柯萨奇病毒B组3型VP1和IL-15双表达基因疫苗对小鼠的免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B3(CoxsackievirusB3,CVB3)VP1与白细胞介素 15 (interleukin 15 ,IL 15 )双表达基因疫苗 ,并观察其对小鼠的免疫效果。方法从CVB3VP1基因的重组质粒 pcDNA3/VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因 ,克隆至IL 15基因重组质粒 pcDNA3/IL 15 ,构建成双表达重组质粒 pcDNA3/VP1 IL 15 ,转化DH5a大肠杆菌 ,大量扩增后 ,肌内注射Balb/c小鼠 ,1次 /周 ,共 3次 ,每次免疫后第 6天取血清 ,用微量中和试验方法检测血清中和抗体。第 3次免疫后的第 7天 ,用 80 0TCID5 0CVB3感染小鼠 ,观察各组小鼠的生存情况。结果构建的 pcDNA3/VP1 IL 15重组质粒目的基因与CVB3 VP1和IL 15的序列相同 ;免疫小鼠后 pcDNA3/VP1 IL 15重组质粒能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加而提高 ;病毒攻击后 pcDNA3/VP1 IL 15和 pcDNA3/VP1 pcDNA3/IL 15组较其他组生存时间明显延长 (P <0 .0 5 )。结论本研究成功构建了 pcDNA3/VP1 IL 15真核双表达重组质粒 ;该质粒能诱导机体产生中和抗体 ,对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用。     

柯萨奇病毒B组3型VP1和IL-15双表达基因疫苗对小鼠的免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)VP1与白细胞介素-15(interleukin-15,IL-15)双表达基因疫苗,并观察其对小鼠的免疫效果.方法从CVB3 VP1基因的重组质粒pcDNA3/VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因,克隆至IL-15基因重组质粒pcDNA3/IL-15,构建成双表达重组质粒pcDNA3/VP1-IL-15,转化DH5a大肠杆菌,大量扩增后,肌内注射Balb/c小鼠, 1次/周,共3次,每次免疫后第6天取血清,用微量中和试验方法检测血清中和抗体.第3次免疫后的第7天,用800TCID50 CVB3 感染小鼠,观察各组小鼠的生存情况.结果构建的pcDNA3/VP1-IL-15重组质粒目的基因与CVB3-VP1和IL-15的序列相同;免疫小鼠后pcDNA3/VP1-IL-15重组质粒能诱导机体产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数增加而提高;病毒攻击后pcDNA3/VP1-IL-15和pcDNA3/VP1+pcDNA3/ IL-15组较其他组生存时间明显延长(P<0.05).结论本研究成功构建了pcDNA3/VP1-IL-15真核双表达重组质粒;该质粒能诱导机体产生中和抗体,对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用.     

CVB3VP1与IL-2基因双表达重组质粒的构建及免疫效果

目的 探讨白细胞介素-2(intefleukin-2，IL-2)基因佐剂对柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法 从CVB3VP1基因的重组质粒peDNA3／VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因，克隆至pcDNA3／IL-2，构建成CVB3VP1基因和IL-2基因双表达质粒pcDNA3／VP1-IL-2，转化DH5a大肠杆菌。将peDNA3／VP1-IL-2、peDNA3／IL-2 peDNA3／VP1、pcD．NA3／VP1、peDNA3／IL-2、空白质粒peDNA3和生理盐水分别肌肉注射BALB／C小鼠，每周注射1次，共注射3次，每次注射后的第6天，断尾取血，用微量中和试验方法检测血清中和抗体；第3次注射后的第7天，用800TCID50CVB3感染小鼠，观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1-IL-2、pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1和pcDNA3／VP1组小鼠能产生中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高，pcDNA3／VP1-IL-2和pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1组抗体水平高于同期pcDNA3／VP1组抗体水平，但各组小鼠的生存率无明显差异。结论IL-2基因单独或与VP1基因共表达对pcDNA3／VP1诱导抗体产生均有一定免疫增强作用。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 ,但免疫小鼠对致死量的CVB3感染无明显保护作用     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒诱导小鼠中和抗体反应

以构建的柯萨奇病毒Ｂ 组３ 型（ＣＶＢ３）ＶＰ１ 基因的真核表达重组质粒ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ 作为候选的基因疫苗,评价其诱导小鼠产生的中和抗体反应。大量制备并提纯ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ ＤＮＡ,用其接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清进行病毒中和试验。结果证明其可诱导小鼠机体产生特异性中和抗体,并能中和ＣＶＢ３ 毒力,起到基因疫苗的预防作用。     

