Integrin介导的ERK信号传导通路对滋养层细胞侵袭行为的影响

目的：探讨Integrin介导的ERK信号传导通路在滋养层细胞侵袭过程中的作用.方法：利用人绒毛外细胞滋养层细胞体外侵袭模型,将不同浓度的integrin α1和integrin β1混合抗体分别加入绒毛外细胞滋养层细胞（EVCT）培养液中,培养4 h,观察integrin α1和integrin β1混合抗体对EVCT的生长、体外侵袭、FAK和ERK1/2磷酸化的影响.结果：integrin α1和integrin β1混合抗体呈浓度依赖方式抑制EVCT中FAK磷酸化程度,同样呈浓度依赖方式抑制磷酸化的ERK1/2表达,P〈0.05.结论：细胞外基质（ECM）成分能通过细胞表面的相应受体integrin α1β1,激活滋养层细胞中重要的蛋白激酶FAK和ERK.ERK信号传导通路对滋养层细胞的侵袭行为起到重要的调节作用.     

H2O2通过ERK通路抑制绒毛外细胞滋养层细胞的侵袭能力

目的 研究活性氧过氧化氢(H202)对绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)侵袭行为的影响及其信号传导机制.方法 建立EVCT体外培养模型,利用Transwell细胞侵入系统检测EVCT的体外侵袭作用,应用Western blot法评价细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)的活性变化,使用CCK-8测定细胞的生长状况.结果 与对照组比较,15 μmol/LH202和50 μmol/L PD98059均可显著抑制EVCT的侵入指数(分别为43.3±4.7,49.3±7.0)(P＜0.01),同时降低EVCT的ERK1/2磷酸化水平(P＜0.01),但并不影响EVCT的细胞活力(P＞0.05).结论 H202可能通过抑制ERK1/2的激活,进而影响EVCT的侵袭行为,参与子痫前期的发病机制.     

人绒毛外细胞滋养层细胞与蜕膜基质细胞共培养模型的建立

目的模拟体内环境,建立可保持绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)与蜕膜基质细胞(DSC)生物学特性的共培养细胞模型,应用于研究滋养细胞的侵袭行为。方法利用胰酶消化和BSA、Percoll梯度沉降,收集纯化人早孕绒毛组织的EVCT和DSC,分别放入Transwell的上下小室,观察该模型下细胞形态变化及侵袭特性,免疫组化、免疫荧光染色检测细胞的纯度。结果免疫组化显示EVCT的细胞角蛋白7阳性表达的细胞数占95%以上,阳性表达转化生长因子β2的细胞数占95%以上,DSC泌乳素阳性表达的细胞数也超过95%,证实共培养系统中EVCT和DSC纯度均在95%以上,且生物学特性得以维持。上室中的EVCT保持了其侵袭能力,在Matrigel包被的滤膜上EVCT的侵袭指数为3.22±0.04。结论适当的培养方法可获得高纯度的EVCT和DSC,并使其维持特有的生物学活性,成功地建立了共培养系统模型,便于研究滋养细胞侵袭和胚胎着床的机制。     

米非司酮对绒毛外细胞滋养层细胞人类白细胞抗原-G、E和F表达的影响

目的 探讨米非司酮对绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)的人类白细胞抗原(HLA)-G、E和F表达的影响.方法 选取正常妊娠6～9周的人绒毛组织,经胰蛋白酶消化、体外培养和纯化获得EVCT,采用RT-PCR方法检测孕酮、孕酮+米非司酮对体外培养的EVCT表达HLA-G、HLA-E、HLA-F mRNA水平的影响.结果 添加0.1 ng/L孕酮的EVCT其HLA-G、HLA-E、HLA-F mRNA水平明显增加,相对于无水乙醇组,分别增加3.3、1.3和1.3倍,差异有统计学意义(P＜0.05);而这种作用被共培养的相应浓度的米非司酮完全抑制.结论 米非司酮可在转录水平抑制孕酮诱导的滋养层细胞HLA-Ⅰb类基因(包括HLA-G、HLA-E、HLA-F)表达的上调.     

原代绒毛滋养层细胞的培养及转染研究

目的 探索绒毛组织滋养层细胞原代培养、纯化的有效方法及最佳转染方法.方法 分离妊娠7周内的人工流产胚胎的绒毛组织进行滋养层细胞的培养和纯化.用细胞免疫化学方法对培养细胞进行鉴定;用MTT实验方法绘制滋养层细胞的生长曲线;用细胞贴壁率找到最适pH;用细胞存活分数评价转染的最佳脂质体用量.结果 成功寻找到滋养层细胞原代培养和纯化的有效方法;细胞消化传代后的12～48 h滋养层细胞处于对数生长期,pH 6.8～7.0为培养液最适pH范围;并找到质粒转染滋养层细胞的最佳脂质体用量.结论 成功培养和纯化滋养层细胞,并找到滋养层细胞的最佳转染方法.     

