TK细胞共培养观察体外旁观者效应.在同基因鼠,将不同比例的T739和T739TK细胞混合建立膀胱癌腹腔肿瘤模型.当肿瘤B超显示0.5～0.8 cm,腹腔GCV给药6 d,然后观察肿瘤大小变化及动物存活时间.结果转染HSVtk基因的T739细胞对GCV的敏感性,RT-PCR分析证实TK基因mRNA的表达.细胞混合培养发现,当T739TK细胞占10%强时就可显示出明显的旁观者效应.在GCV的作用下,动物体内肿瘤生长受到显著抑制,动物存活时间明显延长,证明存在体内旁观者效应.结论转染HSVtk基因的鼠膀胱癌细胞可引导产生体内外旁观者效应,这种效应有助于加强 HSVtk/GCV系统对膀胱肿瘤的抗癌作用.     

稳定表达人MUC1小鼠膀胱癌细胞株和荷瘤鼠模型的建立

目的建立稳定表达人MUC1，1739小鼠膀胱癌细胞株和荷瘤小鼠模型。方法通过脂质体介导人MUC1全长eDNA转入T739小鼠膀胱癌细胞中，G418筛选及克隆化培养，基因组PCR、RT-PCR、免疫组化、流式细胞仪检测；皮下注射转染细胞，建立皮下荷瘤鼠模型，观察转染细胞体内外生长特性。结果MUC1成功转入BST739细胞中并主要表达在细胞膜和细胞浆。转染细胞体内外生长特性无明显改变。结论建立稳定表达人MUC1739小鼠膀胱癌细胞株和T739荷瘤小鼠模型，可用于肿瘤疫苗研究。     

逆转录病毒介导HSV-TK基因治疗膀胱癌及旁观者效应的观察

目的 观察HSV—TK／GCV治疗膀胱癌的体内效果及旁观者效应。方法 用逆转录病各感染鼠源性膀胱癌细胞T739，以不同比例的T739和T739TK细胞建立膀胱癌腹腔肿瘤模型，同时，在背部皮下以母代细胞T739建立皮下肿瘤，观察GCV治疗俯后肿瘤大小变化及动物存活时间。结果 动物存活时问随基因转移效率提高而延长，腹腔肿瘤生长受到抑制，背部肿瘤在50％以上转移效率时肿瘤生长缓侵。结论 HSlV—TK／GCV对膀胱癌的体内杀伤效应随基因转移效率提高，并存在远距离旁观者效应。     

人反义VEGF_(121) cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法将VEGF121反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达,ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121 cDNA质粒表达重组质粒。VEGF121反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达,转染后肿瘤细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达都明显减少;转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。结论成功构建了反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖,为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

体内转导逆转录病毒HSVtk基因对鼠膀胱癌生长的影响

目的:观测瘤体和腹腔内注射逆转录病毒载体HSVtk基因对膀胱癌的作用.方法:用鼠膀胱癌细胞(T739)分别建立鼠背部和腹腔肿瘤模型.含HSVtk基因的病毒上清瘤体和腹腔内注射,联合丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)治疗观察肿瘤大小及动物存活时间.结果:接种后约1周所有动物长出肿瘤.HSVtk/GCV处理后,组织原位杂交显示瘤细胞内HSVtk基因mRNA表达.背部和腹腔肿瘤生长明显受到抑制,动物平均存活时间延长(P＜0.05)结论:瘤体和腹腔内注射逆转录病毒载体能将HSVtk基因导入膀胱癌细胞,联合GCV治疗显示出较强的抑瘤效应.     

野生型p53基因调控膀胱移行细胞癌中心体异常的实验研究

 目的研究野生型p53基因抑制膀胱癌细胞中心体异常的作用。方法将野生型p53基因重组腺病毒载体转染人膀胱癌细胞T24,应用免疫荧光化学法检测膀胱癌细胞中心体异常变化情况。结果野生型p53基因可抑制膀胱移行细胞癌T24细胞中心体异常。结论p53基因可能是膀胱移行细胞癌中心体异常的一个重要调控因子,p53基因失活可能引起肿瘤细胞染色体不稳,从而促进肿瘤的发生和发展。     

DDX46基因慢病毒载体的构建及其在人膀胱癌细胞中的表达

目的 构建DDX46基因低表达慢病毒载体,并检测其在人膀胱癌细胞中的表达效果,为DDX46基因在人膀胱癌细胞中的研究奠定基础.方法 应用实时荧光定量检测5637细胞和T24细胞中DDX46 mRNA表达水平,以寻找合适的细胞系进行实验.分别以DDX46基因序列和普适型阴性序列为模板,设计合成靶点序列,并合成寡核苷酸双链,定向克隆到慢病毒质粒GV115,合成重组质粒shDDX46和shRNA,分别称之为实验组和对照组.将不同重组质粒与pHelper 1.0和pHelper 2.0分别转染293 T细胞以包装成慢病毒颗粒后感染5637细胞和T24细胞.应用实时荧光PCR定量检测重组慢病毒感染5637细胞和T24细胞后DDX46mRNA表达水平,判断其干扰效率.结果 5637细胞和T24细胞均高丰度表达DDX46mRNA,其结果(用ΔCt值表示)分别为(6.53±0.08)和(8.48±0.11);重组慢病毒感染膀胱癌细胞后,在5637细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.32±0.01),低于对照组(1.00±0.10),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为67.70％;在T24细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.11±0.01),低于对照组(1.00±0.03),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为89.00％.结论 成功构建DDX46基因低表达慢病毒载体,为研究DDX46基因在膀胱癌细胞中的作用奠定了基础.