HBV-DNA荧光定量PCR检测的室内质控研究

目的研究HBV-DNA荧光定量PCR检测室内质控管理体系。方法自制HBV-DNA阳性质控血清,连续测量20次,计算均值、标准差和变异系数,从第3次开始利用即刻法进行质控,20次以后利用质控图法进行质控。结果自制阳性质控血清均一性和准确度均达到实验要求,用即刻法检测3～20次质控结果均小于N2S数值,在控制范围内,用质控图法检测HBV-DNA室内质控对数值的均值为5.54,标准差为0.22,CV为3.9%,稳定性好,有临床应用价值,质控图利用EXCEL表格标示出警告限和失控限,有利于动态监控质控结果。结论联合即刻法和质控图法对于应用荧光定量PCR的方法进行HBV-DNA检测的室内控制切实可行。     

实时荧光定量聚合酶链式反应检测百日咳鲍特菌的效能研究

背景　百白破疫苗效价不足事件引发公众对百日咳的关注,但目前各种百日咳实验室检测方法均具有一定的局限性,无法满足快速进行病原学诊断的临床需求。目的　评价一种商品化的实时荧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR）试剂盒对百日咳鲍特菌（BP）感染的临床检测效果。方法　2016年11月-2017年4月在首都医科大学附属北京儿童医院采集无热咳嗽患儿鼻咽拭子302例,以及临床诊断为百日咳患儿鼻咽拭子50例。采用Q-PCR与细菌培养方法筛查302例无热咳嗽患儿是否存在BP感染,并比较两种方法检测50例临床诊断百日咳病例的阳性率,综合评估Q-PCR的临床应用价值。结果　302例无热咳嗽患儿中,以细菌培养为金标准时,Q-PCR检测的灵敏度为78.6%（11/14）,特异度为95.8%（276/288）,阳性预测值为47.8%（11/23）,阴性预测值为98.9%（276/279）。在50例临床诊断百日咳病例的鼻咽拭子标本中,Q-PCR检测的阳性率为34.0%（17/50）,细菌培养的阳性率为22.0%（11/50）,两者比较,差异无统计学意义（χ2=3.125,P=0.077）。结论　以细菌培养结果为金标准,Q-PCR筛查百日咳的灵敏度及特异度较高;在为临床诊断百日咳患儿提供病原学证据中,Q-PCR与细菌培养方法检测阳性率相当。     

副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的实时荧光定量聚合酶链式反应的建立

目的:建立一个用于副溶血性弧菌致病性定量测定的检测体系.方法:以多组tdh基因的保守序列为基础,设计实时荧光定量PCR扩增适用的引物和TaqMan探针.以定量方式提取副溶血性弧菌基因组DNA,以tdh+菌株为阳性对照,建立实时荧光定量PCR方法.以tdh荧光定量结果与绝对菌数浓度作参比,以确定tdh基因在菌群中的拷贝水平.结果:使用正向序列5-GGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3(位置在467～487 bp处),反向序列5-ACCGC TGCCA TTG-TA TAGTC T-3(位置在571～551 bp处),TaqMan探针5-FAM-TGACA TCCTA CATGA CTGTG AAC-ECLIPSE-3(位置在517～539 bp处)建立一个实时荧光定馈PCR反应,目的片段长度105 bp.建立反应的DNA拷贝数对数值与Ct值线性关系为γ=-3.144 logx+43.229(r=0.997,P<0.001).建立了菌液A值与显微镜下绝对菌数浓度的相关关系为γ=2.0452x+6.2845(r=0.7828,P<0.01).根据tdh基因拷贝数与绝对菌数相比可计算tdh基因的单菌体拷贝量.结论:建立了一个定量副溶血性弧菌tdh基因拷贝水平的实时荧光定量PCR检测方法,可应用于副溶血性弧菌致病性的标准化定量测定体系.     

