抑制HBV复制的小干扰RNA的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建可同时表达绿荧光蛋白（GFP）和针对HBVS区基因的小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒,并研究该siRNA在体外对HBV的抑制作用。方法采用PCR技术自质粒pEGFP-C1中扩增含CMV启动子的GFP表达框,自质粒pAVU6＋4sh579中扩增含U6启动子的针对HBV S 区579-597位基因的siRNA表达框,分别将两个表达框克隆至穿梭载体质粒pShuttle内,与质粒pADEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,将阳性重组体DNA转染至人胚肾细胞株HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中初步观察其对HBV复制的抑制疗效。结果构建了可同时表达GFP和siRNA的重组腺病毒,其可在HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的表达具有抑制作用。结论成功构建了可同时表达GFP和针对HBV的siRNA的重组腺病毒,并在体外实验中证实了其对HBV复制具有抑制作用。     

双表达骨形态发生蛋白9、7重组腺病毒载体的构建及其对间充质干细胞C3H10的成骨作用

目的 构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、7腺病毒重组体并进行初步成骨鉴定.方法 自单一表达的BMP9或BMP7 AdEasy质粒上扩增BMP9和BMP7基因序列,先后定向亚克隆至同一穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质pASG2-BMP9、7.酶切、PCR鉴定及测序正确后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组获得双表达BMP9、BMP7腺病毒质粒,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达BMP9、BMP7腺病毒,体外转染C3H10细胞,碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色检测其早晚期成骨作用.结果 成功构建双表达BMP9、BMP7的腺病毒,RT-PCR证实双表达腺病毒在C3H10细胞中表达,其转染的C3H10细胞早期碱性磷酸酶染色及晚期钙茜素红染色活性较单一表达的BMP7或BMP9腺病毒组增强.结论 成功构建双表达BMP9、BMP7的重组腺病毒载体,其重组体具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力.     

骨形态发生蛋白9、6双表达腺病毒载体的构建及其成骨诱导作用

目的构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、6重组腺病毒并探讨其对C3H10细胞成骨的影响。方法以单一表达的BMP9或BMP6 AdEasy质粒为模板,PCR自扩增BMP9和BMP6基因序列,先后将其插入穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质粒pASG2-BMP9、6,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组,酶切鉴定成功后,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达腺病毒AdBMP9、6,体外转染C3H10细胞,RT-PCR方法检测BMP9、BMP6 mRNA水平的表达,早期成骨指标碱性磷酸酶染色、晚期指标钙茜素红染色检测其成骨作用。结果成功构建双表达重组腺病毒AdBMP9、6,RT-PCR证实双表达腺病毒能成功转染C3H10细胞,并且转染的C3H10细胞早晚期成骨指标碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色活性较单一表达BMP9或BMP6的腺病毒组均增强。结论双表达重组腺病毒载体AdBMP9、6具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力,且较单一表达BMP9或BMP6强。     

人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白,功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程,多水平、多通路地调节靶因子,其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系,文中构建表达人SET基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体。方法根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。该穿梭质粒经Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后与pAdTrack-CMV连接,构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescense protein,GFP）报告基因的穿梭质粒PATC—H1-siRNA。分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒PATC—H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒pAd—H1-siRNA后,转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据GFP报告基因的表达观察重组病毒的产生和感染效率,用Western blot检测人SET蛋白的表达水平。结果穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功;重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达;获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。经Western blot检测,SET基因腺病毒载体（AdH1-SiRNA／SET）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒载体组（AdH1-SiRNA／NS）相比,SET蛋白表达水平显著降低（P〈0．05）,抑制效率为50％～70％。结论成功构建了表达人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA／SET,并在AD293细胞中验证其抑制SET蛋白表达的作用,为进一步研究SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。     

