PCR-RFLP在细粒棘球绦虫种株鉴定中的应用

目的根据细粒棘球绦虫线粒体DNA rrnL区段基因特征,建立一种新的细粒棘球绦虫种株（基因型）鉴定技术。方法应用PCR-RFLP方法,对新疆不同地区44个囊型包虫病（CE）病人分离株标本提取DNA,用特异性引物对mtDNA rrnL基因片段进行PCR扩增,将扩增产物用限制性内切酶SspI和Bg1Ⅱ消化,再用琼脂糖凝胶电泳分析片段大小,进行基因型鉴别。结果CE病人分离株PCR扩增产物均不能被限制性内切酶SspI酶切,为细粒棘球绦虫;其中43个病人分离株的PCR扩增产物不能被限制性内切酶Bg1Ⅱ酶切,为细粒棘球绦虫G1基因型;1个病人分离株的PCR扩增产物被Bg1Ⅱ切成158 bp和403 bp 2条DNA片段,为细粒棘球绦虫G6基因型。结论根据细粒棘球绦虫线粒体DNA rrnL区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于细粒棘球绦虫的基因型鉴别。     

PCR-RFLP和微卫星DNA标记法在棘球绦虫感染诊断中的应用

目的 探讨PCR-RFLP和微卫星DNA标记法诊断棘球绦虫感染的临床价值.方法 对40例包虫病患者的40个包囊标本提取DNA后,分别采用PCR-RFLP和微卫星DNA标记法进行检测.结果 以棘球绦虫DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,可得到大小约为561 bp的扩增条带,产物的长度与引物设计的预期产物长度一致.以棘球绦虫DNA为模板,用Sea引物进行PCR扩增,可得到约90 bp的扩增条带,产物的长度与引物设计的预期产物长度一致.40个标本均鉴定为细粒棘球绦虫,39个为细粒棘球绦虫G1基因型,1个为细粒棘球绦虫G6基因型.结论 PCR-RFLP和微卫星DNA标记法是简单、快速、有效的棘球绦虫基因型检测诊断方法.     

西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株nad1基因多态性分析

目的了解西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株的优势基因型及遗传变异情况,为细粒棘球绦虫的溯源及阿里地区棘球蚴病预防控制策略的制定提供支持。方法收集阿里地区某医院2017年棘球蚴病患者病灶切除样品,提取DNA,PCR扩增线粒体NADH脱氢酶1(nad1)基因,扩增产物测序后用BLAST、ClustalX 1.83和MEGA 7.0软件进行同源性和系统进化分析。下载全国细粒棘球蚴人体分离株的nad1基因,利用DnaSP6分析单倍型;利用NetWork软件制作中国细粒棘球绦虫nad1基因的单倍型网络图。结果共收集80例细粒棘球蚴病患者病灶切除样品,其中38份样品PCR扩增出约550 bp的特异性条带。测序分析结果显示,4份样品为细粒棘球绦虫G6基因型,与蒙古人来源的序列(MH300971.1)一致性为99.8%;其余34份样品均为细粒棘球绦虫G1基因型,与标准序列(AF297617.1)相比,其535位的C碱基突变为G碱基,与阿尔及利亚人来源序列(MG672293.1)的一致性为100%。MEGA 7.0软件分析38份样品的序列,结果显示,T、C、A和G碱基占比依次为44.3%~46.5%、7.7%~9.1%、19.8%~21.5%和25.7%~26.0%。我国已报道的细粒棘球绦虫nad1基因共有9个单倍型,单倍型多样性为0.47,核酸多样性为0.19。单倍型网络图显示,H4为我国细粒棘球绦虫nad1基因主要的单倍型。结论细粒棘球绦虫G1、G6基因型是西藏阿里地区的主要基因型,资料分析表明H4为我国流行的细粒棘球绦虫nad1基因的主要单倍型。     

