CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶原核表达条件的研究

目的 探讨重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3分别在大肠埃希菌ER2566和BL21(DE3)中进行原核表达的最佳条件.方法 分别在不同的宿主菌、诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度中诱导pET-28a(+)/CTX-M-3融合表达载体,目的 产物经SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件分析,以获得最佳表达条件.结果 表达载体的最佳诱导条件是重组质粒在BL21(DE3)中18℃诱导24 h,IPTG终浓度为0.8 mmol/L:表达载体在最佳条件下表达时,目的 蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的33%.结论 获得pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌中表达CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)蛋白的最佳条件,为此酶的大量纯化奠定了基础.     

乳糖诱导鸡β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达

目的研究用乳糖作为诱导剂对鸡β-防御素3(Gal-3)基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。方法分别比较乳糖诱导浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度对重组表达产物的影响,并以IPTG诱导作为对照,确定较为优化的乳糖诱导条件。结果对于重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到良好效果,诱导产物的表达量与IPTG诱导产物相当。最优表达条件为终浓度2 g/L乳糖37℃下诱导3 h,可以达到良好的诱导效果。结论乳糖可以诱导Gal-3基因表达,并取得良好效果,为工业化生产提供了良好的实验参考和借鉴。     

环孢素对血管平滑肌细胞蛋白14-3-3γ表达的影响

目的探讨环孢素(CsA)对血管平滑肌细胞(VSMC)蛋白14-3-3γ表达的影响.方法Western b1ot法测定CsA作用后的VSMC蛋白14-3-3γ含量的变化.结果10-5 mol·L-1浓度的CsA作用8h时VSMC蛋白14-3-3γ表达显著增加(t=4.72,P＜0.01).结论CsA可促进VSMC蛋白14-3-3γ的表达.     

转染杜氏盐藻14-3-3基因对食管鳞癌EC9706细胞Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响

目的:探讨转染杜氏盐藻14-3-3基因对食管鳞癌EC9709细胞Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响.方法:将杜氏盐藻14-3-3基因cDNA序列分别亚克隆入表达载体pEGFP-C1和pcDNA3.1(+)的Hind Ⅲ和Bam H Ⅰ位点,构建真核表达载体pEGFP-C1-14-3-3和pcDNA3.1(+)-14-3-3,采用脂质体方法转染EC9706细胞,同时设立空载体对照和空白对照,荧光显微镜观察pEGFP-14-3-3融合蛋白在EC9709细胞中的定位;G-418筛选稳定转染pcD-NA3.1(+)-14-3-3的细胞株,采用RT-PCR和Western blotting法检测14-3-3基因的表达;Western blotting检测3种细胞中Bcl-2和Caspase-9蛋白的表达.结果:pEGFP-14-3-3融合蛋白定位于EC9706细胞的细胞核;通过G-418筛选,最终获得稳定表达盐藻14-3-3基因的转染细胞株;与转染空载体和空白对照的EC9706细胞相比,转染pcDNA3.1(+)-14-3-3的EC9706细胞中Bcl-2蛋白表达量明显增高[(1.60±0.20)、(0.90±0.15)和(2.40±0.10);F=69.889 7,P＜0.001],而Caspase-9蛋白表达量明显降低[(1.00±0.04)、(1.40±0.08)和(0.40±0.05);F=217.066 7,P＜0.001].结论:杜氏盐藻14-3-3基因可能在EC9706细胞凋亡过程中发挥了抑制作用.     