RNA干扰作用于HIV-1vpr基因的筛选实验研究

目的 筛选鉴定针对HlV-1vpr基因的小干扰RNA（siRNA）片段。方法 根据siRNA设计要求合成siRNA56、siRNA160和siRNA185寡核苷酸片段,分别转染至含HIV-1vpr质粒的HEK293T细胞,并进行总RNA提取,采用Real-timePCR和Westernblotting分别从核酸和蛋白水平对HIV-1vpr基因表达水平进行验证。结果 siRNAs成功转染含HIV-1vpr质粒的HEK293T细胞,降低了HIV-1vpr基因的表达水平,其中在RNA水平siRNA160组干扰抑制作用最强,抑制率为89%;在蛋白水平siRNA56组干扰抑制作用最强,抑制率为96%。结论 3个基因片段的siRNA均可以下调HIV-1vpr的表达水平,但存在差异性,为探索HIV/AIDS基因治疗的可行性和高效性提供了可靠的实验依据。     

新基因HA117最佳siRNA的筛选及重组腺病毒构建

目的 验证pSOS-HUS筛选目的 基因最佳siRNA的效果,应用pSOS-HUS筛选新基因HA117最佳siRNA,构建携带HA117基因最佳siRNA转录模板DNA的重组腺病毒.方法 构建携带HA117基因及其siRNA模板DNA链的双克隆质粒.把双克隆质粒分别转染293细胞,通过镜下观察、流式细胞仪检测比较绿色荧光表达强度,RT-PCR检测HA117基因mRNA表达,筛选鉴定基因HA117最佳siRNA.构建HA117基因RNA干扰重组腺病毒.结果 从5对模板DNA链中筛选出最有效片段HAi5,构建携带HAi5的重组腺病毒.结论 载体pSOS-HUS可快捷有效地筛选目的 基因的最佳siRNA;在5对模板DNA中,HAi5转录的siRNA对新基因HA117干扰效果最强;成功构建携带HAi5的重组腺病毒.     

携带siRbpj重组腺病毒载体的构建及其对BMP9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化作用影响

目的：构建并筛选特异性干扰Notch信号通路核转录因子Rbpj基因的重组腺病毒,探讨通过Rbpj的经典Notch信号通路在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）9诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,ＭＳＣs）成骨分化中的作用。方法：设计3对针对小鼠Rbpj的siRNA序列,将其分别亚克隆至pSES-HUS穿梭质粒,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内同源重组获得重组质粒,经脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增腺病毒,利用RT-PCR及Western blot进行筛选、验证有效的干扰腺病毒。该重组腺病毒与AdBMP9处理ＭＳＣs细胞株C3H10T1/2,采用组织化学和RT-PCR检测早期成骨指标碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和晚期成骨指标骨桥蛋白（osteopontin,OPN）,骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）及BMP下游靶基因Id 1、Runx 2等的表达。结果：成功构建了3个重组腺病毒,并筛选出干扰效率最好的AdsiRbpj-2重组腺病毒,转染C3H10T1/2,AdsiRbpj-2可以明显下调BMP9诱导的早期成骨指标ALP的活性及晚期成骨指标OPN、OCN的表达,成骨相关基因Runx 2等的表达也有下降。结论：成功构建了特异性阻断Notch经典信号通路腺病毒载体AdsiRbpj-2,该重组腺病毒能够抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化进程,从而进一步证明Notch信号通路在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中有着重要的作用。     

