重组杆状病毒表达轮状病毒SA11毒株VP4蛋白

从培养的SA11病毒中提取病毒dsRNA作为模板，经逆转录、多聚酶链反应（RT-PCR）获得编码VP4蛋白的全基因，全长2362bp.完整的VP4基因克隆到杆状病毒转移载体pVL-1393中，转染Sf9细胞进行同源重组，用声、杂交法筛选出表达VP4蛋白的重组杆状病毒。表达的VP4蛋白能被抗轮状病毒抗体所识别，表达产量约占总蛋白的10％。用表达的VP4蛋白免疫动物后可产生高水平抗亲本SA11毒株中和抗体。抗体能阻断SA11病毒在MA104细胞上引起的细胞病变（CPE），免疫荧光和Westernblot也证实抗体可特异性识别轮状病毒抗原。结果表明，重组杆状病毒表达的VP4蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，可望用VP4基因研制轮状病毒重组疫苗和亚单位疫苗。     

重组杆状病毒的构建及其产生HPV4病毒样颗粒

为得到HPV4病毒样颗粒（VLPs)，用EcoR I、Bam H I双酶酶切克隆载体pUHPV4-L1并回收1.5kb L1片段；将L1基因定向插入穿梭质粒pVL1 392中并与线形BaculoGold^TM DNA共转染昆虫细胞Sf-9，经胞内同源重组获得重组杆状病毒。对该重组病毒在细胞内的基因转录与表达进行检测得知，L1基因可特异性转录并表达一54.57ku特异性蛋白。该蛋白经透射电镜观察，呈现众多直径为50nm的圆形颗粒，为重组杆状病毒在胞内产生的HPV4 VLPs。     

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的形成

目的：在昆虫细胞中同时表达HCV的核心蛋白C和包膜蛋白(E1、E2)以形成病毒样颗粒(VLP)。方法：利用PCR技术得到HCV的核心蛋白和包膜蛋白基因，用基因重组技术分别构建表达HCVC、E1和E2蛋白的重组杆状病毒，用SDS-PAGE电泳分析HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达。电镜观察昆虫细胞内VLP的形成。结果：得到了能表达HCVC蛋白和同时表达E1、E2蛋白的重组杆状病毒reBV／C和reBV／E1、E2。reBV／C和reBV／E1、E2共感染的昆虫细胞同时表达了C、E1和E2蛋白，分子量分别为20kD，35kD和66kD。电镜观察到表达HCV结构蛋白的昆虫细胞质中存在大量的直径为40～60nm的VLP，对照细胞无此结构。结论：在昆虫细胞中表达的HCVC、E1和E2蛋白可自行装配成HCV样颗粒。     

诺如病毒病毒样颗粒的表达及其与HBGAs受体的结合研究

目的:以杆状病毒为载体,在昆虫细胞sf9中表达GⅡ-4型野生株诺如病毒(Norovimses,NOV)GZ121的衣壳蛋白ORF2,并验证其与组织血型抗原(Histoblood group antigen,HBGAs)受体的结合活性.方法:双酶切质粒PMD18-T-GZ121 ORF2酶切,连接人线性化载体PFastB...     

杆状病毒表达系统的发展

真核细胞表达系统包括昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞表达系统.而昆虫细胞表达系统,即杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector Systems,BEVS),以其表达量大、可携带较大的基因片段和表达产物功能活性好等方面的优越性而得到了广泛的应用.该系统以杆状病毒为载体,可以用于表达有应用价值的外源基因,也可利用基因工程技术将外源基因引入杆状病毒基因组,生产增强杀虫能力的杆状病毒杀虫剂,并且还可以用于以杆状病毒作为载体的基因治疗,为农业、制药、生物医学等有重要意义的基因研究和生产提供了一种新型、高效的表达系统.     

