大鼠骨髓MSCs体外分离培养及多向分化的实验研究

目的：建立骨髓MSCs体外分离培养体系，并进行多向分化诱导，以证实其多向分化潜能，为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法：用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs，并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞进行诱导分化，并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果：用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs，细胞增殖活性强。经骨向诱导后，ALP和矿化结节染色阳性；免疫细胞化学染色提示神经向诱导神经元特异性标志蛋白NSE和NF200，成肌细胞标志蛋白Deamin和Connexin-43阳性表达。结论：采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系；并能够向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞分化。     

大鼠肺微血管内皮细胞培养方法的研究

目的 :探讨以简单有效的方法获取大鼠微血管内皮细胞 ,为构建含有血管的组织工程产品提供种子细胞。方法 :用出生 1d的SD仔鼠的肺组织进行肺微血管内皮细胞的组织块培养。用第四军医大学口腔医院组织工程中心设计的方法对其进行纯化 ,用经优化处理的内皮细胞培养液扩大培养。通过形态学、免疫组织化学、透射电镜鉴定其来源。结果 :用此法进行的原代培养 ,血细胞在换液和传代过程中被去除 ,成纤维细胞污染可经第四军医大学口腔医院组织工程中心设计的方案纯化去除。经鉴定获得的血管内皮细胞纯度较高 ,生长状态良好。结论 :由此获得的血管内皮细胞纯度高 ,生长状态良好 ,该方法可用于构建含有血管的组织工程实验研究     

血管瘤内皮细胞培养的研究进展

血管瘤是以血管内皮细胞增殖和肥大细胞聚集为特征的血管性疾病,以前的研究多局限于免疫组化及临床研究。近年来,一些学者用细胞培养的方法研究血管瘤并取得了可喜的成果。本文综述了血管瘤内皮细胞培养方法的发展,以及通过此方法发现的血管瘤内皮细胞生物学性状,为血管瘤的进一步研究提供参考。     

血管瘤内皮细胞培养的研究进展

血管瘤是以血管内皮细胞增殖和肥大细胞聚集为特征的血管性疾病,以前的研究多局限于免疫组化及临床研究。近年来,一些学者用细胞培养的方法研究血管瘤并取得了可喜的成果。本文综述了血管瘤内皮细胞培养方法的发展,以及通过此方法发现的血管瘤内皮细胞生物学性状,为血管瘤的进一步研究提供参考。     

人静脉畸形内皮细胞的分离培养和鉴定

目的 建立一个稳定的人血管畸形内皮细胞体外培养体系。方法 取人静脉畸形组织块接种于铺有明胶底层的培养瓶中进行原代及传代培养。通过早期去除组织块、机械刮除及酶消化法纯化内皮细胞。对培养的细胞进行形态学观察及免疫组化染色等一系列细胞定性研究。结果 获取的内皮细胞可连续传代4－5代,成活40－50d;生长于玻璃、塑料上的细胞呈铺路石状;生长于明胶底层上的细胞可形成毛细血管样结构;电镜下可见细胞具有Weiber-Palade小体特征性超微结构;CD34及vWF免疫组化染色阳性,α－SMA染色阴性。结论 应用此培养方法可获得纯化的血管畸形内皮细胞,且细胞可连续传代培养。培养的血管畸形内皮细胞可用于体外研究血管畸形的生物学行为。     

人血管内皮细胞的体外培养

目的:观察体外培养的血管内皮细胞的生物学特性.方法:应用酶消化法获取人主动脉和脐静脉血管内皮细胞,体外培养并传代;观察细胞形态、测定生长曲线和培养液中6-酮-PGF1α的分泌量,应用免疫组化法对其进行鉴定,并对两种来源内皮细胞的生物学特性进行比较.结果:应用酶消化法成功获取了人主动脉和脐静脉血管内皮细胞.两种来源的内皮细胞细胞形态相仿,均具有较强的生长增殖能力,在细胞对数生长期分泌PGI2的能力旺盛.结论:人主动脉和脐静脉均是良好的血管内皮细胞来源材料,适于体外培养,二者的生物学特性相似.     