钠通道SCN1A基因短发夹RNA表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的沉默效果

目的采用人SCN1A基因非保守区DNA构建短发夹RNA（shRNA）稳定表达的重组质粒,在HEK293细胞中抑制SCN1A基因表达。方法PCR分别正反向扩增SCN1A基因特异序列,构建成一个绿色光蛋白（GFP）与发夹结构RNA（shRNA）融合表达的重组质粒pEGFP-SCN1A-shRNA;该质粒和对照质粒（pCMV-EGFP）分别与SCN1A基因表达质粒（pCMV-SCN1A）共转染HEK293细胞株,采用半定量RT-PCR及双荧光共定位法鉴定SCN1A基因的表达情况。结果与对照相比较,shRNA表达质粒转染的培养细胞中SCN1A基因mR-NA表达量下调90%;双荧光共定位显示实验组阳性细胞中只检测到GFP蛋白,未能检测到Nav1.1,而对照组阳性细胞中能同时检测到GFP蛋白和Nav1.1。结论shRNA表达质粒在培养细胞中能有效地抑制SCN1A基因的表达。该质粒可进一步改造成腺病毒表达载体,在动物脑组织中进行永久性表达,建立癫痫等神经系统疾病的动物模型,可望成为致病机理研究和开发新治疗途径的工具。     

Livin siRNA重组腺病毒的构建及其对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响

目的 通过改良的重组腺病毒介导方法 研究Livin基因与K562细胞增殖、凋亡及耐药的关系.方法 用基因工程技术将靶向Livin siRNA片段克隆至穿梭质粒pSES-HUS中,然后与骨架质粒pAdeasy同源重组,将重组成功的质粒用脂质体介导的方法 转染HEK293细胞,乒乓感染收获高滴度的重组腺病毒AdS-Livin siRNA,并将其感染K562细胞,采用Real-time PCR、Western blot检测Livin基因的干扰效果,用MTT和流式细胞仪检测其与K562细胞增殖、凋亡及多药耐药的关系.结果 成功构建重组腺病毒Ad5-Livin siRNA,并感染K562细胞,在mRNA和蛋白2个水平均抑制Livin的表达.证实通过重组腺病毒沉默Livin基因,可抑制K562细胞增殖,促进凋亡,增加其对阿霉素、长春新碱和依托泊苷的敏感性.结论 用重组腺病毒介导的方法 抑制K562细胞中Livin基因的表达,可增加K562细胞的凋亡及对抗癌药物的敏感性.Livin可能成为治疗白血病新的分子靶点.     

利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA

目的 建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的 基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法.方法 以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照pSi-Negative.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的GFP与萤光素酶基因(LUC)的融合表达载体pGL3-GFPf.将包含3个GFPsiRNA靶序列的GFP片段插入到改建过的pGL3-promoter载体上LUC的3非翻译区(UTR),构建pGL3-GFPp.将GFP siRNA表达质粒联同内参照质粒pRL-TK分别与pGL3-GFPf、pGL3-GFPp共转化HEK293细胞.利用双萤光素酶检测试剂盒测定各组细胞中萤光素酶的活力水平,用荧光定量PCR检测各组细胞中GFP mRNA的表达水平.结果 同对照组相比,与pGL3-GFPf共转化GFP siRNA 表达质粒的各组细胞中萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶比值明显降低,其中GFPsiRNAl表达组中降低最显著(P<0.01);定量PCR检测也显示,GFPsiRNA1表达组中GFP mRNA的表达水平降低最明显(19<0.01).双萤光素酶活性检测和定量PCR结果还显示,与pGL3-GFPp共转化GFP siRNA表达质粒的各组细胞中,GFPsiRNA1抑制GFP的表达最显著(P<0.01).结论 本文建立了通过双萤光素酶活性检测来筛选有效的siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案.

