人凋亡相关新基因PNAS-4的克隆、原核表达与纯化

目的克隆人的凋亡相关新基因PNAS-4到原核表达载体,表达并纯化人的PNAS-4蛋白。方法用RT-PCR的方法从人肺腺癌A549细胞中扩增出人的PNAS-4基因。将其克隆到pGEX-6P-1载体,转化到大肠杆菌BL21。用IPTG诱导表达,并用亲和层析的方法纯化出人的PNAS-4蛋白;然后使用质谱分析鉴定纯化后的蛋白质。结果扩增出的人PNAS-4基因与GenBank上的序列完全一致。纯化的人PNAS-4融合蛋白在相对分子质量约50×103处可见特异性条带;经质谱鉴定证实所纯化的蛋白质为PNAS-4融合蛋白。结论成功表达和纯化了人PNAS-4蛋白,为今后对人PNAS-4基因的功能研究打下基础。     

人肿瘤抗原基因Delta-like4(DLL4)可溶性表达、纯化及鉴定

目的研究克隆肿瘤抗原人DLL4基因,与原核表达载体可溶性融合表达、分离纯化及其鉴定,并计划将其应用于DLL4特异性肺癌肿瘤疫苗研究过程中的抗血清滴度检测.方法采用PCR方法扩增DLL4多核苷酸序列,克隆入pMD-18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pGEX-KG原核表达载体,获得pGEX-KG-hDLL4载体.以该载体转化E.coli菌株BL21(DE3),IPTG诱导其表达,裂解大肠杆菌,以GSTrap亲和层析柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hDLL4基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因hDLL4.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hDLL4.结论融合蛋白GST-hDLL4在25℃,IPTG终浓度0.5 mmol/L条件下诱导表达,以GSTrap亲和层析柱纯化,获得纯化融合蛋白.采用SDS-PAGE,Western Blot的方法可检测到目的可溶性融合蛋白GST-hDLL4的表达.     

人源PDCD4全长及其MA3功能域的原核表达和蛋白纯化

目的:构建细胞程序性死亡因子4(PDCD4)及其MA3功能域的原核表达载体,并在体外表达及纯化蛋白。方法:提取胃癌细胞株7901总RNA,通过反转录获得c DNA,并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增PDCD4全长及MA3功能域基因片段,定向连接到p GEX-6P-1原核表达载体。将构建好的原核表达载体转化感受态大肠杆菌BL21,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,采用GST亲和层析的方法获得纯化蛋白,并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和免疫印迹鉴定。结果:PCR获得PDCD4全长及MA3基因片段,成功构建了p GEX-6P-1-PDCD4和p GEX-6P-1-PDCD4-MA3原核表达载体,并在体外表达纯化了GST-PDCD4全长和GST-PDCD4-MA3融合蛋白。结论:构建了PDCD4及其功能域的原核表达载体并在体外表达纯化了目的蛋白,为更好地研究PDCD4的功能奠定了基础。     

人肌球蛋白调节性轻链的原核表达及纯化

目的:构建pGEX-MLC2重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化谷胱甘肽硫转移酶(GST)-MLC2融合蛋白,以用于MLC2抗体的制备。方法:从人乳腺癌MCF-7细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得人MLC2cDNA全长开放读码框架(open reading frame,ORF),并将其重组于原核蛋白表达质粒pGEX-6P-1中,经限制性内切酶和DNA测序鉴定,将该重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21,用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC2融合蛋白后,进行Western blotting分析,鉴定GST-MLC2蛋白;通过GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳鉴定该融合蛋白的纯度。结果:人乳腺癌MCF-7细胞MLC2的RT-PCR产物为535 bp,符合预期;重组质粒pGEX-MLC2经BamHI和EcoRI双酶切出现特征性的525 bp片段;DNA测序证实MLC2全长ORF序列正确无误。IPTG诱导表达的GST-MLC2融合蛋白分子质量约为46.6 kDa,纯化后其蛋白纯度约95%,经Western blotting分析表明诱导表达的蛋白是GST-MLC2融合蛋白。结论:人MLC2蛋白原核表达质粒的构建、GST-MLC2融合蛋白的表达和纯化,为MLC2抗体的制备及MLC2功能的深入研究奠定了基础。     