采用体外侵袭实验分离侵袭性人原代肾细胞癌细胞

目的:体外分离肾细胞癌原代侵袭性和非侵袭性细胞.方法:消化法或植块法对32例临床新鲜肾细胞癌进行原代培养.在预实验确定铺胶浓度、消化回收时间的基础上,采用涂有Matrigel的Transwell对3例原代培养的肾细胞癌细胞进行体外侵袭实验,分离回收侵袭性和非侵袭性细胞.结果:(1)原代培养成功率为90.6%(29/32).(2)以1.0 mg/ml、20 μl/孔对Transwell铺胶,固定细胞悬液密度(5×105/ml),第5天消化回收细胞较为理想.非侵袭性细胞散在生长,侵袭性细胞多呈克隆样生长.侵袭性细胞倍增时间为36.1 h,非侵袭性细胞为50.6 h.结论:Transwell可体外快速分离及回收、培养不同侵袭性的肾癌原代细胞群.用原代肿瘤细胞进行体外侵袭实验代表性好,但难以突破肿瘤细胞的有限生存期.     

黏着斑激酶对ERK介导的滋养层细胞侵袭行为的调节作用

目的:探讨黏着斑激酶(FAK)在细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路介导的滋养层细胞侵袭中的作用.方法:利用人绒毛外细胞滋养层(extravillous cytotrophoblasts,EVCT)细胞体外侵袭模型,加入不同浓度的黏着斑激酶抑制...     

胰岛素样生长因子系统在人早孕绒毛滋养层细胞中的表达

目的　探讨胰岛素样生长因子系统 (IGFs)在体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞中的基因表达及其作用。方法　采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)技术半定量检测体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞中IGFs m RNA的表达。结果　体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞中可以检测出 IGF- m RNA、IGF- R m RNA、IGFBP- 3m RNA的表达。结论　 IGFs可能在早期细胞滋养层的侵入、增殖分化、胎盘形成和胚胎生长发育过程中以自分泌和 /或旁分泌方式发挥重要的调节作用     

丙型肝炎病毒持续感染对体外培养人胎盘合体滋养层细胞生物学性状的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）持续感染对体外培养人胎盘合体滋养层细胞生物学性状的影响。方法：分别采用Matrigel人工重建基膜侵袭实验、MTT法细胞黏附实验、细胞移动实验，研究HCVRNA阳性患者血清感染体外培养的人胎盘滋养层细胞侵袭力以及与侵袭力相关的黏附、移动能力的改变；检测培养上清中人绒毛膜促性腺激素（HCG）浓度以评估感染对细胞激素合成、分泌功能的影响。结果：感染组细胞侵袭、黏附、移动以及激素合成分泌功能较对照组均有显著下降（P〈0．05）。结论：HCV持续感染可抑制体外培养人胎盘合体滋养层细胞包括侵袭力和激素合成、分泌功能在内的多种生物学功能。     

TGFβ1，Bcl-2与妊娠期高血压疾病胎盘细胞凋亡的关系

目的:研究妊娠期高血压疾病患者胎盘组织的细胞凋亡以及TGFβ1和Bcl-2与细胞凋亡的关系,进一步探讨妊娠期高血压疾病发病机制.方法:收集妊娠期高血压疾病患者胎盘组织45例(15例妊娠期高血压,15例子痫前期轻度,15例子痫前期重度)和正常孕妇对照组45例.应用免疫组织化学染色法(SP法)检测胎盘绒毛滋养层TGFβ1和Bcl-2蛋白的表达;应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)检测胎盘绒毛组织中滋养层细胞凋亡情况,并测定凋亡率.结果:妊娠期高血压疾病组较对照组胎盘绒毛组织中滋养层细胞凋亡率及TGFβ1表达明显增高,而Bcl-2表达明显减低(均P＜0.01).随病情加重,妊娠期高血压组、子痫前期轻度组、子痫前期重度组细胞凋亡率及TGFβ1表达呈上升趋势,Bcl-2表达呈下降趋势(均P＜0.01).子痫前期重度组、子痫前期轻度组胎盘绒毛细胞凋亡发生率与TGFβ1呈正相关;与Bcl-2表达呈负相关(均P＜0.05).子痫前期重度组、子痫前期轻度组TGFβ1与Bcl-2表达呈负相关(均P＜0.05).结论:妊娠期高血压疾病胎盘细胞凋亡率明显增高,TGFβ1在滋养层细胞表达增高,Bcl-2在滋养层细胞表达降低,TGFβ1和Bcl-2平衡失调可能导致妊娠期高血压疾病的发生.     

