低氧性肺动脉高压大鼠肺组织硫化氢的变化

本文旨在探讨低氧对大鼠内源性硫化氢体系的变化。采用生化反应方法测定血浆中硫化氢的含量和肺组织中硫化氢合酶的活性 ,采用定量竞争性RT PCR的方法检测肺组织中胱硫醚 γ 裂解酶 (CSE)mRNA的含量。结果显示 ,与对照组相比 ,低氧组大鼠的血浆硫化氢含量明显减少 [(1 92 2± 2 2 1 ) μmol Lvs (30 1 6± 32 4 ) μmol L ,P <0 0 1 ) ],肺组织中硫化氢合酶的活性明显下降 [(0 1 2 7± 0 0 2 3)vs (0 2 78± 0 0 99)nmol mgwettissue·min ,P <0 0 1 ],CSEmR NA的含量明显减少 [(1 0 2± 0 1 5 )× 1 0 - 6 fmolvs (2 1 7± 0 2 2 )× 1 0 - 6 fmol,P <0 0 1 ]。以上研究表明 ,低氧对大鼠的内源性硫化氢体系有抑制作用     

大鼠不同发育阶段β-防御素-2基因在肺组织的表达研究

目的：探讨大鼠β-防御素-2基因在肺组织表达的发育调控。方法：根据Genbank大鼠β-防御素-2的cDNA序列,设计一对特异引物。采用RT-PCR技术在大鼠不同发育阶段的肺组织总RNA中,扩增其特异cDNA片段,并进行DNA序列测定。借助Genbank中BLASI、程序,将从该cDNA序列推导的氨基酸序列与人的hBD-2和大鼠的rBD-1做相似性分析。     

氯喹对实验性呼吸窘近综合征大鼠肺中β-受体及cAMP变化的影响

为进一步探讨氯喹对油酸所致的实验性大鼠呼吸窘迫综合征(RDS)的治疗作用机理,我们实验观察了用药前后大鼠肺中β-即受体的变化以及由此引起的cAMP含量的变化. 研究中用放射性配基结合分析法测定β-受体的最大结合容量(Bmax)和解离常数(Kd),以竞争性结合蛋白分析法测定cAMP含量。实验结果显示:正常大鼠组、RDS模型组和氯喹治疗组大鼠肺中的Bmax值分别为490±61、307±55、494±48fmol/mg蛋白;各组Kd值无明显改变;其相应各组大鼠肺中cAMP     

人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立

建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法。选取人线粒体DNA高度保守基因片段,将该基因片段与pCF-T载体连接后,转化入E.coli DH5α,提取重组质粒PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果表明:构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101~108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系),相关系数为0.997。批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.23%~3.29%以及3.10%~5.21%。我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DNA的方法,该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法,在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景。     

竞争性PCR内参照菌的构建及应用

目的　建立一种构建竞争性PCR内参照菌的方法 ,并初步应用于铜绿假单胞菌 (Pseu domonasaeruginosa ,简称PA)的竞争性PCR定量检测。方法　通过整合载体pSX1 2和pUC19 attP tetr 将竞争模板插入大肠杆菌JM83染色体中 ,构建内参照菌JM83/16SN。以JM83/16SN作为内参照 ,建立PA竞争性PCR定量和半定量检测方法。结果　细菌质粒限制性酶切分析、药敏试验及染色体DNA指纹图谱分析证实竞争模板已插入到JM83/16SN染色体中。在竞争性PCR定量法中 ,得出定量回归方程y = 1 99x 14 0 5 (r= 0 97)。将 10倍系列稀释的PA标本作竞争性PCR半定量检测及定量培养 ,其结果存在良好的一致性。结论　通过整合载体可以将竞争模板插入大肠杆菌染色体中来构建内参照菌株。竞争性PCR半定量法可以简便、准确地测定标本中PA浓度范围     