人淋巴管内皮细胞的分离和鉴定

目的:分离培养人淋巴管内皮细胞(LECs),为研究淋巴管新生在淋巴管瘤复发及肿瘤淋巴结转移中的作用奠定基础。方法:HE染色和免疫组织化学法了解人淋巴管瘤的组织病理特征;胶原酶消化法从淋巴管瘤组织中分离淋巴管内皮细胞;光镜和透射电镜观察淋巴管内皮细胞的形态和超微结构;MTT法检测细胞体外增殖。结果:HE染色显示舌淋巴管瘤中具有大量扩张的管腔,免疫组织化学染色显示管腔内皮细胞表达FLT-4、和LYVE-1;体外培养的淋巴管内皮细胞呈"铺路石"样外观;在透射电子显微镜下,观察到淋巴管内皮细胞特征性细胞器如weibel-palade小体、胞质小突和质膜小泡;MTT结果显示细胞于第3天开始进入增殖活跃期,第5天进入高峰期,第6、7天进入平台期;在Ⅰ型胶原凝胶中细胞形成管腔样结构。结论:应用胶原酶消化法可以有效的从淋巴管瘤组织中分离得到淋巴管内皮细胞。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨作用的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞在体外条件培养下的成骨能力，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法取大鼠骨髓基质干细胞进行体外培养，用倒置相差显微镜、钙染色、扫描电镜和X线能谱等手段观察细胞的生长情况和矿化能力。结果细胞呈贴壁型生长，形态为梭形或多角形，在条件培养液中这些细胞间不发生接触抑制，而是相互重叠成多层，形成钙化结节，与成骨细胞的特点相符合。碱性磷酸酶染色呈强阳性，结节钙染色阳性，X线能谱分析显示结节的主要组成元素为钙和磷。结论体外培养的大鼠骨髓基质干细胞具有与成骨细胞相似的形态特征，并能在体外形成钙化的新骨结节。     

血管内皮细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞生物学效应的研究

目的:体外研究腺病毒AdCMV转染VEGF基因对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及功能分化的影响.方法:体外培养扩增大鼠BMSCs,AdCMV-EGFP转染BMSCs,确定重组腺病毒的最适MOI,应用MTT法检测转染AdCMV-VEGF对大鼠BMSCs增殖的影响.采用RT-PCR方法检测转染后细胞VEGF的表达,通过检测成骨条件培养液诱导培养后细胞的碱性磷酸酶活性评价BMSCs向成骨细胞分化的能力.结果:AdCMV-EGFP在400particle/cell时转染效率最高,且对细胞无毒副作用,未转染细胞、AdCMV-EGFP转染细胞与AdCMV-VEGF转染细胞光吸收(A)值在转染后第3天存在明显差异(P<0.05).RT-PCR检测AdCMV-VEGF转染细胞有VEGF基因的表达,未转染AdCMV-VEGF细胞组未见VEGF基因mRNA的表达.通过成骨诱导后AdCMV-VEGF转染细胞碱性磷酸酶活性明显高于未转染AdCMV-VEGF细胞(P＜0.05).结论:在体外AdCMV-VEGF能够成功转染大鼠BMSCs,能够促进BMSCs的增殖和向成骨细胞的分化.     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及向成骨细胞分化诱导

目的:探讨体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,并观察其向成骨细胞分化的潜能。方法:采用贴壁分离法分离培养兔BMSCs,通过细胞形态学观察和细胞表面抗原检测对细胞进行鉴定,并向成骨细胞分化诱导培养,通过钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。结果:分离培养3d,可见贴壁细胞呈三角形、成纤维形或多角形外观,培养10～12d细胞长满瓶底,传代后细胞增殖明显加快;使用条件培养基传代培养2周,细胞呈集落生长后开始形成钙结节,茜素红染色阳性。结论:全骨髓贴壁法是一种简单实用的分离培养方法,可获得纯度较高的兔BMSCs,经过诱导后可向成骨细胞分化。     

骨髓基质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓基质干细胞低氧条件下培养后的成骨能力

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导内皮细胞(ECs)与自体BMSCs低氧条件下联合培养对BMSCs成骨能力的影响.方法:体外分离培养兔BMSCs并向ECs诱导培养,用CD34免疫细胞化学染色鉴定内皮细胞表型:实验分组为BMSCs常氧成骨诱导培养组,BMSCs低氧成骨诱导培养组,BMSCs+ ECs常氧成骨诱导联合培养组BMSCs+ECs低氧成骨诱导联合培养组,持续培养7d,前6d应用PNPP法每天固定时间测定碱性磷酸酶(ALP)活性并作统计学分析;茜素红染色观察第7d矿化结节形成情况.低氧组为1.0％O2浓度.采用SPSS11.0软件包对数据进行方差分析和q检验.结果:BMSCs在一定诱导条件下可诱导为ECs,CD34免疫细胞化学染色为阳性;统计学分析表明,BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组的ALP活性表达显著高于其他3组(P＜0.05).只有BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组有钙化结节形成,茜素红染色呈橘红色.结论:在一定时间内,由BMSCs诱导来源的ECs与自体BMSCs低氧条件下联合培养,BMSCs的成骨活性可显著提高.     

