人血管内皮生长因子受体Ｆlt—1胞外区２—３loop在Ｐichia.pastoris酵母中的

目的：研究人Ｆlt-1胸外区２－３loopcDNA在Ｐichia,pastoris醇母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组Ｆlt-1（２－３）,方法：采用ＰＣＲ扩增Ｆlt-1(2-3)基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐichia.pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/Flt-1(2-3),转化酵母宿主菌ＧＳ１１５,筛选Ｈis^ Mut^s表型转化子,摇瓶培养,１％甲醇诱导表达,表达产物经ＣＭ－ＳepharoseFF阳离子交换层析和Ｓephacry1S-10０分子筛层筛析纯化后,测定其生物学活性。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中,诱导４d的表达量达上清总蛋白的６0%以上。ＥＬＩＳＡ及Ｗesternblot实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性,经ＣＭ－ＳepharoseFF阳离子交换层析和ＳephacrylS-100 分子筛层析纯化后,Ｆlt-1(2－３）纯度达到９０％以上,生物学活性检测证实其具有结合hVEGF165的能力和抑hVEGF165对ＨＵＶＥＣ的促增残功能。结论：获得了具有生物学活性的可深性重组Ｆlt-1 受体胞外区２－３loop小片段,为进一步的动物和临床应用打下了基础。     

ＶＥＧＦ１６５cＤＮＡ在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的 研究人ＶＥＧＦ１６５基因在Ｐichia pastoris酵母中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的重组hVEGF165。方法 采用ＰＣＲ扩增hVEGF165基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１α分泌信号肽序列的Ｐichia pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/hVEGF165。经转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,用１０mL/L甲醇诱导表达。表达产物经Ｈeparin-SepharoseCL6B亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）测定其生物学活性。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,表达产物以可溶性分子的形式存在于上清中,诱导４d的表达量达上清中总蛋白的６０％以上。Ｗestern blot表明。表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Ｈep-arin-SepharoseCL6B亲和层析纯化,rhVEGF165的纯度可达到９０％以上,生物学活性检测证实。结论 在Pichia pastoris表达系统中,实现了hVEGF165的高效分泌性表达。     

人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人Flt-1胞外区2-3loopcDNA在Pichia.pastoris酵母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt-1(2-3)。方法采用PCR扩增Flt-1(2-3)基因,经DNA序列分析后,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia.pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/Flt-1(2-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His     

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性

目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.     

重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体在毕赤酵母中的表达及活性检测

目的:采用酵母多拷贝分泌表达载体pPIC9K表达重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体cRFB4FC和cRFB4CH3,并进行活性检测。方法:采用基因克隆技术获得两抗体的基因,然后将其克隆入表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母SMD1163中,将经G418抗性筛选出的重组酵母菌株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,经ELISA检测生物学活性。采用正交试验优化重组酵母菌株的表达条件以提高抗体的表达量。结果:获得重组表达质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,经甲醇诱导表达出cRFB4FC和cRFB4CH3蛋白。它们在SDS-PAGE上分别表现为相对分子质量(Mr)约326 000和295 000的蛋白区带,在Western blot分析中均可被山羊抗人IgG Fc单克隆抗体(mAb)识别,经ELISA分析它们都具有较高的生物学活性。优化表达条件后,抗体的表达量分别提高了196.4%和151.7%。结论:抗体cRFB4FC和cRFB4CH3在酵母菌SMD1163中成功获得高效分泌表达,并有免疫学活性。     

人补体受体1型SCR1-3功能域基因的克隆表达及生物活性鉴定

目的实现人补体受体1型功能域SCR1-3基因的克隆、表达及生物学活性鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,通过逆转录获得cDNA,PCR扩增获得编码CR1-SCR1-3基因序列;克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9K,构建重组质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,菌落PCR、双酶切鉴定后测序;线性化重组质粒电转化毕赤酵母KM71基因组中,经菌落PCR技术筛选在G418平板上生长的多拷贝阳性转化子;摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白表达;镍柱亲和层析纯化目的蛋白;用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性。结果获得了人CR1-SCR1-3编码区序列,测序结果与与GenBank中的相应序列一致;SDS-PAGE和Western-blot表明目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;体外实验证实经纯化后的CR1-SCR1-3能够明显抑制补体溶血。结论成功构建重组表达质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR1-3的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体生物活性。     

可溶性CD14在酵母细胞中的分泌表达与LPS结合活性分析

目的在酵母系统中实现可溶性CD14基因的分泌表达,并进行LPS结合活性分析。方法将可溶性CD14基因克隆入表达载体pPIC9K,用SacI将重组质粒线形化,电转化PichiapastorisGS115细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达。结果经过诱导表达条件的优化,sCD14在pH6.5培养基BMMY中实现了分泌表达。免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体。经流式细胞仪检测,重组产物具有结合细菌内毒素(LPS)的生物学活性。结论具有良好LPS结合活性的重组可溶性CD14分子可以用于进一步的结构与功能研究。     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

