人APE1/Ref-1基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒pcDNA3.1 APE1,以期进一步研究该基因对细胞DNA损伤的保护作用.方法 采用RT-PCR法定向克隆人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段,构建pGM-T Easy/APE1质粒,测序鉴定APE1/Ref-1基因cDNA序列正确后,将目的片断亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1 上,构成pcDNA3.1 APE1表达质粒,并用Western blotting法检测转染人脐静脉内皮细胞APE1/Ref-1蛋白的表达水平.结果 经酶切及测序证实APE1/Ref-1基因真核表达质粒pcDNA3.1 APE1构建成功,Western blotting法检测到转染pcDNA3.1 APE1后,细胞内APE1/Ref-1蛋白表达明显增加.结论 成功构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒,为探讨APE1/Ref-1对细胞电离辐射损伤的保护作用奠定了基础.     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

人CXC型趋化因子受体CXCR6真核表达载体的构建及生物学功能研究

目的:克隆和构建带人CXC型趋化因子受体6(CXCR6)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+).CXCR6,分析瞬时转染CXCR6基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响.方法:Trizol一步法抽提人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR扩增CXCR6全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体peDNA3.1(+),酶切鉴定.将构建好的pcDNA3.1(+)-CXCR6瞬时转染.MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达.利用微孔隔离小室检测转入人CXCR6基因的MDA-MB-231细胞的迁移能力.结果:扩增出人CXCR6基因全长,测序结果和GenBank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+).瞬时转染pcDNA3.1(+)-CXCR6显著增强MDA.MB-23l细胞的迁移能力.结论:成功构建带有人CXCR6基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CXCR6,为CXCR6在肿瘤学中的研究奠定基础.     

人重组Oct3／4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株（SKOV3）,观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418（neomycin）筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量（10.225±0.987）显著高于转染对照组（1.713±0.896）和阴性对照组（校正值为1）（P＜0.01）.结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

人重组Oct3/4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株(SKOV3),观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418(neomycin)筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量(10.225±0.987)显著高于转染对照组(1.713±0.896)和阴性对照组(校正值为1)(P＜0.01).结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

uPA和PAI-1基因克隆及真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆人卵巢上皮癌组织uPA和PAI-1基因cDNA全长,构建表达uPA和PAI-1基因的真核表达载体。方法：采用RT-PCR技术从人卵巢上皮癌组织总RNA中逆转录uPA和PAI-1基因的cDNA全长,克隆到pGEM-TEasy Vector上,通过酶切和测序进行鉴定;酶切后与真核表达载体pcDNA3.1/myc-his（-）B连接,酶切及测序再次鉴定;采用脂质体法将重组质粒DNA转染至卵巢癌上皮细胞SKOV3细胞;采用有限稀释法和G418分别加压筛选并培养SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞及对照细胞;Western blot法检测转染前后SKOV3细胞uPA和PAI-1基因的表达。结果：成功扩增出uPA和PAI-1基因的cDNA的全长,并克隆入T载体,DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3.1-uPA和pcDNA3.1-PAI-1,Western blot能检测到uPA和PAI-1基因蛋白分别在SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞中的表达。结论：成功构建了uPA和PAI-1表达基因的真核表达载体,为进一步研究uPA和PAI-1基因在卵巢癌侵袭转移中的作用提供了实验基础。     

cdx2真核表达质粒的构建

目的：构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法：从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果：酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论：成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ的构建和鉴定

目的 构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基(macaca mulatta chorionic gonadotrophin β subunit,rmCGβ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达.方法 通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA.结果 经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,通过RT-PCR方法 证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达.建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ.结论 成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因,构建angioarrestin基因的真核表达载体.方法:从人肝cDNA文库中经PCR扩增出angioarrestin基因及其C-端FD domain,经纯化、回收目的片段,将其插入克隆载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B,构建重组质粒pcDNA3.1-ARP和 pcDNA3.1-FD,稳定转染大细胞肺癌NCI-H460细胞,RT-PCR和Western印迹法鉴定.结果:从人肝cDNA文库中扩增出1 473 bp的angioarrestin目的片段及其C-端560 bp FD domain,构建的重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD 经PCR及酶切鉴定与预期相符,经RT-PCR和Western印迹法确定稳定转染NCI-H460细胞成功.结论:成功构建了angioarrestin 和C-FD基因的真核表达重组质粒并转染NCI-H460细胞,为angioarrestin抗肿瘤血管形成作用机制的研究奠定了初步基础.     