内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞－种植体复合物成骨能力的影响

目的：研究内皮祖细胞（EPCs）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜片－种植体复合体成骨能力的影响。方法：分离培养大鼠 BMSCs 并采用细胞膜片技术培养细胞膜片;分离培养大鼠骨髓来源 EPCs;将 EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片上并检测相关基因;制作细胞膜片－种植体复合体并植入裸鼠皮下,8周取材,行 Micro-CT 检查及组织学检测。结果：体外实验显示EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片后成骨相关 Runx-2、ALP、BMP2和成血管相关 VEGF 的基因表达提高;裸鼠体内实验取材 Mi-cro-CT 检查显示加载 EPCs 组成骨量较高,HE 切片显示加载 EPCs 组成骨面积较多,免疫组化检测显示加载 EPCs 组 Runx2、BMP2表达较高。结论：加载 EPCs 能提高 BMSCs-种植体复合物的成骨能力。     

体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性

目的：研究体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性及基成骨细胞表型特征。方法：分离大鼠四肢长骨髓基质细胞,常规和矿化培养液培养,测定细胞生长曲线,碱性成纤细胞生长因子（bFGF）、重组人骨形成蛋白－2（rhBMP-2)及矿化培养液对骨髓基质细胞性磷酸酶（ALP）活性的影响,观察矿化结节的形成。结果：大鼠骨髓基质细胞群体倍增时间（DT）为66．1h;在矿化液培养条件下细胞DT为50．3h。bFGF和rhBMP－2均不同程度增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶的活性。矿化液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用,用茜素红染色法显示较多的深红色矿化结节。常规培养条件下大鼠骨髓基质细胞生长虽呈现密集单层,没有矿化结节形成。结论：大鼠骨髓基质细胞在体外可以稳定传代培养,在矿化培养液诱导培养条件下可以向成骨细胞分化,bFGF和rhBMP－2有助于骨髓基质细胞表现成骨细胞表型特征,提示骨髓基质细胞在骨移植研究领域有重要的应用价值。     

大白鼠骨髓间质干细胞体外培养体系的建立及分化研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外培养体系，对大白鼠BMMSCs体外培养的条件，供体大白鼠鼠龄等进行了研究。对体外培养的大白鼠BMMSCs的形态学，增殖动力学，成骨的表面标记及体外钙化能力进行了系列研究，方法：取2月龄SD大鼠胫骨和股骨骨髓进行体外培养，取第二代BMMSCs,绘制生长曲线并计算群体倍增时间，对经成骨诱导剂诱导的BMMSCs的ALP表达及体外钙沉积进行了研究。结果：细胞呈长梭形或多角形，细胞表面有不规则的细胞突起，秀射电镜可见胞浆有大量的粗面内质网及线粒体，细胞表面可见突起，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为72小时，经诱导分化的BMMSCs可见碱性磷酸酶的表达。von Kossa染色可见散在深染的钙沉积班块。结论：来源于年轻大鼠股骨骨髓的间质干细胞体外培养并经诱导后可分化为具有部分成骨特性的细胞，可以为体内骨组织工程提供组织细胞。     

大鼠骨髓间充质细胞电离辐射敏感性的体外实验研究

目的 研究大鼠骨髓间充质细胞（BMSCs）对体外电离辐射的敏感性。方法 分离SD大鼠BMSCs并进行体外培养。第3代细胞给予体外电离辐照处理,剂量分别为0、4、8、10 Gy。CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,实时定量荧光PCR检测辐照后24 h和7 d Casepase-3及Cyclin-D1基因的表达。采用SPSS20.0软件包对数据进行统计学分析。结果 成功分离并体外培养大鼠BMSCs。电离辐照后,增殖曲线提示10 Gy剂量组较对照组生长速度快。凋亡检测提示10 Gy剂量组死亡细胞及晚期凋亡细胞比例较对照组显著升高。10 Gy剂量辐照后,Cyclin-D1基因在辐照后第24小时（P<0.01）和第7天（P<0.001）表达显著上调。Casepase-3基因在10 Gy辐照后24 h显著上调（P<0.01）。结论 BMSCs在体外对电离辐射具有一定的抵抗性。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、低温冻存及复苏研究