Abstract：

Objective To establish an efficient method for screening effective small interference RNA (siRNA) using dual-luciferase reporter assay system. Methods Based on the siRNA expression vector pSilencer-4.1, 3 candidate green fluorescence protein (GFP) gene siRNA expression plasmids, namely pSi-GFPsiRNA1, pSi-GFPsiRNA2, and pSi-GFPsiRNA3, along with the negative control pSi-Negative, were constructed. Using the pGL3-promoter vector, the GFP-luciferase (GFP-LUC) expression plasmid pGL3-GFPf was constructed with the same Kozak consensus translation initiation site and start codon ATG for GFP-LUC coding sequence. The GFP fragment containing the target sequences of 3 GFP siRNAs was introduced into the 3' untranslate region of LUC in the modified pGL3-promoter vector to construct the plasmid pGL3-GFPp. The GFP siRNAs expression plasmids and Renilla luciferase reporter vector pRL-TK were co-transfected with pGL3-GFPf or pGL3-GFPp into the HEK293 cells, respectively. The luciferase activities were determined by dual-luciferase reporter assay, and the GFP mRNA expressions were detected by real-time quantitative PCR. Results In the groups cotransfected with GFP siRNAs expression plasmids and pGL3-GFPf, the luciferase activities were reduced obviously,and the reduction was more significant in cells transfected with GFPsiRNAl compared with the control cells (P<0.01).GFP mRNA levels were also markedly lowered in cells transfected with GFPsiRNAl as shown by real-time PCR (P<0.01). In addition, the results of dual-luciferase reporter assay and real-time PCR showed that among the groups cotransfected with GFP siRNAs expression plasmids and pGL3-GFPp, the GFP expression was inhibited most obviously by GFPsiRNA1 (P<0.01).Conclusion The dual-luciferase reporter assay system provides a useful method for screening effective siRNAs targeting specific genes.     

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠胚胎肝脏干细胞诱导分化的影响

目的探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9(Adv-BMP-9)诱导小鼠胚胎肝干细胞向成熟肝细胞定向分化的影响。方法将已构建的表达BMP-9、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒,分别感染小鼠胚胎肝干细胞,诱导其分化,然后采用半定量PCR、Real-time PCR、细胞免疫荧光、荧光素酶报告基因检测等方法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和细胞角蛋白18(CK18)等肝细胞标志物的表达。结果半定量及Real-time PCR检测,诱导7 d后的BMP-9组、HGF组AFP的mRNA表达△△Ct值分别为(0.027±0.003)、(0.023±0.002),较GFP对照组(0.103±0.018)显著下降,ALB的mRNA表达△△Ct值分别(0.041±0.005)、(0.031±0.001),较GFP对照组(0.013±0.002)明显升高,CK18的mRNA表达△△Ct值分别(0.094±0.003)、(0.083±0.007),较GFP对照组(0.040±0.008)明显升高(P<0.05);细胞免疫荧光染色,诱导7 d后的细胞胞浆内表达肝细胞特有的ALB、CK18等蛋白,而对照组几乎无表达;荧光素酶报告基因检测,诱导1、4、7 d的BMP-9组、HGF组的ALB表达荧光素酶A值分别[(5 509.35±213.08),(33 198.14±666.39),(50 815.03±1 730.75)]、[(5 539.25±132.62),(31 400.71±2 622.39),(49 088.28±1 868.03)],较GFP对照组(4 732.49±68.22),(9 407.71±487.84),(20 894.83±1 100.54)明显升高(P<0.05)。结论 BMP-9有诱导小鼠胚胎肝脏干细胞向成熟肝细胞样细胞分化的作用,并且BMP-9对小鼠胚胎肝干细胞的诱导分化作用甚至和传统的肝干细胞诱导分化因子HGF相当。     

转基因鼠中人α类珠蛋白基因簇染色质构象调控变化

目的 用人珠蛋白转基因鼠模型建立染色质构象捕获的技术体系,探讨人α类珠蛋白基因簇的染色质构象变化与基因表达调控的关系。方法 使人α类珠蛋白转基因纯合子公鼠与KM母鼠交配,从怀孕14．5d的母鼠体内取出珠蛋白基因表达组织胎肝和非表达组织胎脑细胞,用甲醛交联固定细胞核内的染色质构象,限制性内切酶Nco Ⅰ消化后用T4DNA连接酶连接,解交联后提取并纯化连接的基因组DNA,在连接位点的两侧设计引物,用半定量PCR分析胎肝和胎脑中人α类珠蛋白基因簇染色质构象模式。结果以含HS40的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,表达的珠蛋白基因α2、α1的酶切片段与其交联效率明显高于胎脑,含有已关闭珠蛋白基因ζ的酶切片段与其交联效率与胎脑相当。以含α2的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,上游调控元件HS40和33与其交联效率明显高于胎脑;HS10和8与其交联效率略低于胎脑。结论 在表达组织中,人α类珠蛋白基因簇上游远端调控元件通过形成染色质环与下游表达基因靠近,从而调控α类珠蛋白基因的表达;而在非表达组织中,无此染色质环形成。     