青南高原细粒棘球绦虫mtDNA基因多态性分析

目的与方法为了全面掌握青南高原细粒棘球绦虫的种内变异,我们首次应用mtDNA的coxI基因,nadI基因和atp6基因检测了55个细粒棘球绦虫分离株（37个人体分离株,18个动物分离株）的基因多态性。结果研究结果显示,所检测的55个细粒棘球绦虫分离株与GenBank中检索到的普通羊株（G1型）基因同源性达到90%以上,均为普通羊株（G1型）。将mtDNA相加（共1 327bp）后得到了13个基因型,均被GenBank收录。结论1）55个细粒棘球绦虫分离株均为普通羊株（G1型）;2）结果所得的13个基因型中,既有世界上广泛分布的,也有本研究首次报道的,充分说明青南地区细粒棘球绦虫具有广泛性和普遍性的流行病学特征,青南高原特殊地理环境和气候条件导致细粒棘球绦虫的特殊的核苷酸变异。     

青海天峻地区人和羊源细粒棘球蚴流行株基因分型及基因多态性研究

目的 解析青海天峻地区人和绵羊细粒棘球蚴流行株的基因型及基因多态性。方法 根据GenBank公布的细粒棘球绦虫线粒体基因组序列,分别针对cox1和nad1基因设计特异性引物,对16份绵羊源和2份人源细粒棘球蚴分离株样品进行PCR扩增、测序及cox1和nad1基因核苷酸序列多态性和单倍型分析。结果 18株细粒棘球蚴分离株均属于G1型。其中cox1基因单倍型共有9种,变异位点16个,单倍型序列之间碱基差异0~5个,变异率达0.31%;nad1基因单倍型共有7种,涉及变异位点共15个,单倍型序列之间碱基差异1~8个,变异率达0.89%。结论 青海天峻地区人和绵羊细粒棘球蚴流行株为G1型,其cox1基因多态性较nad1基因多态性丰富;cox1基因用于细粒棘球蚴分离株间核苷酸多态性分析的分辨率较高。     

辽宁省朝阳市细粒棘球病的基因型分析

目的分析本院分离到的人源性棘球蚴的基因型,为辽宁省棘球蚴病的分子流行病学提供资料。方法经外科手术方法从患者肝内获取棘球蚴囊,将囊内容物离心沉淀提取DNA,以细粒棘球绦虫线粒体细胞色素氧化酶(cox1)基因为靶基因设计引物进行PCR扩增,对PCR产物进行测序,测序结果应用Blast进行分析,并与GenBank数据库中序列进行比对。结果 cox1扩增产物及测序的结果提示,本例样本与细粒棘球幼的cox1基因型(AF297617)高度相似,差异性为0.1%,基因型属于G1亚型。并与其他国家的25个分离株序列一致。结论线粒体基因组的cox1基因分析是棘球蚴病诊断和分型的有力工具。辽宁地区首次报道了细粒棘球绦虫的基因型为G1亚型,其序列与国内外的多个分离株保持一致,为棘球蚴病的分子流行病学补充了资料。     

基于线粒体12S基因对青藏高原细粒棘球蚴种群遗传结构的研究

目的分析青藏高原细粒棘球蚴的种群遗传结构,为细粒棘球蚴病的防控提供基础资料。方法对采自青藏高原来自不同地区(青海、西藏、四川)不同宿主(人、绵羊、牛)的58株细粒棘球蚴进行了线粒体12S基因的全序列测序,结合已报道的青海地区42个细粒棘球蚴绵羊株的12S全序列进行种群遗传结构分析。结果本次研究56个分离株鉴定为Echino-coccus.granulosus sensu stricto(基因型G1–G3);分析98个青藏高原地区分离株12S序列,包含15个核苷酸变异位点,共检测出13个单倍型(ES1～ES13),单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.381、0.00092。3个地域种群中,四川种群的核苷酸多样性最高(0.001353),种群内遗传距离最大(0.00135)。分子变异分析(AMOVA)显示,种群内的遗传变异大于种群间的遗传变异。构建单倍型NJ树和贝叶斯树显示,ES10和ES11形成一个有别于其他单倍型的单倍型类群。单倍型网络显示,单倍型ES1是优势单倍型,其它单倍型围绕它成辐射状,未发现有地理聚类。基因流(Nm值)和遗传分化指数(FST值)显示各地域种群间未形成显著的遗传分化。结论青藏高原细粒棘球绦虫的基因型为G1-G3型;青藏高原细粒棘球绦虫种群内及种群间都存遗传多样性,其中四川种群的遗传变异性最大;青藏高原细粒棘球绦虫种群内变异是种群变异的主要来源;种群未形成地理聚类,遗传分化不明显。     