血红素氧合酶-1基因真核表达载体的构建及其在大鼠腹膜间皮细胞中的表达

目的 构建大鼠血红素氧合酶-1(HO-1)真核表达载体,并以该重组表达载体体外转染培养的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs).方法 从SD大鼠脾脏中提取总RNA,并经RT-PCR扩增HO-1基因的CDS区全长片段,将PCR产物克隆至pMD-18T载体,BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切后获取HO-1片段,用T4DNA连接酶将HO-1片段与双酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(-)连接,构建大鼠HO-1真核表达载体pcDNA3.1(-)-HO-1.酶切鉴定和测序验证后,利用脂质体介导将重组质粒转染原代培养的RPMCs,通过RT-PCR和Western blotting检测RPMCs中HO-1的表达.结果 成功克隆了大鼠HO-1基因并构建了其真核表达载体pcDNA3.1(-)-HO-1,酶切鉴定证实基因正确地插入表达载体中,并经DNA测序验证.pcDNA3.1(-)-HO-1转染RPMCs后,经RT-PCR和Western blotting检测,HO-1在RPMCs中获得高效表达.结论 HO-1基因真核表达载体的成功构建以及HO-1在RPMCs中的高效表达,为进一步研究HO-1在腹膜透析所致RPMCs损伤中的作用奠定了基础.     

AKTIP基因真核表达载体的构建及其在GES-1细胞中的表达

目的:构建人蛋白激酶B相瓦作用蛋白(AKTIP)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,观察其在GES-1细胞中的表达.方法:从健康人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增AKTIP cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,经酶切鉴定及DNA测序证实后,应用脂质体将AKTIP基因转染入人胃黏膜细胞株GES-1细胞中,通过Western Blot检测其在GES-1细胞中的表达情况.结果:重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误,Western Blot结果显示AKTIP基因在GES-1细胞具有良好的表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1/myc-His(-)A-AKTIP真核表达载体,并成功地在GES-1细胞中进行了表达,为进一步研究AKTIP的功能和结构奠定了基础.     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

Decorin基因过表达对HEK293T细胞微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达的影响

目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN)重组质粒,研究其对微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达的影响.方法:从人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)提取总RNA,经RT-PCR获得decorin的全长cDNA,克隆至T-载体pUM-T并测序,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,再次测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,利用RT-PCR、Western Blot方法检测空载体组和重组质粒转染组微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1转录水平及翻译水平的表达.结果:经DNA测序证实人DCN cDNA片段正确插入真核表达载体中.Western Blot结果显示经磷酸钙共沉淀法转染的HEK 293T细胞中目的基因高表达.RT-PCR和Western Blot结果显示,与空载体组相比,重组质粒转染组LC3转录水平显著降低,beclin1和LC3-Ⅱ的翻译水平均显著降低.结论:成功构建人DCN重组质粒,其在HEK 293T中过表达可以显著降低微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达,为进一步研究DCN与自噬的相互作用奠定了基础.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

人低氧诱导因子1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒及其在人肝癌细胞(HepG2)中的表达。方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过RT-PCR逆转录,获得HIF-1α的cDNA,双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列。用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α转染至HepG2,以免疫荧光和Western Blot法分别对转染细胞进行HIF-1α表达分析。结果:扩增出HIF-1α全长cDNA,构建真核表达质粒,测序结果正确。经检测的质粒转染至HepG2细胞后,HIF-1α蛋白水平高于转染空载细胞。结论:成功构建人HIF-1α基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,并证明其能在HepG2细胞内表达。     

hCTGF基因真核表达载体的构建及在HUVECs中的表达鉴定

目的 构建人结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体，并在哺乳类细胞人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中获得表达。从而为进一步研究CTGF基因在血管新生的作用打下基础。方法 根据人CTGF基因的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有Xba Ⅰ和HindⅢ酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法扩增JIVECs中CTGF，回收PCR产物，并将其连接至克隆载体PIM-18中，重组的PUMT-18在大肠杆茵DH5α内扩增后，经质粒提取、XbaⅠ和HinsⅢ酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有CTGFcDNA全长的酶切片段，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经XbaⅠ和HindⅢ酶切予以鉴定。并将其转染到HUVECs中，Western blotting法证实其表达。结果 RT-PCR产物含有CTGFcDNA，基因测序显示重组的PUMT-18中含有正确的人CTGFcDNA全长编码序列，重组的pcDNA3．1(-)含有人CTGFcDNA全长编码序列，Western blotting证实重组的真核表达载体在人脐静脉内皮细胞成功转染并表达。结论 成功构建人结缔组织生长因子CTGF基因的真核表达载体。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。