大鼠延髓和脊髓背角的PKCγ阳性神经元向丘脑胶状核投射

目的 :观察大鼠延髓和脊髓背角内蛋白激酶Cγ亚单位 (PKCγ)阳性神经元向丘脑胶状核的投射。方法 :荧光金 (FG)逆行追踪与PKCγ免疫荧光组织化学染色相结合的双标记技术。结果 :PKCγ阳性神经元主要分布于大鼠延髓和脊髓背角的II层内侧部及II、III层交界处 :将FG注入丘脑胶状核后 ,在延髓背角的I、III层和脊髓背角的I、III、V层及外侧脊核内可见FG标记神经元 ;延髓和脊髓背角I层的部分FG标记神经元呈PKCγ阳性。结论 :大鼠延髓和脊髓背角的PKCγ阳性神经元向丘脑胶状核投射 ,它们可能参与将伤害性刺激信息向丘脑的传递。     

内源性大麻素类似物NAGly对大鼠脊髓胶状质神经元的突触传递的抑制作用

目的:探讨内源性大麻素类似物N-花生四烯酰甘氨酸(N-arachidonylglycine,NAGly)对脊髓后角II层胶状质(SG)神经元突触兴奋性的影响。方法:选用生后4~6周雄性SD大鼠,深麻醉后蔗糖人工脑脊液快速心脏灌注处死,取脊髓腰膨大段,制备保留脊髓腰膨大处一侧后根的脊髓矢状切片。利用膜片钳技术,对脊髓后角II层SG神经元进行全细胞记录,通过分析后根刺激诱发的兴奋性突触后电流(eEPSC)的变化情况,观察NAGly(20μmol/L)对SG神经元突触传递兴奋性的影响,以及对自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)的发放频率及幅度的影响。结果:通过诱发刺激的强度、潜伏期以及纤维传导速度我们将记录到的SG神经元分为Aδ纤维/C纤维投射神经元,NAGly对Aδ纤维和C纤维介导的eEPSC的幅度都有明显的抑制作用(P0.001),并且这种作用可以被洗脱。NAGly对SG神经元的sEPSC的频率有明显的抑制,但不明显改变其幅度,提示其作用部位在突触前。结论:内源性大麻素类似物NAGly可以抑制脊髓后角浅层Aδ纤维及C纤维介导的突触传递,并通过突触前机制抑制SG神经元的兴奋性。提示内源性大麻素类似物NAGly可通过抑制伤害性C和A纤维介导的突触传递发挥镇痛作用。     

培养脊髓神经元中微管相关蛋白5的表达

目的　探讨初代培养脊髓神经元中微管相关蛋白 (MAP5 )的表达特征及其调节因素。方法　应用荧光免疫细胞化学检测初代培养脊髓神经元中MAP5的表达。结果　MAP5在培养脊髓神经元中呈网状分布在胞浆及突起中。诺考达唑引起微管解聚及MAP5的结构破坏 ,荧光物质分布不均匀 ,突起呈串珠或断裂。PMA(phorbol 12 myristate 13 acetate)能诱发微管及MAP5聚合 ,胞浆中荧光物质呈疏松的网状结构。结论　MAP5在初代培养脊髓神经元胞浆及突起中明显表达 ,且表达受微管解聚剂诺考达唑及微管聚合剂PMA的调控。     

脊髓后角Ⅱ层神经元的神经生理学特征

痛与镇痛都属于神经机制 ,是伤害性刺激信息在中枢内传递和调控的结果。脊髓后角浅层是接受躯体性伤害性信息传递的初级门户和对伤害性信息进行处理的重要部位 ,是探索躯体痛和镇痛机制的首当其冲的脑区。现已公认 ,脊髓后角 (在脑干与它相当的是三叉神经脊束核尾侧亚核 )浅层 ,尤其是 II层 (胶状质 ,Substantia gelatinosa,SG)是外周躯体性伤害性信息的主要投射部位和处理伤害性信息的局部环路所在 ;近年来的研究又证明 ,SG也是脑内下行抑制系统的投射部位和调控外周伤害性信息的镇痛局部环路所在。这两种环路的关系复杂 ,但却又正是阐…     