正交试验设计优化重组蛋白溶细胞毒素的表达

目的:对创伤弧菌溶细胞毒素融合蛋白表达条件进行优化,从而获得高效稳定的溶细胞毒素(Vibrio vulnificus Hemolysin,VVH)原核表达系统。方法:质粒pGEX-4T-1-vvh转化E.coli BL21/DE3后,针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素:诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计,对结果进行直观分析及方差分析。并对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果:直观分析表明诱导时间的R值最大,其次为摇菌转速和诱导剂IPTG浓度,诱导温度的R值最小;方差分析表明诱导时间的P<0.05,而转速、温度及IPTG浓度的P均>0.05。结论:诱导时间为主要因素(其为4h,表达水平最高),其次为摇菌转速、诱导剂IPTG浓度和诱导温度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数为250r/min、诱导时间4h、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在此诱导条件下,溶细胞毒素的表达量达到了55.31%。     

重组人白血病抑制因子的原核表达及优化

目的在大肠杆菌中表达重组人白血病抑制因子(HLIF)蛋白,并探索其高效表达的条件。方法将HLIF重组质粒转化至大肠杆菌BL21,分别给予不同诱导时间(4、8、12、16、20、24 h)、不同浓度大肠杆菌(吸光度值分别为0. 5、0. 6、0. 8、1. 0)、不同诱导温度(20、25、30、37、42℃)、不同浓度诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5 mmol·L-1)、不同浓度乙酸(0. 0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4 mmol·L-1)进行培养,蛋白电泳考马斯亮蓝染色后,采用Image J软件分析HLIF蛋白的相对表达量,观察不同干预条件对HLIF表达的影响。结果不同诱导时间下HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=22. 088,P <0. 05),诱导16 h时的HLIF蛋白相对表达量显著高于诱导4、8、12、20、24 h(P <0. 05)。不同浓度(以吸光度值表示)大肠杆菌诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=17. 153,P <0. 05);吸光度值为0. 8时HLIF蛋白相对表达量显著高于吸光度值为0. 5、0. 6时(P <0. 05),吸光度值为1. 0时与吸光度值为0. 8时HLIF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。不同温度诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=18. 053,P <0. 05),25℃时HLIF蛋白相对表达量显著高于20、30、37、42℃时(P <0. 05)。不同浓度诱导剂诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(F=1. 181,P> 0. 05)。不同浓度乙酸诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=27. 181,P <0. 05),乙酸浓度为0. 00 mmol·L-1时HLIF蛋白相对表达量显著高于乙酸浓度为0. 1、0. 2、0. 3、0. 4 mmol·L-1时(P <0. 05)。结论成功在大肠杆菌表达了HLIF,并探索出了适合最佳表达的诱导时间、大肠杆菌浓度、诱导温度、诱导剂浓度、乙酸浓度等条件。     

融合蛋白AnxB1ScuPA表达质粒的构建及诱导条件优化

目的:在大肠杆菌中高效表达融合基因AnxB1ScuPA.方法:利用PCR技术扩增AnxB1ScuPA的融合基因,克隆至原核表达载体pET-28a;转化几种不同的宿主菌(感受态细菌BL21、Rosetta、BL21-RIL),利用IPTG(终浓度为0.5 mmol/L)诱导蛋白表达,并对表达条件进行优化,根据凝胶扫描定量结果确定合适的宿主菌和诱导表达条件.结果:AnxB1ScuPA在具有稀有密码子tRNA的宿主菌BL21-RIL表达量较其他宿主菌为高.在菌液生长至D600＝0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.4 mmol/L,诱导0.5 h后加入利福平至终浓度150 μg/ml,可使蛋白AnxB1ScuPA的表达量提高至菌体总蛋白的36%.结论:通过选择具有稀有密码子tRNA的宿主菌BL21-RIL和优化诱导条件,使AnxB1ScuPA在大肠杆菌中得到高效表达.     

C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3) pXETAB2B1表达条件的优化

目的 优化C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3)pXETAB2B1融合蛋白表达的条件.方法 以IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)为诱导剂,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳比较pH值、培养温度、诱导时间、菌体生长密度等因素对重组α-β2-β1融合蛋白表达进行表达条件的影响.结果 C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3)pXETAB2B1的表达优化条件是最适培养基pH值是7.5,最适诱导时间是5小时,最适表达温度是37℃,最适菌体生长密度是OD6001.0,IPTG最适诱导浓度是0.4 mmol/L.结论 获得C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3)pXETAB2B1融合蛋白的最佳表达条件.     

