人类生精相关基因TSARG6的原核表达和抗体制备

目的 构建人类生精相关基因pGEX-KG/TSARG6原核表达载体,原核表达、制备并鉴定多克隆抗体.方法 以人类睾丸cDNA文库为模板,用PCR方法扩增得到TSARG6基因开放阅读框(ORF)全长序列,插入原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入E.coli JM109细菌,IPTG 诱导表达GST/TSARG6融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blot鉴定融合蛋白,免疫家兔,制备抗TSARG6 多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 经测序验证,我们成功构建了pGEX-KG/TSARG6 重组质粒;转化重组质粒的E.coli JM109细菌经 IPTG 37℃诱导3 h后高效表达GST/TSARG6融合蛋白;Western blot 实验结果显示制备的多克隆抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了TSARG6基因的原核表达和多克隆抗体制备,为TSARG6的后续功能研究提供了有力的工具.     

人血管内皮生长因子A(VEGFA)的原核载体构建、蛋白表达及鉴定

目的 克隆人VEGFA基因,与原核载体融合表达、纯化及其鉴定,并将其应用于肿瘤血管生长研究过程中.方法 采用PCR方法扩增人VEGFA序列,将其克隆入pGEX-KG原核载体,获得pGEX-KG-hVEGFA重组质粒.将该质粒转化入E.coli菌株BL21 (DE3),经IPTG诱导其表达,以GSTrap亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定融合蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hVEGFA基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒载体经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了hVEGFA基因片段.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hVEGFA.结论 融合蛋白在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、25℃条件下诱导表达,并获得纯化融合蛋白.采用Western Blot的方法可检测到目的融合蛋白GST-hVEGFA的表达.     

人晚期糖基化终产物受体胞质内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化,研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段,并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21,以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST/hRAGE-C原核表达载体完全正确,继而表达、纯化获得了相对分子质量约35 000的融合蛋白(符合预期大小)。结论将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm。经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别。结论成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm。大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础。     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

人肿瘤抗原基因Delta-like4(DLL4)可溶性表达、纯化及鉴定

目的研究克隆肿瘤抗原人DLL4基因,与原核表达载体可溶性融合表达、分离纯化及其鉴定,并计划将其应用于DLL4特异性肺癌肿瘤疫苗研究过程中的抗血清滴度检测.方法采用PCR方法扩增DLL4多核苷酸序列,克隆入pMD-18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pGEX-KG原核表达载体,获得pGEX-KG-hDLL4载体.以该载体转化E.coli菌株BL21(DE3),IPTG诱导其表达,裂解大肠杆菌,以GSTrap亲和层析柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hDLL4基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因hDLL4.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hDLL4.结论融合蛋白GST-hDLL4在25℃,IPTG终浓度0.5 mmol/L条件下诱导表达,以GSTrap亲和层析柱纯化,获得纯化融合蛋白.采用SDS-PAGE,Western Blot的方法可检测到目的可溶性融合蛋白GST-hDLL4的表达.     

人晚期糖基化终产物受体胞质内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的 构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化，研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法 采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段。并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后，转化大肠杆菌BL21，以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果 PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST／hRAGE-C原核表达载体完全正确，继而表达、纯化获得了相对分子质量约35000的融合蛋白(符合预期大小)。结论 将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。     

MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备

[目的]构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体.[方法]利用RTPCR方法扩增MAGE-3基因片段,连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEXMAGEE-3并测序.将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化.用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性.[结果]构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达一相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3.制备了兔抗GST-MAGE-3抗体.Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合.[结论]获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体、为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具.     

重组原核表达载体pGEX6P1-Osx的构建与表达

目的构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,并在大肠杆菌中诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白。方法提取新生小鼠牙髓总RNA,RT-PCR扩增Osx目的基因片段,并将该片段克隆至PCR-TopoII载体中;经鉴定正确后目的基因定向连接至表达载体pGEX6P1;将重组质粒pGEX6P1-Osx转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定;免疫印迹法检测纯化的GST融合蛋白。结果IPTG诱导宿主菌BL21有效表达融合蛋白;免疫印迹法鉴定该融合蛋白为GST-Osx。结论成功构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,且GST-Osx融合蛋白可在大肠杆菌中诱导表达。     