杆状病毒表达系统的发展

真核细胞表达系统包括昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞表达系统。而昆虫细胞表达系统，即杆状病毒表达系统（Baculovirus Expression Vector Systems，BEVS），以其表达量大、可携带较大的基因片段和表达产物功能活性好等方面的优越性而得到了广泛的应用。该系统以杆状病毒为载体，可以用于表达有应用价值的外源基因，也可利用基因工程技术将外源基因引入杆状病毒基因组，生产增强杀虫能力的杆状病毒杀虫剂，     

轮状病毒感染致多系统损害93例分析

轮状病毒(RV)是婴幼儿秋冬季腹泻的主要病源之一.近年来RV在感染肠道的同时致多系统损害的病例逐渐增多,这提示RV可能因抗原变易而存在新的感染机制及靶器官,作者将近3年内RV致多系统损害93例,报告如下:     

蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统的表达与鉴定

目的探讨蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中的表达。方法PCR扩增蛇毒cystatin基因,将其克隆到pFastBacHTc中,通过转化E.coliDH10Bac筛选克隆,抽提重组Bacmid/cystatin,后者经Cell-fectin介导转染Sf9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达,SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定表达蛋白66。结果获得重组cystatin的杆状病毒,Sf9细胞能表达出与蛇毒cystatin单抗、5×His单抗结合的蛋白,相对分子质量约15 kD。结论蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中成功表达。     

小儿轮状病毒肠炎多系统损害的临床研究

目的：分析探讨小儿轮状病毒（RV）肠炎多系统损害的临床特点和疗效。方法选取于该院采用综合治疗法的76例小儿轮状病毒肠炎患儿,收集其临床资料并做回顾性分析,将其治疗效果与同时期采用常规治疗法的76患儿进行对比。前者为治疗组,后者为对照组。结果治疗组76例患儿经治疗后,消化道症状均有所改善。42例伴心肌损害者经治疗1周后,39例患儿的心电图、血心肌酶谱,均恢复至正常,3例患儿治疗1周后,心电图仍然显示T波异常,自动出院14 d后,门诊复查3例患儿心电图均恢复正常。经研究后发现,治疗组中共有75例患者治疗有效,总有效率为98.7%,对照组中有66例患者治疗有效,总有效率为86.8%。两组患者在治疗效果上存在较大差异有统计学意义（P〈0.05）。结论增强胃肠道外其它系统的检查,可对小儿轮状病毒肠炎患者的各种合并症,进行及时的发现与治疗。     

家蚕近交系遗传纯度的RAPD检测

目的分析家蚕近交系IS-c108A的遗传纯度,为家蚕实验动物化的培育工作提供指导。方法应用经过筛选的20条随机引物对家蚕近交系IS-c108A(F10)的3个蛾区各30个个体和该近交系的亲本系统c108、对照实用化品种871各30个个体的基因组DNA进行RAPD扩增,计算个体间和蛾区间的相似系数及遗传距离。结果家蚕近交系IS-c108A(F10)的3个蛾区内的多态性带频率分别为1.807%、1.841%、1.841%,平均为1.830%;起点亲本c108个体间多态性带频率为7.207%,对照品种871个体间的多态性带频率为7.08%;而近交系IS-c108A与c108之间的多态性带频率为49.20%,c108和871品种之间的多态性带频率为58.33%。家蚕近交系IS-c108A10的3个蛾区内个体之间遗传相似系数的平均值分别为0.99581、0.99555、0.99551,总平均为0.99562。结论家蚕近交系IS-c108A(F10)已具有较高的遗传纯合度,家蚕具有易于获得高纯的有利条件。     

家蚕作为模式生物在现代生物学中的应用

家蚕作为鳞翅目昆虫的典型代表和理想的生物学模型对动物科学的发展起到了巨大的推动作用,其特殊突变已经成为现代遗传工程研究的优良材料。随着家蚕全基因组框架图和精细图制作的完成,家蚕将成为后基因组时代生命科学研究领域较为理想的模式生物。本文综述了家蚕对现代遗传学的贡献,分析了家蚕作为模式生物在发育生物学、生物反应器和基因组分子平台建设等研究领域的现状,论述了家蚕作为模式生物的在现代生物学领域的应用前景。     

Resveratrol elongates the lifespan and improves antioxidant activity in the silkworm Bombyx mori