CVB3cDNA重组质粒pGP51B转化作用的实验研究

以大肠杆菌ＨＢ１０１菌株为受体菌，研究了ＣａＣｌ２浓度，转化时间及转化 温育时间对柯萨奇Ｂ组病毒３型ｃＤＮＡ重组质粒ｐＧＰ５１Ｂ转化作用的影响。实验结果表明，ＣａＣｌ２浓度和转化时间对转化率的影响极为显著，而转化后的能时间对转化率的影响不明显。     

白细胞介素-2基因佐剂对柯萨奇病毒B3 VP1基因疫苗的免疫增强作用

目的探讨白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL 2 )基因佐剂对柯萨奇病毒B3(CoxsackievirusB3,CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法将 pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1、pcDNA3/VP1、pcDNA3/IL 2、空白质粒 pcDNA3和生理盐水分别肌内注射免疫BALB/C小鼠 ,1次 /周 ,共注射 3次 ,每次注射后的第 6天断尾取血 ,用微量中和试验方法检测血清中和抗体 ;第 3次注射后的第 7天用 80 0TCID50 CVB3感染小鼠 ,观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1和 pcDNA3/VP1组小鼠能产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加而提高 ,pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1组抗体水平高于同期 pcDNA3/VP1组抗体水平 ,但各组小鼠的生存率无显著性差异(P >0 .0 5 )。结论IL 2基因佐剂对 pcDNA3/VP1诱导抗体产生有一定免疫增强作用。     

GM-CSF/IL-15融合基因原核表达载体的构建及表达

目的构建原核表达质粒pPROEX^TM HTb—GM—CSF／IL-15并在大肠杆菌DH5α中表达，以期获得具有GM—CSF／IL-15双重活性的融合蛋白。方法利用分子生物工程技术，构建重组原核表达载体pPROEX^TM HTb-GM-15，并转化进大肠杆菌DH5α IPTG诱导表达4h后，经SDS-PAGE、免疫印迹证实为GM-15融合蛋白。结果重组载体经转化大肠杆菌DH5α后，诱导表达出相对分子质量约为33kD左右的融合蛋白。结论构建了pPROEX^TM HTb—GM—CSF／IL-15融合基因表达系统，并诱导表达出GM-15融合蛋白。     

扩张型心肌病患者血清sICAM-1的变化及与CVB感染的关系

目的 检测扩张型心肌病患者血清可溶性细胞间粘附分子-1（sICAM-1）的变化及与柯萨奇B组病毒（Coxsackievirus B，CVB）感染的关系，探讨扩张型心肌病的发病机制。方法 用酶联免疫吸附法测定42例扩张性心肌病患者、36例健康对照者血清中sICAM-1和CVB—IgM水平，并进行分析。结果 扩张型心肌病组血清sICAM-1水平明显高于对照组（P〈0．01）；心功能越差，血清sICAM-1水平越高；扩张型心肌病组CVB—IgM阳性率显著高于健康组（χ^2=11．56，P〈0．01）；患者CVB—IgM（＋）者血清sICAM-1水平显著高于CVB—IgM（-）患者（P〈0．01）。结论 在扩张型心肌病的发生发展中免疫反应和柯萨奇病毒感染炎性反应之间可能存在交叉反应现象；sICAM-1可作为血清学指标，在临床上为判断扩张型心肌病炎症活动和心功能状况提供间接依据。     

人MxA基因重组真核载体的构建及鉴定

目的:应用真核载体PcDNA3.1构建含我国健康人目的基因MxA的重组真核载体PcDNA3.1-MxA.方法:在大肠杆菌JM109中扩增前期已构建的含有目的基因MxA的PAdtrack-MxA和真核载体PcDNA3.1,使用两者共同的限制性内切酶XbaⅠ、Not Ⅰ进行双酶切,并连接以构建重组真核载体PcDNA3.1-MxA,然后通过氨苄青霉素抗性筛选,双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序,并应用DNAssist 2.0软件对序列与前期获得的基因序列以及已知GenBank中MxA基因序列进行同源性分析.结果:经限制性内切酶、PCR鉴定重组真核载体PcDNA3.1-MxA构建成功.测序结果表明本实验所克隆片段长2012bp,包含人MxA基因序列,核苷酸序列分析表明与前期获得的目的基因序列完全相同,而与GenBank中人MxA基因序列同源性也达99.75%,仅有5个碱基不同,且所编码的氨基酸仅1个发生改变,此氨基酸位于MxA蛋白的非功能区.结论:重组真核载体PcDNA3.1-MxA构建成功,为下一步研究MxA抗乙型肝炎病毒作用奠定了基础.[关键字]MxA;PcDNA3.1;PcDNA3.1-MxA     