人TNF-αmRNA实时荧光定量PCR检测标准的构建

目的：克隆人TNF-α cDNA，作为人TNF-α mRNA定量检测的标准品。方法：用RT-PCR法从人外周血单个核细胞的总mRNA中逆转录扩增TNF-α的cDNA，将纯化的TNF-α cDNA与pUCm-T载体进行连接，转化宿主菌DH-5α，然后提取重组质粒DNA，用限制性核酸内切酶Hind Ⅲ,EcoR Ⅰ进行双酶切鉴定并测序分析，最后对质粒标准进行实时荧光定量PCR检测。用聚乙二醇沉淀法纯化质粒并检测λ200nm吸光度，确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。结果：酶切鉴定、PCR扩增及测序分析均证实TNF-αcDNA重组到pUCm—T载体上。结论：成功克隆了TNF-α实时荧光PCR定量标准。     

β-防御素-1基因在大鼠皮肤和肾脏固有表达

目的：检测大鼠β-防御素一1基因表达的组织分布。方法：从Genbank检索到的Norway大鼠β-防御素-1 cDNA序列,据此设计一对特异引物,采用RT-PCR技术在Wistar大鼠10种受检测组织的总RNA中,扩增其特异cDNA片段,然后进行克隆扩增、限制性内切酶谱分析和DNA序列测定。结果：在10种大鼠组织中,     

脂血标本的核酸定量检测效果评价

目的评价脂血标本的核酸定量检测实时扩增曲线，以探讨此类标本进行HBVDNA定量检测的可接受性。方法建立扩增曲线观察法、扩增效率Grubbs离散值分析法及扩增效率置信区间估计法，评价接收脂血标本进行荧光定量PCR法HBVDNA定量检测的有效性。结果该2批次扩增的各样品扩增效率数值未发现离散值，3例脂血标本的扩增效率在同批样品扩增效率的90％置信区间内，与扩增曲线观察法结果一致。结论3种评价方法均对修正标准操作程序以接收该类标本提供了支持性的依据。     

mtLSU-巢式PCR检测实验大鼠卡氏肺孢子虫的实验研究

目的对mtLSU-巢式PCR方法检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值以及基因序列进行评价。方法采用地塞米松免疫抑制法诱导大鼠感染肺孢子虫;实验组10只,对照组1只;诱导至第7周时收集实验组及对照组大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）标本,采用mtLSU-巢式PCR方法对人源与鼠源肺孢子虫共有的基因进行扩增和序列测定,同时采用镜检法对实验组大鼠肺组织和肺泡灌洗液标本进行检测,评估两种方法的敏感性。结果采用mtLSU-巢式PCR方法对实验感染大鼠肺组织和BAL进行检测,卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为100%（10/10）、90%（9/10）。而GMS染色镜检法检测的阳性率分别为80%（8/10）、60%（6/10）。所测Wistar大鼠卡氏肺孢子虫mtLSU基因序列长度为155bp,与GenBank的大鼠源肺孢子虫（U20170）及人源肺孢子虫（DQ473446）同源性均为100%（154/154、155/155）。结论 mtLSU-巢式PCR方法应用于大鼠卡氏肺孢子虫检测敏感性高,特异性强;获得与人源耶氏肺孢子虫相同的Wistar大鼠卡氏肺孢子虫mtLSU的基因序列。     

HBV cccDNA荧光定量检测方法的建立及应用

目的建立一种HBVccc DNA定量检测方法,并定量检测慢性乙型肝炎患者肝组织内的cccDNA。方法分析A-G亚型HBV DNA序列,根据其结构特点,于DNA缺口两侧高度保守区域设计引物和探针,并摸索该方法最佳反应条件,以期实现不同亚型HBV cccDNA的特异性扩增。对该方法进行特异性、敏感性及重复性检测。将扩增产物进行测序以检测方法的特异性。用102~1010拷贝/ml的标准质粒检测方法的敏感度。106拷贝/ml标准质粒30复管,以检测其重复性。取32例慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后的肝穿组织,提取DNA,用该方法进行cccDNA定量,观察抗病毒治疗前后cccDNA的变化及与总HBV DNA的关系。结果测序结果显示扩增产物为目的片段;该定量方法的敏感度为103~1010拷贝/ml;标准质粒30复管后其Ct值为29.69±0.31,变异系数为1.04%。肝内cccDNA占肝内总HBV DNA的47%~98%,平均81.5%。结论本方法操作简便,特异性高,定量线形范围宽及重复性好,可用于科研中cccDNA的定量检测。