人睾丸特异表达基因PIAS-NY 原核表达 和多克隆抗体的制备

目的 构建PIAS-NY-pET30a 原核表达载体,并诱导其成功表达,经纯化后获得高浓度的可溶性融 合蛋白His-PIAS-NY,免疫小鼠获得鼠源性PIAS-NY 多克隆抗体。方法 以人精原cDNA 文库为模板,通过 聚合酶链反应（PCR）扩增PIAS-NY 开放阅读框,克隆到pET30a 表达载体中,酶切、PCR 鉴定构建重组质粒。 测序完全正确后将质粒PIAS-NY-pET30a 转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行大量扩增,异丙基-β-D- 硫 代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。超声、离心、His-Ni 柱亲和层析纯化包涵体蛋白,依次经过不同浓度尿素进 行蛋白质复性,获得高浓度的可溶性His-PIAS-NY 融合蛋白。分6 次BalB/C 小鼠腹腔注射乳化纯化蛋白。 2 个月后小鼠眼球取血,收集血清。结果 成功构建原核表达质粒PIAS-NY-pET30a ;利用终浓度1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,大肠杆菌BL21 大量表达融合蛋白His-PIAS-NY,并以包涵体形式存在于菌体中;尿素 变性后His-Ni 柱纯化融合蛋白,复性后获得高浓度的可溶性蛋白His-PIAS-NY ;6 次免疫后收获存活小鼠 抗血清;酶联免疫吸附测定（ELISA）抗血清滴度达到1 ∶ 100 000 ;免疫印迹和免疫共沉淀证实PIAS-NY 抗血清能特异性识别293T 细胞和GC2 细胞中PIAS-NY 蛋白。结论 成功获得PIAS-NY 多克隆抗体,而且 具有高反应性和高特异性,PIAS-NY 在GC2 细胞和293T 细胞中表达,并且能够与RUVBL2 蛋白发生相互作用。     

小鼠Klf4基因的克隆及原核表达分析

目的 克隆Klf4基因并对其重组蛋白进行原核表达及分析.方法 提取胎鼠皮肤mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点引物,从该cDNA中扩增出Klf4基因编码区序列,将其克隆到pEasy-T3载体上.对质粒双酶切并回收其中Klf4基因片段后,克隆入pET-52b(+)载体后转化Origmai B(DE3)型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析.结果 对所克隆的Klf4 mRNA蛋白编码区的DNA序列分析表明,klf4 CDS区包括终止密码子在内为1452 bp,与参照序列对比仅有四处存在差异,不仅其同源性达到99.72%,且其氨基酸序列同源性为100%;在IPTG诱导下pET-52b(+)-Klf4重组质粒可表达与预期相符的约为57×103的蛋白质;经IPTG刺激后重组蛋白表达明显上调,其中IPTG为0.4 mol/L时效果最佳.结论 从胎鼠皮肤中克隆的Klf4基因可在原核中表达.     

组蛋白脱乙酰化酶4N-末端和C-末端片段的原核表达及纯化

目的 在大肠杆菌中分别表达组蛋白脱乙酰化酶4(HDAC4)N-末端(1-1950bp)和C-末端(1708-3255 bp)片段与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并进行纯化.方法 应用PCR方法扩增HDAC4 N-末端和C-末端片段,将目的基因插入GST融合载体pGEX-6P-1中,重组载体在酶切鉴定和序列测定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达GST-HDAC4-N'和GST-HDAC4-C'蛋白.经SDS-PAGE及Western blotting鉴定表达产物后,用谷胱苷肽琼脂糖珠纯化目的蛋白.结果 经测序、酶切鉴定证明成功构建了融合蛋白表达质粒,表达出的融合蛋白经SDS-PAGE分析其相对分子量约为110500和93080.Western blotting分析证实融合蛋白可以被HDAC4特异性抗体所识别.结论 成功构建了融合表达载体(pGEX-6P-1/HDAC4-N'和pGEX-6P-1/HDAC4-C'),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可以进一步用于HDAC4与其他蛋白质相瓦作用的研究.     

凋亡素原核表达载体的构建和表达

目的 构建凋亡素原核表达系统，以制备抗原物质凋亡素融合蛋白。方法 通过PCR方法，以pcDNA-VP3质粒为模板，扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点，构建成凋亡素的高效原核表达栽体pET-DsbA-VP3，将该质粒转化到大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导后，聚丙烯酰胺凝胶电泳出现38300的目的蛋白条带。结论 凋亡素原核表达栽体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm。经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别。结论成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm。大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.     

人乳腺珠蛋白基因亚型的原核表达及纯化

目的：克隆人乳珠蛋白（hMAM）编码全长cDNA，原核表达并纯化蛋白产物，为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础。方法：自乳腺癌组织及乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA，通过RT-PCR克隆hMAMcD-NA，构建pQF40-hMAM表达质粒，在大肠杆菌M15中表达，利用镍．亚硝胺乙酸组氨酸（Ni-NTA-His）亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果：乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAM cDNA亚型，即hMAM和hMAM（Isoform），长度分别为279和270bp，两者相差9个连续碱基，其翻译产物相差3个连续氨基酸残基；表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在，纯化后得到纯度为97％的目的蛋白。结论：获得hMAM cDNA并发现一个新的hMAM突变体；融合蛋白的表达及纯化成功。     

基因重组型人SORL1蛋白质片段的原核表达和纯化

目的制备基因重组型人SORL1蛋白质片段,为探讨阿尔茨海默病的发病机制提供实验基础。方法采用PCR方法扩增人sorl1 cDNA编码区5 923～6 260 bp片段,克隆入原核表达载体pET-28a(+)中。用大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达重组质粒,用液相色谱法纯化基因重组蛋白。结果 PCR扩增产物为358 bp,其ATG和TGA之间的结构与人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp区完全一致。基因重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中高效表达,其表达产物存在于包涵体组分中。纯化的基因重组蛋白在SDS-PAGE中表现为单一条带,表观分子量约为13 000。结论人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp片段在原核细胞中大量表达,纯化后的基因重组蛋白可尝试用于抗体的制备。     