实时定量聚合酶链式反应与巢式聚合酶链式反应在 289例白血病融合基因检测中的比较

 目的 比较实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）与巢式聚合酶链式反应（nPCR）在白血病融合基因BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO检测中结果。方法 分别应用RT-PCR与nPCR对289例急慢性白血病初诊和完全缓解的患者BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO融合基因进行检测,结合患者骨髓细胞形态学及临床转归予以分析。结果 46例初诊慢性粒细胞白血病（CML）患者中,RT-PCR法与nPCR法检测BCR/ABL融合基因阳性率分别为95.7%和93.5%（P=0.997）;69例完全缓解CML患者中,RT-PCR法与nPCR法检测阳性率分别为78.4%和58.1%（P<0.005）。32例初诊急性早幼粒细胞白血病（APL）患者中,RT-PCR法与nPCR法检测PML/RARa融合基因阳性率分别为93.8%和90.6%（P=0.996）;114例完全缓解APL患者中,RT-PCR法与nPCR法检测阳性率分别为12.3%和7.0%（P<0.025）。12例初诊急性粒细胞白血病M2（ANLL-M2）患者中,RT-PCR法与nPCR法检测AML1/ETO融合基因阳性率分别为50.0%和50.0%（P=1.0）;16例完全缓解ANLL-M2患者中,RT-PCR法与nPCR法检测阳性率分别为50.0%和12.5%（P<0.05）。结论 RT-PCR较nPCR更为敏感而准确,应用RT-PCR可以提高微小残留病的检出率,为临床诊断和治疗提供更为有效的分子生物学依据。     

Per1和Per2基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

Per1和Per2是时钟基因和抑癌基因，其异常表达与生物体昼夜节律紊乱和对癌症的易感性存在密切联系。与传统mRNA定量方法相比，SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应具有简便、高效、成本低、准确性高、线性范围广的特点。本文建立了基于SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应的Per1和Per2基因的定量检测系统，为进一步研究不同疾病状态下时钟基因和昼夜节律的变化打下基础。     

荧光定量PCR检测HBV-DNA室内质控物的制备及初步应用

目的:利用混合血清自制荧光定量PCR HBV-DNA室内质控血清,并对其在日常工作中的应用进行评价.方法:分别留取进行健康体检的多人两对半全阴的血清作为基质,"大三阳"作为高值血清,"小三阳"作为低值血清,用全阴血清将高值和低值血清稀释至(5.0±2)×106拷贝/ml和(5.0±2)×103拷贝/ml两个水平.与临床样本采用荧光定量PCR方法同时检测,其结果计算X、S、CV值,并在Levery-Jennings室内质控图绘图,并结合应用Westgard多规则质控判断方法[1].结果:高值:X=6.758277(对数值),S=0.203284(对数值),CV=3.0%.低值:X=3.66921(对数值),S=0.32195(对数值),CV=8.77%.结论:利用混合血清制备的HBV-DNA室内质控物,其制备方便,结果稳定,有一定的实用价值.     

ALT检测室内质控方法的探讨

血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定是献血者血液检测指标之一,也是患者输血前检查指标之一,开展ALT检测室内质控对临床用血安全具有重要意义。目前获得ALT室内质控品的途径主要有两个,一是购买商品化的质控品,问题是存在批间差,更换批号必须重新绘制室内质控图;二是自制质控品,问题是存在技术和生物安全问题。本文对使用标本检测数据进行质量控制的方法进行了探讨,并在我市部分县级供血库试用,取得了较好的质控效果。     

实时定量聚合酶链反应技术研究进展

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是通过对基因的选定片段进行体外高效的扩增,实现对目的基因的检测。传统的PCR定量方法,如溴乙锭染色,测定的是PCR的终产物,而不是初始模板拷贝数,由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算     

实时荧光定量聚合酶链反应检测人锌指蛋白23方法的构建

目的建立检测人锌指蛋白23(human zinc finger 23,ZNF23)的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术。方法采用Primer Express Versions 3.0设计引物及TaqMan探针,检测ZNF23基因。将扩增的ZNF23基因片段纯化后与pMD19-T载体连接,克隆构建含ZNF23基因片段的重组质粒,作为定量检测ZNF23基因表达的标准品。结果 PCR扩增产物经测序分析证实为ZNF23特异性片段。本法灵敏度为650 copies/μL,线性范围为(6.50×102)-(6.50×107)copies/μL,相关系数R2为0.999,扩增效率E为97.28%,批间变异系数为0.78%～7.53%。结论成功建立了检测人ZNF23的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好、灵敏度高、通量高。     

HBV-DNA定量检测的室内质控分析

目的探讨实时荧光定量技术在HBV-DNA定量检测过程中的室内质控问题。方法采用TaqMan探针法,对质粒标准品高、中、低值在常规条件下与标本同时检测,求出均值和标准差,利用Excel折线散点图画出质控图,以（x=±2SD）为在控标准。结果四种质粒标准品S1的Ct值x=18.026,s=0.999;S2的x=21.902,s=0.947;S3的x=25.125,s=1.046;S4的x=28.035,s=0.965,连续20次测定均在控。结论实时荧光定量技术在HBV-DNA定量检测过程中的标准化和质量保证体系已经建立,而且稳定性良好。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测对结核病的诊断价值

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)(Gene-xpert)检测对结核病的诊断价值.方法 随机选取我中心在2019年4月至2020年2月就诊的结核病患者共100例作为研究对象,将给予涂片抗酸染色法视为对照组,将给予实时荧光定量PCR检测视为研究组,研究观察2组患者的检出率、灵敏度和特异度、实时荧光定量PCR检测...     