HO-1基因真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1的构建及表达

目的:构建人HO-1真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1并检测其表达。方法:利用分子生物学技术,将hHO-1基因与质粒pcDNA3.1连接,构成重组质粒并用RT-PCR及Western blotting方法检测重组载体在Eca-9706细胞中的表达情况,最终确定重组载体是否构建成功。结果:用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,RT-PCR检测,Western blotting检测证明hHO-1成功克隆入表达载体pcDNA3.1中。结论:本部分实验成功构建了能够在细胞内大量表达HO-1基因产物的真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1,为进一步实验奠定基础。     

人WAF1基因表达质粒的构建

目的 :克隆人 WAF1基因 ,构建成 WAF1 - pc DNA3真核表达质粒。方法 :采用逆转录聚合酶链反应从 Hela细胞中扩增人 WAF1基因 ,并克隆到 pc DNA3真核克隆载体中。结果 :从 Hela细胞扩增的人 WAF1基因克隆至真核克隆表达载体 pc DNA3中 ,经 DNA直接测序 ,获得了 WAF1 -pc DNA3重组质粒。结论 :成功地构建人 WAF1表达质粒 WAF1 - pc DNA3,为进一步研究 WAF1基因表达及生物学效应奠定了基础。     

人DNMT3B1原核表达载体的构建和表达

目的构建人DNMT3B1原核表达载体,并进行初步表达。方法据Genebank中人DNMT 3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到原核表达载体PGEX-4T.3中,并对重组质粒进行鉴定。转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。结果 PCR扩增得到人DNMT 3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到原核表达载体PGEX-DNMT3B1I,PTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明目的蛋白在E.coli BL21（DE3）中高效表达,相对分子质量约为100 kd。结论成功构建了人DNMT3B1原核表达载体并完成其在E.coli BL21（DE3）中的诱导表达,为进一步在体外研究DNMT3B异构体提供了条件。     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因原核表达质粒的构建与表达

目的 构建人呼吸道合胞病毒（hRSV）MS－1基因原核表达质粒载体,使其于原核细胞中表达。方法 利用Hep-2细胞培养hRSV,提取感染细胞总RNA,通过RT－PCR扩增M2－1基因片段。目的片段与质粒pGEX-2Tx EcoRI、XhoI双酶切后,连接、转化,筛选出阳性克隆。阳性克隆菌经诱导剂诱导后,表达M2－1融合蛋白。结果 成功地构建了M2－1基因原核表达质粒载体,实现了其于原核中的表达。结论 建立了hRSV基因M2－1原核表达载体,为进一步研究hRSV奠定基础。     

介导人血红素加氧酶-1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建含人血红素加氧酶-1(HO-1)基因的重组pcDNA3.1质粒并进行鉴定.方法:利用分子生物学技术,从人肝脏标本中提取出RNA,进行RT-PCR后,做TA克隆,成功获得pMD/19-HO-1质粒,采用限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ从pMD/19-HO-1质粒中将目的基因片段切出,克隆到质粒pcDNA3.1的相应酶切位点中,构建重组质粒pcDNA3.1-HO-1,采用限制性酶切、DNA测序鉴定,将构建好的质粒瞬时转染ECV304细胞株,Western blot测定HO-1表达.结果:酶切、测序鉴定证实插入位点及方向与预期完全一致,测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致,瞬时转染细胞后HO-1蛋白表达明显增高.结论:成功构建了含人血红素加氧酶-1基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在糖尿病血管并发症中的作用奠定基础.     

人类细胞周期蛋白D3反义表达质粒的构建

目的：构建人类细胞周期蛋白D3(cyclin D3)反义表达质粒，为今后利用反义核酸阻断技术研究cyclin D3基因的功能提供基础。方法：运用DNA重组技术将人cyclin D3基因反向克隆到真核表达载体pcDNA3．1中，构建成cyclin D3反义表达质粒pcDNA3--ascyclinD 3。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，实验成功构建了人cyclin D3反义表达质粒。结论：cyclin D3反义表达质粒pcDNA3--ascyclin D3的成功构建，为进一步研究cyclin D3的生物学功能及其在肿瘤发生、发展、诊疗和预后中的作用奠定了基础。     

MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达

目的构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E．coli）BL21中的表达，为制备以黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础。方法通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法制备MAGE-3目的基因，以pGEM—T Easy为克隆载体，DGEX-4T-1为原核表达载体，将MAGE-3目的基因克隆至pGEM—TEasy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上。筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E．coli BL21．经IPTG诱导，12％SDS—PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3；在E．coli BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35kD的融合蛋白；基因测序结果表明，阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致。结论成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础；为后续实验提供了依据。     

rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化

目的：构建人肿瘤坏死因子样分子1A（TL1A）原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法：人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15［pREP4］。IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni²⁺-NTA)纯化靶蛋白。结果：目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15［pREP4］经IPTG诱导表达相对分子质量约22 000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His单克隆抗体特异性结合。结论：成功地构建了重组原核表达质粒pQE-Tl1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白。