融合基因EGFRi-IL-24真核表达载体的构建与表达

人工合成表皮生长因子受体干扰序列(epithelial growth factor receptor interference,EGFRi),应用重叠延伸PCR(Overlapping PCR)技术将其与白细胞介素-24(IL-24)连接,并在其间引入一段柔软短肽(Gly4Ser3)。进行序列分析后,将融合基因EGFRi-IL-24重组到表达质粒pPIC9k中,Sal I酶切线性化重组质粒EGFRi-IL-24/pPIC9k,电击转化毕赤酵母GS115,经G418抗性和PCR筛选得到阳性重组菌株。重组菌株用甲醇进行诱导表达后,通过SDS-PAGE和MTT法分析鉴定蛋白表达产物。结果证实EGFRi-IL-24在毕赤酵母中获得了分泌性表达的活性蛋白,为进一步研究其生物学功能及临床应用奠定了基础。     

重组人sCR1在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定

目的:酵母细胞SMD1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化。方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化。结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48～72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

VEGF_(165)cDNA在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人 ＶＥＧＦ１６５基因在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的重组ｈＶＥＧＦ１６５。方法采用ＰＣＲ扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达载体中,构建重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５。经转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,用 １０ ｍＬ／Ｌ甲醇诱导表达。表达产物经Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）测定其生物学活性。结果ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,表达产物以可溶性分子的形式存在于上清中,诱导４ｄ的表达量达上清中总蛋白的６０％以上。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Ｈｅｐ－ａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化, ｒｈＶＥＧＦ１６５的纯度可达到９０％以上。生物学活性检测证实,其具有刺激脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）增殖的活性。结论在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中,实现了ｈＶＥＧＦ１６５的高效分泌性表达。     

人血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和鉴定

目的 研究人血管内皮生长因子（ｈＶＥＧＦ１６５）基因在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组ＶＥＧＦ１６５。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５,转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,１％甲醇诱导表达。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,诱导４ｄ的培养上清中ｈＶＥＧＦ１６５表达量达上清总蛋白的３０％以上。ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有刺激ＨＵＶＥＣ增殖的功能。结论 在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中实现了ｈＶＥ     

人源性抗角蛋白单链抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达

目的：用巴氏毕赤酵母表达人源性抗角蛋白单链抗体。方法：从已构建好的质粒p3MH／ScFv中亚克隆目的片段ScFv并插入酵母表达载体p^PIC9K，构建成重组质粒p^PIC9K／ScFv，并测序鉴定。通过电转将重组质粒p^PIC9K／ScFv整合到巴氏毕赤酵母菌GS115的染色体上。经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后，用含0．5％甲醇的培养基诱导其分泌表达。结果：通过6天的诱导，该系统成功表达了抗角蛋白单链抗体，Western blot实验证实表达产物具有特异性。结论：获得了真核表达的抗角蛋白单链抗体，为其应用研究打下了基础。     

人源性抗角蛋白抗体Fab段在巴氏毕赤酵母菌中的表达及表达条件的优化

目的:用巴氏毕赤酵母表达抗角蛋白抗体Fab段并优化表达条件。方法:将抗角蛋白人Fab原核表达载体p3MH/Fab中的κ链和Fd段基因,分别亚克隆到酵母菌表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建成重组质粒pPIC9K/L和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/L和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选得到高拷贝的转化子。对Mut表型鉴定后,优化pH及甲醇浓度等表达条件。结果:优化表达条件后,成功地表达抗角蛋白Fab段抗体。Westernblot分析证实,表达产物具有良好的角蛋白结合活性和特异性。结论:人源性抗角蛋白Fab段抗体在巴氏毕赤酵母菌中获得成功表达,为其进一步的应用研究打下了基础。     

人sTNFR II-IgG Fc融合蛋白在毕赤酵母菌中的表达及其产物分析

目的:在毕赤酵母菌中表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白。检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析。方法:从人淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的基因sTNFRII与IgG Fc,然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRII-IgG Fc,并将其插入pPIC9载体中。以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行克隆与表达。采用ELISA筛选高表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组毕赤酵母菌株,对融合蛋白通过还原和非还原SDS-PAGE分析其二聚体结构,采用L929细胞检测融合蛋白抗TNF-α的生物学活性,最后利用荧光辅助糖电泳(FACE)分析融合蛋白的N-糖链。结果:成功地建立了可分泌表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组酵母菌株,摇瓶培养后融合蛋白的表达量为2mg/L。SDS-PAGE和Western blot表明,该融合蛋白能自然形成二聚体结构;可抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用,其中和5×104U/LTNF-α的EC50为170μg/L。FACE分析融合蛋白N-糖链的大小为11~13个糖残基。结论:在毕赤酵母菌中成功地表达了sTNFR II-IgG Fc融合蛋白,为在毕赤酵母菌中表达其他的Fc融合蛋白和抗体提供了参考。     

抗人肝癌单克隆抗体嵌合Fab在巴氏毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:通过分步整合,用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌单克隆抗体(mAb)HAb18的嵌合Fab(cFab)片段。方法:将抗人肝癌mAbcFab/HAb18基因的原核表达载体pET32a/cFab中的CL和Fd段基因,分别亚克隆到酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选高拷贝的转化子及鉴定Mut表型后,用含5mL/L甲醇的培养基诱导表达。结果:成功地表达抗人肝癌mAbHAb18的cFab,表达水平为26mg/L。Westernblot鉴定证实,表达产物具有良好的与HAb18结合的活性和特异性。结论:cFab/HAb18在巴氏毕赤酵母获得表达,为对其进一步大规模的生产和临床应用奠定了基础。