A number of research has shown that the plant polyphenol resveratrol, one of the most prominent small molecules, has beneficial protective effects in multiple organisms, including worms, flies, and killifish. To understand the effects of resveratrol on lifespan, we evaluated its effects in the silkworm Bombyx mori. In this study, we found that lifespan was significantly prolonged in both female and male silkworms treated with resveratrol. Silkworm larval weight was significantly increased from day 3 of the 5th larval instar (L5D3) to day 7 of the 5th larval instar (L5D7). However, the weight of the pupa, cocoon, and total cocoon was not significantly different in female silkworms with resveratrol treatment than that in controls. Meanwhile, resveratrol significantly improved the thermotolerance of the silkworms, which enhanced their survival rate. Moreover, antioxidant activity was increased by resveratrol in both female and male silkworms. Furthermore, an antioxidant-related signalling pathway, SIRT7-FoxO-GST, was activated in silkworms with resveratrol treatment. Collectively, these results help us to understand the molecular pathways underlying resveratrol induced pro-longevity effects and indicate that silkworm is a promising animal model for evaluating the effects of lifespan-extending drugs.     

家蚕蚕蛹基因LOC101743840的原核表达、免疫学鉴定及生物信息学分析

目的原核表达家蚕蚕蛹LOC101743840(以下简称LOC)基因,鉴定LOC蛋白的免疫学特性,并进行生物信息学分析。方法将合成的家蚕蚕蛹LOC基因(gi|512917985)连接至克隆载体p MD18-T,用限制性内切酶Xho I和Bam H I分别对p MD18-T-LOC阳性质粒与原核表达载体p ET-28a双酶切,构建重组表达质粒p ET-28a-LOC并转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达(经IPTG诱导);用Western blot鉴定重组LOC蛋白的免疫活性;用Clustalw2和MEGA5工具包分析LOC的基因;用Prot Param Tools预测LOC蛋白的理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构。用IEDB、Preprod和DNAStar预测其细胞抗原表位。结果成功表达了家蚕蚕蛹LOC基因,其开放阅读框768 bp,编码255组氨基酸;由E.coli BL21(DE3)原核表达的重组LOC蛋白为可溶性,分子量约33 k D;Western bolt结果显示重组LOC蛋白可特异性结合家蚕蚕蛹过敏患者血清中的特异性Ig E;家蚕蚕蛹LOC与脐橙螟LOC106139919(gi|913330692)蛋白的同源性为69%。系统进化树显示家蚕蚕蛹与美国白蛾亲缘关系比较近。理化性质预测结果显示LOC蛋白质不稳定。蛋白质结构预测结果显示LOC主要的结构为无规则卷曲。T细胞抗原表位预测得到8个肽段(9-17、79-87、93-102、104-115、124-132、152-160、223-231和244-251)。B细胞抗原表位预测得到个5肽段(34-49、59-74、127-142、202-217和213-228)。结论成功表达了家蚕蚕蛹LOC,并证实重组LOC蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究家蚕蚕蛹蛋白的结构成分、免疫学特性及理化性质提供了实验数据。     

人生长激素基因组DNA在家蚕BmN细胞中的瞬时表达

目的 :探讨内含子对外源基因在真核细胞中表达的作用。 方法 :直接将含有 4个内含子和自身信号肽的 1.5 kb全长人生长激素基因直接克隆至真核表达载体 pc DNA3.0 ,然后利用脂质体转染家蚕 Bm N细胞 ,收取细胞上清 ,PAGE电泳和Western印迹分析鉴定表达产物 ;将全长基因序列、缺失第 1内含子基因序列和 c DNA序列的表达载体 ,分别转染细胞后检测各片段表达产物之间的差异。结果 :测序结果表明人生长激素基因组 DNA在细胞内正确转录、剪接。蛋白质电泳分析和免疫学检测证明转染细胞能够有效合成并分泌蛋白质。 EL ISA检测发现 3种基因片段中 ,全长的基因序列在表达效果上要高于后两者 (P<0 .0 5 ) ,其中缺失第 1内含子的序列表达效率较 c DNA序列明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :在家蚕细胞中能够正确表达带有自身内含子和信号肽的人源蛋白基因 ;推测基因的内含子在成体的外源基因表达过程中起着更为重要的作用     