荧光定量聚合酶链反应诊断结核病临床应用研究

目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术诊断结核病临床应用价值。方法应用FQ-PCR技术检测患者痰、外周血、体液（包括各种渗出液及脑脊液）中结核分枝杆菌DNA（TB-DNA），并与定性PCR、常规细菌学涂片法和培养法比较。结果112例结核病患者FQ-PCR、定性PCR、涂片法和培养法检测各类标本阳性率为59．82％，88．82％，25．89％，29．46％，非结核组43例FQ-PCR法阳性率是2．32％，PCR法是18．60％，FQ-PCR检测其标本TB-DNA的特异性为97．67％，敏感度为59．82％，阳性预测值为98．53％。结论FQ-PCR检测TB-DNA是一种快速简便、敏感性、特异性、可信性较高的方法，对诊断结核病具有临床意义，且适用于临床检验实验室，其含量变化对判断疗效有一定的提示作用。     

ABO血型实验的室内质控方法探讨

目的探讨ABO血型实验的室内质控方法。方法用抗-A、抗-B标准血清验证A、B、O试剂红细胞,用A、B、O试剂红细胞验证抗-A、抗-B标准血清。质控结果正常后,进行献血者血型鉴定实验,并观察实验凝聚效果。结果2009年1～10月,室内质控共发现3次血型试剂异常情况,经更换合格试剂后正常。本站22051份无偿献血者血液标本的ABO血型检测结果均正常,未发生错报血型结果的情况。结论血型实验的室内质控,可以进一步提高血型实验的准确性;血站检验科在每天工作开始时,应进行血型实验的室内质控,以进一步提高输血安全水平。     

荧光定量聚合酶链反应检测HCV-RNA

丙型肝炎病毒 (HCV)是引起输血后肝炎的主要致病因子 ,在血中含量极微 ,免疫学标志仅有抗 HCV一项 ,而且抗 HCV出现较晚或不出现 ,所以单凭血清学诊断是不够的。为此 ,采用荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测血清中HCV RNA ,是确诊HCV感染的有效方法之一 ,可为制订治疗方案及疗效观察提供确切依据。1　材料与方法1 1　材料1.1.1　标本 :88份血清标本来源于哈尔滨医科大学第一临床医学院临床确诊的丙型肝炎患者。1.1.2　试剂 :①丙型肝炎 (HCV)核酸扩增 (PCR)荧光检测试剂盒 ,包括 :引物序列、荧光探针序列、RNA提取液、逆转录…     

荧光定量聚合酶链式反应联合检测性病病原微生物

目的：探讨荧光定量PCR联合检测性病病原体的,临床价值。方法：用荧光定理PCR（FQ—PCR）方法,对淋球菌（NGH）、沙眼衣原体（CT）、解脲支原体（UU）、梅毒螺旋体（TP）4种性病病原微生物进行定量测定,并与定性PCR比较。结果：两种PCR方法对NGH、CT、UU、和TP四种病原体检测的总符合率分别为94．83％、89．02％、95．79％、和95．65％,阳性率差异分别为1．72％、1．22％、2．11％和0,两种方法阳性率差异均无显著性意义（P〉0．05）。阳性标本定量平均拷贝数对数分别为6．71&#177;3．36、5．56&#177;2．48、6．83&#177;3．17和4．89&#177;3．52。结论：FQ—PCR操作简便、快速,并能准确定量。对于性传播疾病的诊断、病情的发展和预后监测、疗效评价、指导用药均具有很高临床应用价值。     

应用成本-效率质控方法开展实验室室内质控

近几年,卫生部临检中心努力在临床定量检验中推广成本一效率质控方法,但由于其理论相对复杂,在临床的应用当中,经常会遇到很多的困难。我科实验室、检验室自2008年1月～2008年12月开始尝试采用这种质控方法开展室内统计质量控制,以满足临床对检验质量的要求,提高质控效率,降低质控成本。现结合临床应用实践谈一下经验和体会。     

抗-HIV的室内质控探讨及质控图的绘制

抗-HIV阴性，是我国目前血液输用的主要指标之一。ELISA法检测抗-HIV，是目前我国各级血站普遍采用的方法，具有灵敏度高，但特异性较差的特点，且目前多肽试剂盒半衰期较短，稳定性较差。为保证试验质量，搞好室内质控势在必行。我们根据德州市中心血站化验室ELISA法检测抗-HIV室内质控图的制备及应用作一简述和探讨。