体外诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化的研究

目的:体外分离和定向诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化.方法:无菌条件下从正常C57BL/6J胎鼠肝中分离出间充质干细胞,体外培养传3代后用高浓度葡萄糖培养基以及碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和尼克酰胺诱导分化,观察胎肝间充质干细胞诱导前后形态变化;用RT-PCR检测细胞诱导前后胰十二指肠同源异型基因盒1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)、胰岛素原1(proinsulin-1,INS-1)、葡萄糖转运子2(glucose transporter-2,GLUT-2)表达情况;胰岛素免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞胰岛素的表达;在形成胰岛样细胞簇后,用双硫腙做胰岛B细胞特异性染色.结果:RT-PCR显示诱导5 d后PDX-1、INS-1、GLUT-2均有表达,而诱导前的细胞则没有检测到表达;胰岛素免疫细胞化学表明细胞簇内的细胞胰岛素染色强阳性;细胞簇双硫腙染色阳性(每个T-25培养瓶有80～120个).结论:从胎肝中分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛B样细胞.     

人骨形成蛋白2反义RNA对骨肉瘤细胞OS-9901生物学活性的影响

探讨骨形成蛋白（BMP）对人骨肉瘤细胞的作用及意义．方法：将重组人BMPZ基因的反义核酸逆转录病毒表达载体PDOR－AB用脂质体导入BMP表达阳性的骨肉瘤细胞OS－99OI，观察骨肉瘤细胞OS－99OI的BMP表达、增殖活性、肿瘤抑制基因＂m23的表达、细胞周期和电镜下形态改变．结果：转染后，OS－99o1细胞中内源性的BMP表达产物明显下降；增殖活性明显下降；肿瘤转移抑制基因＂m23表达未见改变；细胞周期分析表明：GI期细胞比例上升，S期比例下降；电镜观察可见细胞质中溶酶体增多，染色质有断裂现象．结论：反义核酸技术阻断BMPZ在OS－99o1细胞中的表达后，肿瘤细胞的增殖活性降低，证实骨肉瘤细胞中BMP的表达增加了肿瘤细胞的增殖活性．     

胎肝特异性癌胚RNA——AK003710的筛选及功能研究

目的 筛选胎肝特异性癌胚RNA,探讨其对肝癌细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 对小鼠肝发育和肝再生的长链非编码RNA(IncRNA)芯片数据进行生物信息学分析,筛选得到在胎肝和再生肝脏中均高表达的候选IncRNA,利用实时定量PCR在小鼠肝癌组织中对候选IncRNA进行表达水平检测,综合芯片分析及实时定量PCR结果,选择表达差异最明显的IncRNA行进一步研究.首先在胎肝和肝再生模型中验证该IncRNA的表达,然后利用siRNA技术干扰该IncRNA,再通过EdU标记技术和Transwell实验分别检测细胞的增殖能力和侵袭能力.结果 生物信息学分析筛选得到在胎肝和再生肝脏中均高表达的7条IncRNA,其中3条在小鼠肝癌组织中较正常肝组织高表达,3条表达无差异,1条无表达;高表达的3条IncRNA中,IncRNA-AK003710在小鼠肝发育和肝再生芯片中的差异表达倍数最高,可作为进一步研究对象.进一步验证显示IncRNA-AK003710在胎肝及多种肝损伤修复模型中表达上调;功能实验表明对IncRNA-AK003710靶向干扰后能降低小鼠肝癌细胞Hepa1-6的增殖和侵袭能力.结论 IncRNA-A003710在胎肝、再生肝组织及肝癌组织中均高表达,是胎肝特异性癌胚RNA,可调控肝癌细胞的增殖及侵袭过程,有望成为肝癌治疗的潜在靶点.     