表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒伴随病毒的产生

来源于维多利亚水母 (Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃ ｔｏｒｉａ)的绿色荧光蛋白 (ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ,ＧＦＰ)是近年来发现的一种新的报告基因 ,由于其具有产生荧光不需任何底物或辅助因子、可以活体观察等特点 ,因此在目前的基因转移、基因治疗研究中得到了广泛的应用[1 ] 。重组腺病毒伴随病毒 (ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ,ｒＡＡＶ)具有安全性好、可介导外源基因长期稳定表达等特点 ,是目前比较理想的基因治疗载体。构建表达ＧＦＰ的ｒＡＡＶ载体 (ｒＡＡＶ ＧＦＰ)对于…     

siRNA抑制外源绿色荧光蛋白在neuro-2a细胞株中的表达

目的：用RNAi技术抑制哺乳动物神经元中外源报告基因的表达，并探讨该过程中RNAi的时间及剂量效应，为利用RNAi技术研究神经元基因功能提供参考。方法：采用神经细胞来源的细胞系neuro-2a小鼠神经瘤细胞为模型，将外源绿色荧光蛋白（GFP）基因转染到neuro-2a细胞内，利用体外转录法合成siRNA，分为3个剂量组对其进行干扰。结果：Neuro-2a细胞可以被有效地转染，而且siRNA在neuro-2a细胞内可以有效发挥干扰作用。这种干扰作用呈现出一定的剂量效应。结论：RNAi技术可以成功用于neuro-2a细胞抑制基因的表达，这种对GFP表达规律及RNAi剂量效应的研究为利用RNAi技术研究神经元基因功能提供了一定的理论参考和依据。     

神经组织特异表达绿色荧光蛋白转基因小鼠的脑组织形态观察

目的 建立神经组织特异表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠,为神经系统的形态学观察提供可以荧光示踪的工具动物.方法 把增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 因插入血小板源性生长因(PDGF)B-链启动子下游构建转基因载体,用显微注射的方法建立转基因C57BL/6J小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因表型,对阳性转基因小鼠的脑组织进行矢状面冷冻切片,分别进行HE染色,显微镜观察组织结构,荧光体视镜及荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)在神经组织的表达.结果 在8个首建品系中筛选出1个神经组织高表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠系.观察到绿色荧光蛋白在大脑皮层、海马、丘脑、小脑及脑干等部位表达.结论 建立了稳定遗传的神经组织特异表达绿色荧光蛋白转基因小鼠品系,为神经系统的生理学及病理学研究提供了可以荧光示踪的模型动物.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞

目的 研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓基质细胞(GFP-GM-BMSCs)在体外无血清培养基+神经细胞因子诱导条件下,向神经细胞分化的能力。方法 用贴壁法体外培养GFP-GM-BMSCs,取第3代GFP-GM-BMSCs,用含浓度均为20μg/L的表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清培养基（neurobasal-A+2%B27）诱导分化。第5天用免疫细胞荧光方法检测巢蛋白(nestin)的表达,第10天用神经元烯醇化酶 (NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学方法鉴定阳性细胞。结果 GFP-GM-BMSCs经无血清培养基+神经细胞因子诱导后,细胞胞体变圆,伸出细长突起, 有的突起连接成网,呈神经元样形态。诱导第5天,nestin阳性表达的细胞为40.24%+5.09%;第10天,NSE阳性、GFAP阳性的细胞分别为36.43%+5.27%和49.73%+6.28%。 结论 GFP-GM-BMSCs在体外含EGF、bFGF的无血清培养基中,能分化成神经元样细胞。     

氯胺酮在大鼠脊髓背角胶状质内对突触前神经递质释放的影响

为探讨临床有效浓度的氯胺酮(ketamine,KTM)在脊髓背角胶状质(substansia gelatinosa,SG)内对突触前神经递质释放的影响及其作用机制,本研究应用红外可视神经组织薄片全细胞膜片钳记录方法,在电压钳模式下,观察了KTM对自发性抑制性和兴奋性突触后电流(spontaneous inhibitory and excitatory postsynaptic currents,sIPSCs and sEPSCs)的频率和幅值的影响。结果显示:(1)钳制电压在0mV时,在人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中加入10-5mol/LAP-V和10-6mol/LCNQX,可记录到sIPSCs。将此时记录到的频率和幅值都作为前对照组的基础值(100%)。给予10-4mol/LKTM后,与前对照组相比,sIPSCs频率为127.93%±25.17%(P<0.05),幅值为104.78%±11.35%(P>0.05,n=7);(2)钳制电压为-70mV时,在ACSF中加入3×10-7mol/L士的宁和10-6mol/L荷包牡丹碱后,可观察到sEPSCs。加入10-4mol/LKTM后,与前对照组相比,sEPSCs的频率和幅值分别为97.89%±4.06%和101.63%±7.66%(P>0.05,n=8)。以上结果提示:(1)KTM增加了sIPSCs的频率,而对幅值没有明显影响,即KTM引起突触前抑制性神经递质的释放增加,而对突触后神经元的作用不明显;(2)KTM对sEPSCs的频率和幅值均未见明显影响,说明KTM在SG内对兴奋性神经递质的释放无显著影响。由此我们推测KTM在脊髓SG内主要通过增强抑制性信息传递发挥作用,KTM增强SG内突触前抑制性神经递质释放可能与其在脊髓背角发挥麻醉和镇痛作用有关。     

绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建及其表达

目的：实现绿色荧光蛋白（GFP）报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法：构建重组逆转录病毒表达载体RV－GFP，通过PT67包装细胞克隆，经G418筛选、扩增，获得大量含GFP基因的病毒液，并直接感染靶细胞。结果：转染细胞于48h后，在荧光显微镜蓝光激发波长下，可发出明亮的绿色荧光，转染率达20％－50％。感染靶细胞内GFP的有效表达可持续2个月。结论：构建的重组逆转录病毒GFP载体，可作为组织工程化细胞标记，用于细胞动态研究，其方法简便、灵敏、可靠。     

应用RNAi抑制细胞中绿色荧光蛋白的表达

目的 在293T和Mel细胞中研究RNA干扰（RNA interference，RNAi）对绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）表达的沉默作用。方法 以巢式PCR方法从人胚肾293T细胞中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子，并用于驱动RNAi片段的合成；构建能抑制eGFP特异性表达的RNAi载体（TRl）。将eGFP载体和RNAi干扰载体共转染293T和Mel两类细胞中，应用荧光显微镜观察、逆转录-PCR、荧光辅助细胞分选技术和定量逆转录-PCR方法分析上述细胞中RNAi对eGFP表达的抑制情况。结果 RNAi载体能有效地使293T和Mel细胞中红系特异的eGFP表达量均降低约50％以上。结论 本文构建的RNAi载体能有效的抑制目的基因eGFP在细胞中的表达。     

pcDNA3.1(+)—增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达

目的:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)并观察其在大鼠体内的转染部位及表达时间.方法:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔,观察其在大鼠体内转染后的时空效应.结果:双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1(+)约5.4kb, EGFP约750bp,另外测序分析与文献报道结果完全一致;动物实验结果表明,鞘内注射24h后在大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达,在14d达到高峰,4周后明显下降,第7周消失;在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光.对照组所有取材部位均没有绿色荧光.结论: 重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔,且外源基因得到了表达.     

绿色荧光蛋白-去整合素融合蛋白的表达及其结合功能的研究

目的：构建绿色荧光蛋白（CFP）-去整合素（disintegrin）融合基因，表达并分析该重组蛋白的生物学活性。方法：利用HF-PCR扩增Ⅱ型蛇毒出血性金属蛋白酶agacutin基因的去整合素区，并与绿色荧光蛋白基因进行拼接；将GFP-去整合素融合基因克隆入表达载体pQE-30，IPTG诱导重组蛋白表达；流式细胞术（FCM）与荧光显微镜分析重组蛋白与细胞的结合能力。结果：GFP-去整合素融合蛋白的表达载体在大肠杆菌M15中得到有效表达，菌体呈绿色。表达的蛋白量占菌体总蛋白的38％左右，免疫印迹证实分子量约为39kD；FCM分析显示该重组蛋白可与表达整合素的乳腺癌细胞MDA-MB-231和内皮细胞EA．hy926特异结合，在荧光显微镜下可见与重组蛋白结合的细胞发出绿色荧光。结论：GFP-去整合素融合蛋白可与表达整合素的细胞结合，并保留了各自的生物学活性，可用作肿瘤与血管生成等研究的新的分子标记物。     

shRNA表达质粒抑制耐阿霉素的人乳腺癌细胞株(MCF-7/AdrR)绿色荧光蛋白表达的研究

目的：探讨靶向增强型绿色荧光蛋白（EGFP）小发夹结构RNA（Short hairpin RNA，shRNA）对耐阿霉素的人乳腺癌细胞（MCF-7／AdrR）中EGFP基因表达的抑制作用。方法：构建针对EGFP基因的shRNA表达载体，与pcDNA3．0 EGFP质粒共转染MCF-7／AdrR细胞，分别用激光共聚焦扫描显微镜（Laser confocal scanning microscope，LCSM）和流式细胞术检测干扰效果。结果：瞬时共转染pSilencer^TM3．1-H1 neo EGFP shBNA质粒和pcDNA3．0 EGFP质粒后，荧光显微镜观察结果显示MCF-7／AdrR细胞中发出荧光的细胞数量减少，荧光强度明显降低。流式细胞术检测阳性细胞百分率降低至35．6％，差异有显著性。结论：靶向EGFP的shRNA表达质粒能有效而特异抑制EGFP在MCF-7／AdrR中的表达，MCF-7／AdrR细胞中存在RNA干扰现象，为进一步利用RNA干扰技术逆转乳腺癌多药耐药性的研究奠定基础。     

含绿色荧光蛋白和小鼠T-bet基因双顺反子真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的 构建一种带有绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠T-bet基因双顺反子的新型真核表达载体pCI-mT-bet-IRES-GFP.方法 利用脑炎心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES),将GFP的cDNA与小鼠T-bet基因(mT-bet)连接到真核表达载体pCI中,构建含GFP和mT-bet基因双顺反子的重组质粒.结果 成功构建了含GFP和mT-bet基因双顺反子的真核表达载体.荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的转基因细胞.结论 含绿色荧光蛋白和mT-bet基因双顺反子真核表达载体的构建为哮喘基因治疗研究提供了新的生物表达体系.     