人心肌细胞中NLRP3融合蛋白表达的鉴定

目的：构建人NLRP3真核表达载体并证实NLRP3融合蛋白在人心肌细胞中表达。方法以人胎脑cDNA文库为模版,PCR扩增NLRP3全长编码基因,亚克隆至pCDNA3．1-myc-his A表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人心肌细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用流式细胞仪观察Myc-NLRP3在人心肌细胞内的作用。结果 NLRP3全长基因序列克隆到了真核表达载体 pCDNA3．1-myc-his A中,酶切鉴定片段大小为3111 bp。 Western blot检测到了融合蛋白Myc-NLRP3表达,分子量约为114 KD。 Myc-NLRP3在人心肌细胞中过表达,能够促进细胞凋亡。结论成功构建了Myc-NLRP3全长基因真核表达载体,过表达Myc-NLRP3能够促进心肌细胞凋亡。     

日本血吸虫14-3-3蛋白质编码基因在原核细胞中的表达

目的 :为了寻找日本血吸虫病新的诊断和候选疫苗分子 ,克隆日本血吸虫 14 -3 -3蛋白质编码基因 ,并进行表达。方法 :提取日本血吸虫成虫RNA ,设计合成引物 ,用RT -PCR法扩增出日本血吸虫 14 -3 -3抗原 (Sj14 -3 -3 )基因编码序列 ,将其克隆入pGEM -T载体 ,然后在真核表达载体 pBKCMV中亚克隆 ,用IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE观察表达结果。结果 :RT -PCR法扩增出一条大小约 765bp的特异性片断 ,克隆质粒pGEM -Sj14 -3 -3和真核表达质粒pBKCMV经双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段 ,诱导表达后 ,经SDS -PAGE可见一条约 3 2 5kDa大小的融合蛋白条带。结论 :本实验成功地克隆了日本血吸虫 14 -3 -3抗原的编码基因 ,并在原核细胞中进行表达 ,为进一步的免疫诊断和核酸疫苗研究奠定了基础。     

PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体的构建及表达

目的:分别构建肝再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver 3,PRL-3)基因C104S位点突变和C端CAAX缺失的myc标签和GFP荧光标签重组质粒pcDNA3-myc-PRL-3(C104S)、pEGFP-PRL-3(C104S)、peDNA3-myc-PRL-3(△CAAX)和pEGFP-PRL-3(△CAAX),并进行真核表达,为PRL-3的后续功能研究提供有效的工具.方法:设计PRL-3基因C104S点突变、c端CAAX缺失的特异性引物,以peDNA3-myc-PRL-3质粒为模板,通过基因克隆、一步法点突变的方法构建各重组质粒,通过酶切和测序鉴定后转染真核细胞,检测其在细胞中的表达并观察定位情况.结果:成功构建了4种重组质粒,并能在结肠癌细胞LoVo中表达.用激光共聚焦扫描显微镜对细胞中绿色荧光融合蛋白的定位观察发现,当PRL-3的CAAX位点缺失后,PRL-3由内膜系统大量入核,与理论预期相符.结论:获得了PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体重组真核表达质粒并能在细胞中表达,为进一步研究PRL-3的功能提供了条件.     

分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶3融合蛋白对SKBr3细胞的靶向杀伤作用

目的探讨分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶(caspase-3)融合蛋白对：ErbB2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法将重构型人caspase-3基因亚克隆入pcMV-e23scFv—PEII—PEIII相应位点,构建表达分泌型的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase-3融合蛋白基因的真核表达载体pcMV-e23scFv-PEII-revcasp3,转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat,筛选并建系,ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达以及对人乳腺癌细胞SKBr3生长的抑制作用,并将重组质粒经脂质体包裹后肌肉注射荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用,间接免疫荧光检测重构型人caspase-3蛋白在瘤体的靶向分布。结果融合蛋白基因可通过Jurkat细胞分泌表达并杀伤SKBr3细胞,肌肉注射重组质粒明显延长荷瘤裸鼠生存时间(延长72％)和抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长(抑制率为77％)。间接免疫荧光染色显示重构型人caspase-3融合蛋白具有靶向分布。结论分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase-3融合蛋白靶向诱导SKBr3细胞死亡。     

人BNIP3真核表达载体和shRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞自噬的影响

目的利用人BNIP3的真核表达载体和靶向BNIP3的shRNA表达载体,研究BNIP3过表达和封闭时对肝癌细胞自噬的影响。方法从人肝癌细胞系中,通过RT-PCR扩增人BNIP3基因编码区序列,酶切后插入pcDNA3.1-His-C载体,以此构建重组pcDNA3.1-BNIP3真核表达载体。同时构建靶向人BNIP3基因的shRNA表达载体pSilencer-BNIP3。分别经测序、酶切、RT-PCR和Western blot等方法对重组载体是否构建成功进行验证。并通过采用Western blot检测自噬标志物LC3蛋白的剪切,研究BNIP3过表达和抑制时对肝癌细胞自噬的影响。结果pcDNA3.1-BNIP3和pSilencer-BNIP3分别过表达BNIP3和抑制BNIP3的表达。BNIP3过表达能够显著增加肝癌细胞的自噬;BNIP3表达受到抑制时,肝癌细胞的自噬明显减少。结论成功构建了人BNIP3的真核表达载体pcDNA3.1-BNIP3和shRNA表达载体pSilencer-BNIP3,并在人肝癌细胞系中证实BNIP3对肝癌细胞自噬的促进作用。     