胰岛素样生长因子系统在人早孕绒毛滋养层细胞中的表达

目的 探讨胰岛素样生长因子系统（IGFs)在体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞中的基因表达及其作用。方法 采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术半定量检测体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞中IGFsmRNA的表达，结果 体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞中可以检测出IGF-ⅡmRNA,IGF-ⅠRmRNA，IGFBP-3mRNA的表达。结论 IGFs可能在早期细胞滋养层的侵入，增殖分化，胎盘形成和胚胎生长发育过程中以自分泌和/或旁分泌方式发挥重要的调节作用。     

树突状细胞表面C型凝集素受体表达对绒毛外细胞滋养细胞生物学行为的影响

目的采用基因克隆技术构建C型凝集素受体（CLR）过表达／siRNA慢病毒载体,观察胎盘来源的树突状细胞表面CLR过表达或低表达对人绒毛外细胞滋养细胞（EVCT）侵袭力、黏附能力和凋亡的影响。方法通过质粒转染和RNA干扰技术获取过表达和低表达CLR基因的树突状细胞。将分离、培养及鉴定后的EVCT分别与过表达和低表达CLR基因的树突状细胞共培养（过表达组和低表达组）。采用体外侵袭试验、黏附能力实验和AnnexinV／PI双染法检测共培养对EVCT侵袭、黏附能力及凋亡的影响。以共培养前的EVCT作为对照组。结果过表达组EVCT的侵袭能力与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）,低表达组EVCT的侵袭能力明显弱于对照组（P〈0．01）。过表达组和低表达组与对照组的黏附率比值分别为（94．2±2．3）％和（52．8±1．5）％,低表达组EVCT的黏附能力明显下降（P〈0．01）。过表达组、低表达组和对照组的细胞凋亡率分别为（3．9±0．8）％、（8．2±1．4）％和（1．1±0．3）％,低表达组细胞凋亡率显著高于对照组（P〈0．01）。结论抑制树突状细胞表面CLR表达可使EVCT的侵袭力和黏附能力显著减弱,凋亡率显著增高;提示树突状细胞表面CLR表达异常可能是EVCT免疫损伤和子痫前期发病的重要机制之一。     

早孕绒毛细胞滋养层细胞分离培养的实验研究

目的改善体外分离和培养人早孕绒毛细胞滋养层细胞(cytotrophoblast,CTB)的方法,探讨CTB的一些生物学特性.方法取人工流产6～8周妊娠绒毛,机械法分离,酶消化,经Ficoll分离介质离心得到单个核细胞进行培养并鉴定,测定其生长曲线并观察其体外转化、细胞周期和激素合成.结果分离培养的CTB经免疫细胞化学染色鉴定,接种后2 h开始贴壁,第5天融合90%以上,细胞周期显示约有79%细胞处于G0/G1期,激素分泌表现出随CTB的转化而变化.结论成功分离培养了人早孕绒毛CTB,方法简便易行,获得的细胞形态单一、生长稳定、定向转化,为进一步研究CTB在生殖生理中的作用提供了实验基础.     

侵袭及非侵袭性KYSE150细胞的体外分离及p75NTR的表达

目的：体外分离人食管鳞状细胞癌（ESCC）KYSE150细胞系侵袭和非侵袭性细胞亚系,比较2种细胞亚系p75NTR的表达。方法：用涂有Matrigel的Transwell小室对KYSE150进行体外侵袭实验,回收侵袭性和非侵袭性细胞,用免疫细胞化学SP法检测2者p75NTR的表达情况。结果：镜下观察,2种细胞亚系形态无明显差异。侵袭性细胞亚系p75NTR表达较非侵袭性细胞亚系显著增高,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：用涂有Matrigel的Tanswell可成功分离及回收侵袭性和非侵袭性KYSE150细胞;可能存在ESCC干细胞。     

TNF-a 与IFN-g 诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡

目的探讨TNF-a 与IFN-g 诱导妊娠早期人绒毛膜滋养层细胞凋亡的作用.方法建立人妊娠早期滋养层细胞体外培养体系;利用台盼蓝染色记数、光镜、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测TNF-a 与IFN-g 处理后的细胞凋亡情况.结果 TNF-a 与IFN-g 可引起活细胞数减少;透射电镜观察到染色体边集、核固缩、凋亡小体;DNA琼脂糖凝胶电泳有"梯形条带".结论 TNF-a 能够诱导人妊娠早期绒毛滋养层细胞凋亡,IFN-g 对TNF-a 具有协同作用.     