目的寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质十细胞（bone marrow mesenehymal stein cell,BMMSC）的方法,观察体外培养BMMSC的形态及生长特性,研究低温冻存对兔BMMSC生长的影响,为兔BMMSC进一步的实验研究打下基础。方法取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,并行液氮冻存3个月。通过倒置显微镜观察其生物学表现,并进行细胞增殖活性分析．绘制生长曲线。结果兔BMMSC为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论兔BMMSC可采取密度梯度离心法联合贴壁培养法进行较好地纯化和扩增,并町长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活,冻存不影响细胞的增殖能力。     

密度梯度离心和贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性和成骨功能比较

目的　通过比较密度梯度离心和贴壁筛选两种方法所获MSCs的增殖活性和成骨功能,探索骨髓MSCs体外分离和纯化较好的方法,为MSCs进一步的试验研究提供依据。方法　应用密度梯度离心和贴壁筛选两种方法分离纯化骨髓MSCs ,并通过MTT法检测其增殖活性。用第三代MSCs进行骨向诱导,以观察两种方法所获MSCs是否有相似的骨向分化能力。结果　密度梯度离心法所获MSCs纯度高,杂质细胞少,增殖活性强,常表现为梭形和小多角形,7到1 0天内便可达到融合。而贴壁法所获MSCs纯度低,红细胞、破骨样细胞等杂质细胞较多,增殖速度相对较慢,且经数次传代仍有较多杂质细胞存在。经骨向诱导后,两种方法所获MSCs表现出相似的ALP活性和矿化结节形成能力。矿化结节数目在两组比较无显著性差异(P >0 .0 5 )。结论　密度梯度离心法是体外分离和纯化骨髓MSCs较好的方法,所获细胞增殖活性高。两种方法所获MSCs具有相似的骨向分化能力。     

可注射壳聚糖温敏水凝胶对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的:探讨可注射壳聚糖(chitosan,CS)基温敏水凝胶对犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)生物学活性的影响。方法:利用密度梯度离心法获得犬BMSCs,含10%胎牛血清的L-DMEM培养液进行原代培养并进行初步鉴定。合成壳聚糖温敏水凝胶,光镜下观察BMSCs在凝胶中的存活情况。制备凝胶浸提液,检测其对细胞增殖分化的影响。采用SPSS13.0软件包对实验数据进行单因素方差分析。结果:犬BMSCs可在壳聚糖温敏凝胶中存活。壳聚糖浸提液组对BMSCs的增殖与正常培养液组相比,无显著性差异;但在培养第1、4、7天时,矿化培养液组和矿化浸提液组的细胞增殖率明显低于未矿化的完全培养液组和壳聚糖浸提液组,第10天时,4组间无显著性差异。壳聚糖矿化浸提液组碱性磷酸酶和骨钙素活性明显提高。结论:制备的壳聚糖温敏水凝胶具有良好的生物相容性,可进行水凝胶复合BMSCs的体内外实验研究。     

体外培养人骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞的超微结构变化

目的通过透射电子显微镜对体外培养过程中不同代次的人骨髓基质干细胞的超微结构的观察分析,进一步了解骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的过程。方法将临床自愿捐献骨髓的无血液系统疾病患者的骨髓体外分离培养诱导,分别在原代,1代,2代,3代细胞达到融合后,2.5%戊二醛4℃原位固定1h后,送透射电子显微镜检测,观察细胞内细胞器、细胞间质及钙盐沉积状况,免疫组化检测Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶染色及VonKossa染色,放免法测定骨钙素分泌情况。结果透射电镜显示,1代、2代、3代的骨髓基质干细胞超微结构有明显变化,第1代细胞内出现大量的溶酶体;第2代细胞内粗面内质网、高尔基体、线粒体增多;第3代细胞外基质中出现排列规律的胶原纤维以及初期和成熟的钙化基质。免疫组化I型胶原表达第3代细胞达到最强;碱性磷酸酶染色第2、3代ALP染色蓝紫色颗粒加深、增多;放免法测定骨钙素分泌第3代细胞达到最强。结论骨髓基质干细胞经过体外培养诱导从原代到第3代逐步向成骨细胞方向分化,具备成骨细胞的特征。由透射电镜反映出的细胞器及细胞外间质的变化为进一步探讨骨髓基质干细胞的分化机制提供了一定的实验依据。