重组截短型人角质细胞生长因子1在昆虫细胞中的表达

目的：探讨重组截短型人角质细胞生长因子1（rhKGF1_d23）蛋白在昆虫细胞中表达的可行性,为rhKGF1_d23蛋白的生产提供新的途径。方法：PCR法扩增昆虫偏爱密码子优化截短序列kgf1_d23亚克隆到pFastbac载体。在辅助质粒的作用下,pFastBac-kgf1_d23载体Tn7片段转座到Bacmid 中mini-attTn7位点,得到穿梭载体Bacmid-kgf1d23,并通过脂质体法转染sf-9细胞得到杆状病毒P1。继续转染细胞扩增病毒并提高病毒滴度,蛋白表达分析从P3代病毒转染细胞开始,收集细胞超声裂解后进行纯化,MTT法检测纯化后目的蛋白生物活性。结果：昆虫偏好密码子改造的kgf1_d23基因构建进转移载体pFastBac-kgf1_d23和穿梭载体Bacmid-kgf1_d23载体中。SDS-PAGE 结果表明,重组蛋白在60 h后开始大量表达,优化的收获蛋白时间在84～96　h;利用肝素亲和层析和SP阳离子交换层析可以去除90%以上的杂蛋白。纯化的rhKGF1D23蛋白在0.3~25.0 μg•L^-1时,随浓度的增加HaCat细胞的促有丝分裂能力增强,在25.0 μg•L^-1时达到平台期。结论：重组截短型角质细胞生长因子rhKGF1_d23蛋白在昆虫细胞中得到表达,保持其特有的肝素亲和特性,并具有免疫原性及细胞生物学活性。     

利用杆状病毒载体高效表达人胰岛素样生长因子-1及其纯化的研究

目的:利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中研制有生物学活性的重组人胰岛素样生长因子-1(rhIGF-1).方法:将15kDhIGF-1前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移载体pBakPAK8中,构建重组病毒BmNPV/IGF-l.用BmNPV/IGF-1感染家蚕幼虫,提取家蚕血淋巴液,采用亲和层析法纯化rhlGF-1,ELISA法测定rhIGF-1含量,用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定rhIGF-1纯度及免疫学活性,MTF法观察其对MCF-7细胞增殖的影响.结果:ELISA测定显示,BmNPV/IGF-1感染家蚕幼虫120h rhIGF-1含量达最高值(23.36μg/ml).rhIGF-1纯度为40%,Westem-blot分析发现主要纯化产物为7.5 kD成熟hIGF-1.细胞活性刺激实验显示,纯化后rhIGF-11对MCF-7细胞促增殖能力明显优于来源于大肠杆菌的rhIGF-1产品.结论:实现了具有免疫学活性及生物学活性rhlGF-1在杆状病毒表达系统的高效表达,并使rhIGF-1得到初步纯化.     

重组人Versican G1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的：利用杆状病毒．昆虫细胞表达系统制备人蛋白聚糖Versican G1区(VG1)的重组蛋白。方法：将编码人VG1蛋白343个氨基酸的基因插入pFastBacl载体，转化大肠杆菌DH10Bac，提取重组Bacmids转染Sf9昆虫细胞，获取含重组人VG1蛋白的杆状病毒进一步感染昆虫细胞进行蛋白表达。通过Ni—NTA层析柱对重组蛋白进行纯化。免疫印迹方法对昆虫细胞培养上清中的蛋白成分进行鉴定，采用透明质酸结合实验确定重组人VG1蛋白的生物活性。结果：人VG1基因在昆虫细胞中获得高水平表达，重组人VG1蛋白具免疫原性和与透明质酸结合的生物活性。结论：昆虫细胞表达的重组人VG1蛋白具有良好的免疫原性和生物活性。     

逆转录病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染标记间充质干细胞

目的:为使间充质干细胞(MSCs)被绿色荧光蛋白(GFP)稳定标记,探讨通过逆转录病毒载体介导的GFP基因高效转染MSCs的方法,以便为研究在体干细胞分化奠定基础。方法:全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs,利用携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒(R t-GFP)转染MSCs,荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs。结果:R t-GFP转染后,80%~90%MSCs可激发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。结论:R t-GFP可以使MSCs获得长效稳定标记。