重组人β防御素4的原核表达、纯化及抗铜绿假单胞菌活性初探

目的制备原核表达的重组人β防御素4(human beta defensin 4,HBD4),初步探讨其对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性.方法将编码HBD4的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET42a中,构建好的表达质粒pET42a-HBD4转化到表达菌株BL21(DE3)中,0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h,亲和纯化融合蛋白后经Western blot鉴定,再以肠激酶酶切融合蛋白,镍柱亲和层析分离HBD4;采用打孔法初测其抗铜绿假单胞菌活性,并用微量稀释法测定HBD4与3种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较其抗铜绿假单胞菌活性并异.结果 GST-HBD4在大肠杆菌中以可溶形式成功表达,纯化的重组HBD4体外对铜绿假单胞菌有抗菌活性,其效能略低于亚胺培南,而高于哌拉和环丙沙星.结论采用基因工程技术成功表达了重组HBD4,其对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性,具有烧伤创面感染治疗的应用前景.     

人Delta-like4~(ext)-93-217原核表达、纯化及蛋白活性检测

目的:原核表达、纯化融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217,并对其活性进行检测.方法:采用PCR方法扩增hDll4ext-93-217多核苷酸序列,克隆入pMD18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体,获得pET32a(+)-hDll4ext-93-217载体.以该载体转化E.coli菌株BL21,IPTG诱导其表达.以镍离子螯合柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达;采用萤光素酶报告基因系统检测目的蛋白活性.结果:通过PCR扩增获得了目的片段hDll4ext-93-217,成功构建了该蛋白的原核表达载体pET32a(+)-hDll4ext-93-217.采用SDS-PAGE,Western Blot等方法均可检测到目的可溶性融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217的表达.融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217在25℃,IPTG终浓度0.5mmol/L条件下诱导表达8h的蛋白表达量最高.以镍离子螯合柱纯化,获得纯化融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217浓度为1.5g/L,其荧光素酶报告基因的刺激活性与空白对照...     

人睾丸前列腺素D合成酶的原核表达

目的：将获得纯化的重组人睾丸前列腺素D合成酶（L－PGDS）用于基础和临床研究,方法：在原核表达系统中,用异丙基-β-D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组质粒pGEX-2T／htL-PGDS的表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠亲和并纯化重组融合蛋白GST／htL-PGDS,再用凝血酶裂解融合蛋白,从而获得纯化的重组L－PGDS。对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序,并对重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析,鉴定其是否为所需目的蛋白。结果：用IPTG诱导重组质粒pGEX-2T／htL-PGDS表达的最佳浓度为1mmol/L最佳时间为4h。在此基础上获得的融合蛋白用凝血酶裂解后获得单一纯化的重组蛋白L-PGDS,最佳裂解时间为2h。SDS－PAGE和DNA测序证实,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白,结论：用上述方法可获得纯化的人睾丸L－PGDS。     

Myosin-Vc特异性片段的原核表达及其抗血清的制备

目的 原核表达Myosin-Vc(Myo5c)蛋白并纯化,制备小鼠、家兔多克隆抗体,为探索MyoSc在病毒感染中的作用提供研究工具.方法 采用RT-PCR方法从人胃粘膜组织中克隆编码Myo5c特异性蛋白的基因片段,构建该片段与6×His标签的融合蛋白表达质粒pQE-31/Myo5c,原核表达与蛋白纯化后,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备Myo5c抗血清.采用ELISA检测抗体效价,Western blot和间接免疫荧光染色检验抗体特异性.结果 获得Myo5c特异性片段约42×103的纯化蛋白.ELISA检测小鼠和家兔抗血清效价分别为1:12 800、1:6 400.Western blot和间接免疫荧光染色显示所制备的抗体能特异性识别Myo5c.结论 获得Myo5c特异性蛋白,并成功地制备了Myo5c特异性的小鼠和家兔抗血清.     

重组人血小板因子4的表达、纯化及活性鉴定

目的: 用基因工程手段去获取有活性的重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步的基础理论研究和临床应用奠定基础.方法: 用PCR手段获得人PF4的编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,用SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白,用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验(CAM)验证rhPF4的活性.结果: 成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.CAM实验表明,经纯化获得的rhPF4对鸡胚血管形成具有抑制作用.结论: 成功地获得了具有高度生物学活性的rhPF4蛋白.     

人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定

目的 原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 通过PCR方法扩增人P311基因,利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-P311蛋白.结果 重组载体pGEX-4T-P311经酶切与测序鉴定证实构建成功.导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD左右,与预期值相符.该条带经免疫印迹检测鉴定为GST抗体阳性,获得了纯化的GST-P311蛋白.结论 构建了pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究P311的生物学功能奠定了基础.