组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞

目的培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法用组织块法行原代培养,胰蛋白酶消化法行传代培养,免 疫组织化学染色进行细胞鉴定。结果６ｄ时,细胞开始由组织块边缘向外生长;１５ｄ时,即可进行传代。角蛋白染色示细 胞纯度达９５％以上。结论组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞简便易行,可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。     

外源性sHLA-G体外干预对滋养细胞侵袭功能的研究

目的 通过观察外源性sHLA-G体外干预对滋养细胞侵袭功能的变化,确定sHLA-G治疗特发性复发性流产患者的有效性及可行性进行研究.方法 取早孕人工流产绒毛滋养细胞进行体外培养,sHLA-G进行干预,分别以生理盐水及5％丙种球蛋白干预为对照,流式细胞仪检测CD146黏附分子浓度,观察sHLA-G对体外培养滋养细胞亲润功能的变化.结果 分别以0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL不同浓度干预绒毛外滋养细胞EVCT,CD146阳性率分别为18.6％、27.1％、62.3％；绒毛滋养细胞VCT检测CD146阳性率分别为6.1％、7.6％、39.1％.生理盐水干预的EVCT检测CD146阳性率为9.3％；VCT检测CD146阳性率为13.0％.5％丙种球蛋白分别以3 mg/mL、6 mg/mL不同浓度干预EVCT,检测CD146阳性率分别为56.9％、61.7％; VCT检测CD146阳性率分别为15.8％、30.9％.结论 外源性sHLA-G主动免疫治疗特发性复发性流产患者胎盘绒毛滋养细胞具有效性和优越性,可作为丈夫淋巴细胞细胞主动免疫治疗无效及丙种球蛋白特异性抗体效价不高治疗无效时的2线治疗措施.     

组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞

目的 培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法 用组织块法行原代培养,胰蛋白酶消化法行传代培养,免疫组织化学染色进行细胞鉴定。结果 ６ｄ时,细胞开始由组织块边缘向外生长;１５ｄ时,即可进行传代。角蛋白染色示细胞纯度达９５％以上。结论 组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞简便易行,可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。     

TGF-β/Smads信号通路与滋养细胞的恶性侵袭

在人类胚胎植入过程中,滋养细胞对子宫内膜组织的有限侵袭是受严格精细调控的,其过度的侵入与绒癌的形成有关[1].研究表明,体内多种细胞因子对滋养细胞的侵入具有调节作用.如自分泌和旁分泌的TGF、TNF-α、IGF、EGF以及丝裂原等均能通过细胞内某些信号通路调控滋养细胞MMP、uPA等侵袭相关蛋白酶的表达,从而调节滋养细胞的侵袭作用[2-4].转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是目前研究最多的参与滋养细胞侵入调节的细胞因子.研究发现,胎盘绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及绒毛的间质滋养细胞、蜕膜腺体细胞和间质细胞有TGF-β1表达,说明TGF-β1可能主要由以上几种细胞合成并分泌[5,6].     

sHLA-G对复发性流产患者滋养细胞侵袭功能的影响

【目的】 探讨外源性可溶性人类白细胞相关抗原G(sHLA-G)对不明原因复发性流产(RSA)患者滋养细胞侵袭功能的影响,为探索RSA的有效治疗措施提供依据.【方法】正常组30例,为正常早孕人流患者,无自然流产史,孕周8-10周;RSA组20例,相应孕周RSA患者,绒毛组织20例?滋养细胞原代培养,分离绒毛外滋养细胞,正常组患者每例滋养细胞接种1瓶?RSA患者每例3瓶备实验用?正常组及RSA对照组?研究1组?研究2组分别以生理盐水?生理盐水?5 × 10-4/L%终浓度sHLA-G?0.1%终浓度sHLA-G干预培养16 h,取悬浮细胞获得绒毛外滋养层细胞(EVCT)团,加入CD146单克隆抗体,采用流式细胞仪检测各组滋养细胞CD146阳性率?【结果】①正常组EVCT CD146阳性率为(63.29 ± 6.76)%,明显高于RSA对照组(10.61 ± 3.34)%, P < 0.01?②研究1组EVCT的CD146的阳性率为(30.61 ± 7.52)%,较RSA对照组显著升高,P < 0.01;研究2组EVCT的CD146的阳性率为(64.15 ± 9.54)%,显著高于研究1组及RSA对照组, P均<0.01,与正常组比较差异无统计学意义,P > 0.05?【结论】外源性sHLA-G干预可显著提高RSA患者EVCT侵袭功能,可望成为RSA的有效治疗措施之一?