基于GenBank数据库的不同基因型细粒棘球绦虫系统进化分析

目的　分析GenBank数据库中公布的细粒棘球绦虫各基因型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（Cox1）基因序列,探索细粒棘球绦虫各基因型在全球不同地区的遗传变异及分化情况。方法　收集GenBank数据库中公布的不同基因型细粒棘球绦虫Cox1基因序列,排除同一地区内相同基因序列,寻找收集的基因序列间的变异位点并构建进化树,观察不同地区细粒棘球绦虫各基因型的地域聚集性及原始基因序列。结果　通过对Cox1基因序列变异位点统计,发现细粒棘球绦虫Cox1基因突变类型以颠换为主,G1、G6、G7基因型在其分布的各地区均有相同Cox1基因序列,基因序列相对应的GenBank登录号分别为KY766891、MH300971、MH301007。系统进化分析发现G10基因型存在明显地域聚集性。结论　细粒棘球绦虫G1、G6、G7基因型存在原始Cox1基因序列;G10基因型进化树中出现地域聚集性,存在生殖隔离趋势。     

新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段95抗原基因克隆及序列分析

目的研究细粒棘球绦虫95抗原(Eg95)基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达及其基因序列差异。方法根据Eg95基因序列设计引物,用PCR方法分别从新疆株细粒棘球绦虫3个不同发育阶段(原头蚴、六钩蚴和成虫)所构建的cDNA文库中克隆获得Eg95目的基因,将其克隆至pUCm-T载体、测序并进行序列分析。结果从3个不同发育阶段的新疆株细粒棘球绦虫cDNA文库中均克隆出Eg95基因,其基因片段长度为402bp,同源性比对分析(BLAST)结果表明,所克隆的新疆株Eg95基因与GenBank中的Eg95基因序列一致。结论Eg95基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段均有表达,其基因序列无差异。     

细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)CO1与ND1基因序列分析

目的 为了明确内蒙古锡林郭勒盟西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴之间的基因型及其遗传变异情况。方法 利用分子生物学技术对采自两地区细粒棘球蚴的线粒体CO1基因与ND1基因进行了克隆和测序,并运用DNAStar5.0中的MegAlign工具对已测出的序列进行了分析。结果 西乌旗羊株细粒棘球蚴与锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因片段和ND1基因片段大小分别均为936 bp和895 bp。西乌旗羊株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆羊株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为99.3%;锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆人株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为98.6%;且西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴ND1基因与国内外已报道的G1型ND1基因序列完全相同。结论 表明内蒙古上述两地区细粒棘球蚴的同源性很高,且基因型均为G1型,这为内蒙古某些地区细粒棘球蚴流行虫株的确定提供了重要依据,同时也对当地细粒棘球蚴病的预防和控制具有重要意义。     

Associations of the genotypes of the CYP1A1 gene with predisposition to hydatid disease caused by Echinococcus granulosus strain G1

DNA samples isolated from peripheral venous blood lymphocytes in 73 children with hydatid disease were studied. The polymorphism of exon 7 (A4889G) of the CYP1A1 gene was analyzed by polymerase chain reaction, followed by hydrolysis with restriction endonuclease HincII. The material for E. granulosus genotypes to be studied was obtained from the germinal layer of larvocysts. The fragment of the mitochondrial gene encoding for the first subunit of cytochome-C-oxidase was as a DNA marker. The amplified E. granulosus DNA fragments underwent direct sequencing and a genotype was identified. The findings have led to the conclusion that carriage of polymorphic allele Val of exon 7 (A4889G) of the CYP1A1 gene in those infested with E. granulosus genotype G1 (common, sheep strain) is a risk factor of the development of the clinical form of echinococcosis granulosus.     