睾丸酮丛毛单胞菌的分离和鉴定及3α-羟类固醇脱氢酶在大肠杆菌中的克隆表达

目的:从自然界中分离鉴定产3α-羟类固醇脱氢酶(3α-hydroxysteroid dehydrogenase,3α-HSD)的睾丸酮丛毛单胞菌,并在大肠杆菌(E.coli.)中克隆表达3α-HSD.方法:将池塘泥浆样品接种到以雄酮为唯一碳源的培养基中,对分离到的菌株根据形态学和生理生化特征进行初步鉴定.为进一步鉴定该菌株,根据睾丸酮丛毛单胞菌中的3α-HSD的基因设计引物,PCR扩增细菌基因组DNA,将扩增片段插入到载体pET15b中,构建重组质粒pET15b,并在E.coli. BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,对表达得到的蛋白进行鉴定并测定其酶活力.结果:一系列生化反应和培养特征证实,该菌与睾丸酮丛毛单胞菌的符合率为85%,最适生长pH值为7.0,最佳生长温度为30 ℃.在E.coli. BL21(DE3)pLysS中经诱导表达得到了相对分子质量约为29×103 具有酶活性的融合蛋白,可催化雄酮(3α-羟类固醇)脱氢.结论:从池塘泥浆中分离到一株产3α-HSD的睾丸酮丛毛单胞菌,并在E.coli.中表达得到了具有酶活性的融合3α-HSD.这为利用金属螯和亲和层析纯化融合3α-HSD,并进一步建立以其为工具酶的血清总胆汁酸酶循环测定方法奠定了基础.     

抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

 【目的】构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒，探讨抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A／T克隆于pGEM-T载体，再亚克隆于pcDNA3．1（＋）和pcDNA3．1（-）真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3．1^（＋）resistin和pcDNA3．1^（-）-resistin^（-）。将pcDNA3．1^（-）resistin^（-）转染小鼠3T3-L1脂肪细胞，通过G418筛选稳定表达的细胞株。3T3-L1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组（每组n=6），用^3H-2-脱氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。【结果】插入pcDNA3．1^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因mRNA编码区序列完全一致．且方向正确：插入pcDNA3．10^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列完全一致，且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3-L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别（P〉O．05）。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。     

DNMT1、DNMT3b siRNA重组质粒的构建及鉴定

目的:构建DNA甲基转移酶(DNMT1)、DNMT3b微干扰RNA(siRNA)重组质粒,并鉴定其正确性。方法:构建DNMT1siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒各4种,分别用BamHⅠ和PstⅠ酶切、测序、鉴定。结果:用BamHⅠ和PstⅠ进行双酶切后所有质粒均为阳性重组载体,每一种载体选择两个克隆进行测序鉴定,测序结果与插入的寡核苷酸的序列完全相符。结论:DNMT1 siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒正确,可用于后续实验。     

结核杆菌ＥＳＡＴ-６抗原多表位ＤＮＡ疫苗的构建与表达

目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Fh3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达.方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tvr(AAY)序列作为接头,合成全基因序列,定向克隆入真核双表达载体pIRES及质粒plRES-FL.在酶切分析与序列测定后.用PEI转染至GMCs细胞,并行Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,Western blot证实该重组质粒能在体外GMCs细胞中表达融合蛋白.结论:成功构建了结核杆菌ESAT-6抗原多表位基因重组质粒.     

小鼠3D3/LYRIC基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

 目的构建小鼠3D3/LYRIC真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法提取小鼠乳腺上皮细胞系
C127 的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增3D3/LYRIC全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测
序并转染到腺样囊性癌细胞系ACC-2 中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用免疫荧光显微镜观察pEGFP-m3D3/LYRIC
在腺样囊性癌ACC-2 细胞内的定位。结果3D3/LYRIC全长基因序列克隆到真核表达载体pEGFP-C1 中,酶切鉴定片段大小
为1 740 bp。Western blot 检测到融合蛋白GFP-m3D3/LYRIC 表达,分子量约为91 kDa。pEGFP-C1-m3D3/LYRIC主要在细胞质
内定位,在细胞核内未见表达。结论成功构建了3D3/LYRIC全长基因真核表达载体,pEGFP-m3D3/LYRIC 蛋白主要定位于
细胞质内。