小鼠骨桥蛋白(OPN)基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体内抑制效果鉴定

 目的 构建骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因RNA干扰慢病毒载体并在小鼠体内鉴定其抑制效果。方法 参照OPN GenBank上的序列,对OPN基因沉默位点进行分析,设计针对OPN信使RNA的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)OPN shRNA及阴性对照(negative control shRNA,NC shRNA)序列,合成pSicoR GFP shRNA重组体。经鉴定序列无误后,与pCMV VSV G 和pCMV dR8.91辅助质粒包装并转染293FT细胞,得到有效滴度为5×109 TU/mL的病毒原液。经尾静脉将构建的慢病毒载体注射入小鼠体内,qRT PCR及Western blot检测小鼠肝脏OPN mRNA及蛋白的抑制效果。结果 成功构建针对OPN的shRNA慢病毒载体,经纯化、浓缩得到滴度为5×109TU/mL病毒原液。与正常对照组、阴性对照组相比,实验组OPN mRNA及蛋白表达水平明显下降;正常对照组、实验组OPN mRNA及蛋白表达水平无明显差别。结论 利用RNA干扰技术,借助慢病毒载体,成功构建小鼠肝脏OPN基因低表达模型。为进一步研究OPN在胆石症等疾病中的作用提供了有力工具。     

针对小鼠VEGFA基因的siRNA干扰载体的构建和慢病毒包装

目的 针对NM_001025250.3,NM_001025257.3,NM_009505.4,构建4个针对靶基因小鼠VEGFA(血管内皮生长因子A)的小干扰RNA(siRNA)干扰载体,并将其重组转成慢病毒载体.方法 根据靶基因设计并合成4对siRNA干抚序列,将siRNA干扰序列克隆到pcDNA6.2-GW/EmGF...     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞诱导成骨的实验研究

目的 通过基因转染方法，使成纤维细胞NIH－3T3细胞具有合成及分泌骨形态发生蛋白（BMP）、体内诱导新骨生成的能力。方法 定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，Northern印迹法检测转染细胞有无BMP3基因表达，免疫组织化学检测转染细胞内的BMP3蛋白合成，钙钴法染色不同时相的转染细胞碱性磷酸酶并作图像分析。将转染细胞注入裸鼠肌袋，观察注射后第4周诱导新骨生成情况。结果 转染细胞体外培养6周Northern印迹法检测到有明显的BMP3基因表达，免疫组织化学染色见转染细胞培养筛选5－8周后细胞浆内有染成黄色的BMP3蛋白质颗粒出现，图像分析蛋白质生成在转染后第6周达高峰。钙钴法碱性磷酸酶染色及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。被转染NIH－3T3细胞裸鼠肌袋诱导成骨实验见注射后4周注射部位有大量软骨细胞出现，并伴有骨小梁生成。结论 通过基因转染方法可以使NIH－3T3细胞具有合成及分泌内源性BMP的能力，合成及分泌的BMP具有良好的生物活性，肌袋实验具有诱导成骨作用。但是，由于基因治疗的某些不可控性因素，其安全性仍有待于进一步研究。     

S100A16基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建S100A16基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒,转染3T3-L1小鼠前体脂肪细胞,初步鉴定其干扰效果.方法:以小鼠S100A16基因为靶基因,以PLKO.1-sP6-GFP质粒为载体,根据GenBank数据库提供的S100A16基因核苷酸序列,选择设计2条siRNA干扰序列,构建针对S100A16基因...