新疆家犬体内存在细粒棘球绦虫G1(羊)株和G6(骆驼)株的分子证据

目的收集家犬体内的细粒棘球绦虫成虫以建立新疆棘球蚴病的分子流行病学资料. 方法对家犬体内成虫细胞色素c氧化酶Ⅰ基因序列进行测定以确定其亚株型. 结果所有感染犬体内成虫的基因型为G1型.特别是1条家犬体内发现存在细粒棘球绦虫G1(羊)株和G6(骆驼)株混合感染的情况. 结论在新疆阻断羊犬和羊骆驼循环圈是预防棘球蚴病的重要措施.作为终末宿主的家犬与人类的感染密切相关,对感染犬的管理应该加强.     

2019-2020年湖北部分地区G9P[8]型人轮状病毒基因特征北大核心CSCD

目的对人A组轮状病毒进行检测及分离鉴定,并研究其各基因片段的遗传进化关系。方法2019-2020年对湖北武汉市和襄阳市临床腹泻病人的粪便样品进行采集,共319份。设计特异性轮状病毒VP6基因引物,RT-PCR检测轮状病毒的感染情况。将阳性样品接种于MA104细胞进行轮状病毒的分离。RT-PCR特异性扩增VP6基因和特异性间接免疫荧光对其进行病毒鉴定及病毒增殖检测;并进一步通过RT-PCR扩增轮状病毒的11个基因片段,在线工具Rota C V2.0对测序结果进行分型分析。Mega软件对其全基因组序列进行遗传进化分析。结果轮状病毒感染阳性标本共69份,阳性率为21.63%。成功分离获得11株人轮状病毒,主要衣壳蛋白VP7和VP4基因型均为G9P[8]型。其中3株轮状病毒归属于类Wa株毒株,基因型图谱为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1。8株毒株在Wa-like的基因型中具有DS-1-like的NSP4为E2基因型特征。基因型图谱为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E2-H1。结论G9P[8]型人轮状病毒毒株在2019-2020年湖北部分地区占主导趋势,且其NSP4基因以E2基因型为主要流行形式。     

Morphological and molecular characterisation of Echinococcus granulosus from goat isolates in Iran

Hydatidosis is considered to be an important economic and human public health problem in Iran, where a variety of animals act as intermediate hosts. There is limited information about the genotypes of Echinococcus granulosus in goats. In this study, 20 isolates of E. granulosus obtained from goats were characterised by mitochondrial DNA sequencing and morphology of the metacestode. The mitochondrial cytochrome oxidase 1 sequences were evaluated, and the sequence analysis indicated two genotypes within the isolates. 17 samples were identified as G1 strain, and 3 isolates were identified as G6 strain. The results of the morphological studies support the findings of the molecular studies. Two types of rostellar hooks were observed in the goat isolates, in agreement with the strain identification. Type 1 hooks were morphologically similar to those of the common sheep strains, whereas the dimensions of the hooks in type 2 were similar to those normally found in the camel strain. The morphological results suggest that Echinococcus of goat origin is phenotypically similar to either the sheep (G1) or the camel (G6) strains. Further, these results suggest that the transmission of the G1 genotype between sheep and goats seems to be the predominant mode of transmission, but further work is required to verify this.     

Identification of the causative agent of echinococcosis in the population of the South Urals

The topicality of the problem associated with echinococcosis granulosus in the South Urals is determined by its wide spread and a considerable economic damage made to this region by this invasion. The study was undertaken to reveal the intraspecific affiliation of Echinococcus granulosus that induces hydatid disease in the population of the South Urals. Samples for studies were taken from the fertile larval cysts obtained during intraoperative intervention in patients with hydatid disease. As morphological criteria for differentiation, the authors examined the proboscis uncuses of protoscolexes. For E. granulosus genomic typing, polymerase chain reaction (PCR) of DNA synthesis was used, as described by Gasser (1998). As a DNA marker, the authors used a fragment of the mitochondrial gene encoding for the first subunit of cytochome-C-oxidase. The DNA fragments obtained by PCR from 9 isolated underwent the direct enzyme dideoxy-sequencing test (Senger, 1977). As a result, the causative agent of echinococcosis granulosis was first identified in the patient of the South Urals. In children and adults, the clinical form of the disease is caused by E. granulosus with the genotype G - common, that of domestic sheep. Comparative analysis of molecular data revealed the presence of genotype G1 variations circulating in the South Urals homologous to the sequences recorded in the GenBank under numbers U50464 and DQ109036.