幽门螺杆菌Omp22-HpaA融合基因工程菌蛋白的表达

目的:优化幽门螺杆菌Omp22-HpaA基因工程菌pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达条件,并对其表达产物进行纯化和鉴定.方法:在不同诱导时机、不同诱导剂(IPTG)浓度和不同诱导时间条件下诱导pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,采用Amyloss树脂预装柱对可溶性Omp22-HpaA蛋白进行分离、纯化,对纯化后的蛋白行Western blot分析.结果:工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.4 mmol/L)诱导7 h,目的蛋白Omp22-HpaA表达量达到菌体总蛋白的20%以上.经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性.结论:建立了从pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1可溶性表达产物中纯化较高纯度Omp22-HpaA融合蛋白的方法.     

ImageJ软件在重组质粒pET32a-CDK2中蛋白表达的应用

目的应用Image J软件探索细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)在重组质粒pET32a-CDK2中的蛋白表达条件。方法将重组质粒pET32a-CDK2转入表达菌株BL21(DE3),然后在不同时间点(0、1、2、3、4h)和不同浓度(0.5、1、2 mmol/L)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)下诱导表达目的蛋白CDK2,对CDK2采用SDS-PAGE法进行蛋白电泳,并应用Image J软件对电泳条带进行灰度分析。结果 CDK2诱导表达量在不同时间点差异有统计学意义(P0.001),其中0h与1h、2h、3h、4h诱导表达量的差异均有统计学意义(P=0.007,P0.001,P0.001,P0.001);1h与3h和4h诱导表达量的差异均有统计学意义(P=0.001);而2h和1h、3h、4h诱导表达量的差异均无统计学意义(均有P0.05);不同浓度IPTG下的CDK2诱导表达量差异无统计学意义(P=0.336,P=0.240,P=1.000)。结论根据Image J软件分析结果,采用0.5 mmol/L浓度IPTG 2h的条件,节约诱导时间和试剂用量。     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的诱导表达与活性鉴定

目的：优化幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白诱导表达的条件,以提高目的蛋白的产量。方法：表达幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的重组基因工程菌BL21（pET-HU27）在不同温度下（25℃、37℃）以不同的IPTG浓度（0.3、1.0和2.0 mmol·L^-1）和不同的培养基（LB、SOC）中分别诱导表达不同时间,表达产物经超声破碎后,进行融合蛋白可溶性分析,并用Western blotting 对表达产物进行鉴定。结果：SDS-PAGE结果显示,37℃时,LB培养基中,0.3 mmol·L^-1的IPTG浓度诱导5 h时,融合蛋白的含量最高为21.51%;25℃,SOC培养基中,1.0 mmol·L^-1的IPTG浓度诱导8 h时,可溶性HspA-UreB融合蛋白含量最高为34.58%,表达产物能够被免疫小鼠血清识别。结论：实现了幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白在原核细胞中的高效表达,并具有良好的免疫活性,为进一步开发应用以该融合蛋白为抗原的幽门螺杆菌疫苗打下了坚实的基础。     

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发...     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

日本血吸虫14-3-3蛋白质编码基因在原核细胞中的表达

目的 :为了寻找日本血吸虫病新的诊断和候选疫苗分子 ,克隆日本血吸虫 14 -3 -3蛋白质编码基因 ,并进行表达。方法 :提取日本血吸虫成虫RNA ,设计合成引物 ,用RT -PCR法扩增出日本血吸虫 14 -3 -3抗原 (Sj14 -3 -3 )基因编码序列 ,将其克隆入pGEM -T载体 ,然后在真核表达载体 pBKCMV中亚克隆 ,用IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE观察表达结果。结果 :RT -PCR法扩增出一条大小约 765bp的特异性片断 ,克隆质粒pGEM -Sj14 -3 -3和真核表达质粒pBKCMV经双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段 ,诱导表达后 ,经SDS -PAGE可见一条约 3 2 5kDa大小的融合蛋白条带。结论 :本实验成功地克隆了日本血吸虫 14 -3 -3抗原的编码基因 ,并在原核细胞中进行表达 ,为进一步的免疫诊断和核酸疫苗研究奠定了基础。     