表达绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建

目的 建立可表达绿色荧光蛋白的耻垢分枝杆菌,便于对耻垢分枝杆菌进行直观检测和快速定量.方法 利用PCR技术从真核表达质粒pLVTH扩增获得绿色荧光蛋白的编码基因,克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,建立重组质粒pMVGFP,并经酶切鉴定证实.利用电穿孔技术将pMVGFP转化入耻垢分枝杆菌,利用卡那霉素抗性筛...     

表达绿色荧光蛋白的乳酸杆菌在鸡胃肠道中的分布

目的 构建含有绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein gene,gfp)的质粒,电转化从鸡胃肠中分离的乳酸杆菌,并口服接种小鸡表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组乳酸杆菌,观察该乳酸杆菌在胃肠道中的分布.方法 在获得稳定表达绿色荧光蛋白的德氏乳杆菌乳亚种D17(D17-GFP)菌株后,口服接种20日龄的鸡,于接种后1.5、6、12、24、48和72 h分别取胃肠内容物接种培养并计数,同时取胃、空肠、回肠、盲肠、肝和脾脏做冰冻切片在荧光显微镜下观察D17-GFP的分布.结果 D17-GFP在接种鸡6 h后,胃肠道的内容物中可发现D17-GFP,在42 h时细菌数达到最大,并且3 d后菌量仍维持在1×104 CFU/g左右.在荧光显微镜下发现D17-GFP主要存在于肠道的内容物和黏液中.结论 GFP在德氏乳杆菌乳亚种D17中得到了稳定的表达,重组D17-GFP可在鸡胃肠道的黏膜处定植.     

含绿色荧光蛋白和小鼠T—bet基因双顺反子真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建一种带有绿色荧光蛋白（GFP）和小鼠T—bet基因双顺反子的新型真核表达载体pCI—mT—bet—IRES—GFP。方法利用脑炎心肌炎病毒（EMCV）的内部核糖体进入位点（IRES），将GFP的cDNA与小鼠T—bet基因（mT—bet）连接到真核表达载体pCI中，构建含GFP和mT—bet基因双顺反子的重组质粒。结果成功构建了含GFP和mT—bet基因双顺反子的真核表达载体。荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的转基因细胞。结论含绿色荧光蛋白和mT—bet基因双顺反子真核表达载体的构建为哮喘基因治疗研究提供了新的生物表达体系。     

绿色荧光蛋白在环磷酰胺处理小鼠胸腺中表达的研究

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)在环磷酰胺(CY)处理小鼠胸腺中的表达。方法:将质粒pEGFP-c3和梭华SofastTM基因转染试剂按一定比例配制成转染液,经腹腔注入3组小鼠(每组15只)进行转染。转染24h后分别注射0.5、1、2mg/只的CY,并设对照组(15只)。18h后称小鼠体质量,然后处死动物,无菌取胸腺并称重,用PBS洗出细胞,制成单细胞悬液,于荧光显微镜下观察GFP的表达情况。结果:GFP可在小鼠胸腺中表达,且GFP 细胞数与CY的剂量相关。高剂量的CY处理可导致胸腺明显萎缩、胸腺细胞总数及GFP 细胞数的减少。结论:转染质粒pEGFP-c3并经CY处理的小鼠及正常对照组小鼠的胸腺中均可表达GFP,但CY处理的小鼠胸腺中GFP的表达情况明显低于对照组小鼠。     

乙醇和丙酮对绿色荧光蛋白强度作用的对比

Thegreenfluorescentprotein(GFP)hasbeen widelyacceptedasahighlyusefultoolinfluorescence studiesoflivingcells.Itwasfirstfoundincellcyto plasmofjellyfish[1,2]andisanextremelystableprotein of238aminoacids.Itwasreportedthatthefluorescent propertiesoftheproteinwereunaffectedbyprolonged treatmentwith6MguanidineHCL,8Mureaor1% SDS,andtwodaystreatmentwithvariousproteases suchastrypsin,chymotrypsin,papain,subtilisin, thermolysinandpancreatinatconcentrationsupto1 mg/mlfailtoaltertheintensityofGFPflu…