三氯化镧对体外培养人肝癌细胞的抑制作用

目的：研究三氯化镧（LaCl₃）对人肝癌细胞株SMMC-7721生长的影响及其作用机理。方法：体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721，给予LaCl₃（0.05、0.10、0.50及1.00 mmol•L^-1）培养不同时间（1、3、5和7 d），观察癌细胞生长曲线、集落抑制率、培 养上清中甲胎蛋白(AFP)的变化。采用流式细胞术检测SMMC-7721细胞周期变化。免疫组织化学检测培养 细胞CyclinD1、 PCNA、 CDK₄及P16的表达情况。结果: MTT法显示0.50及1.00 m mol•L^-1LaCl ₃对SMMC-7721生长具有明显的抑制作用, 且具有剂量和时间的依赖性; 0.10和0.50 mm ol•L^-1的LaCl₃对肝癌细胞集落的形成抑制率分别为51%和67%（P<0.05）,1.00 mmol•L^-1 LaCl ₃的集落形成抑制率达97％（P<0.01 ）；不同剂量LaCl₃　 作用SMMC-7721细胞3 d后，细胞周 期发生明显变化，表现为G₀/G₁期细胞百分数增加，与对照组比较差异有显著性（P<0.01）。0.10、0.50及1.00 mmol•L^-1 LaCl_{3均可抑制AFP的分泌，其中以1.00 mmol•L^-1 LaCl3组作用最显著（P<0.01 ）。免疫细胞化学结果显示，LaC l3促进P16蛋白 的表达，使Cyclin D1、PCNA和CDK4蛋白的表达下降。结论: LaCl3 对SMMC-7721细胞生长具有明显的抑制作用, 其机制可能与阻断细胞周期进程、降低细胞的恶性程度有关。}     

牛磺酸对原代培养新生大鼠乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的作用

目的：探讨牛磺酸（Tau）对原代培养的新生大鼠乳鼠心肌细胞的保护作用及对心肌成纤维细胞的生长抑制作用。方法：将心肌细胞分为对照组、H₂O₂损伤模型组以及H₂O₂损伤加药物治疗组：阳性药川芎嗪（Lig）组及Tau大、中、小（80、40及20 mmol·L^-1）剂量组，预先24 h给予治疗药物后使用0.5 mmol·L^-1 H₂O₂损伤心肌细胞6 h，观察Tau对心肌细胞形态学的影响，MTT法测定反映心肌细胞存活力的A值以及测量乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的变化；将心肌成纤维细胞随机分为7组，分别给予0、10、20、40、80、160及320 mmol·L^-1 Tau，MTT法测定不同浓度Tau对心肌成纤维细胞生长的影响。结果：H₂O₂损伤心肌细胞6 h后，Tau（80、40及20 mmol·L^-1）剂量组A值分别为0.479±0.055、0.437±0.052及0.421±0.062，与H₂O₂组（0.304±0.050）比较，差异均具有显著性（P<0.001或P<0.01）；Tau（80及40 mmol·L^-1）剂量组使H₂O₂损伤的心肌细胞LDH释放减少、SOD含量增加、MDA含量降低，与H₂O₂损伤组比较差异均具有显著性（P<0.01或P<0.05）；40～320 mmol·L^-1 Tau抑制心肌成纤维细胞的生长，与空白对照组比较差异具有显著性（P<0.05，P<0.01或P<0.001）。结论：Tau可通过减轻自由基对心肌细胞的损伤，抑制心肌成纤维细胞生长，达到心脏保护作用。     

人参皂苷Rh2诱导PC-3M细胞凋亡及其对新基因GRIM-19表达的影响

目的:研究人参单体皂苷Rh₂对激素非依赖性人前列腺癌细胞(PC-3M细胞株)的致凋亡作用及其对新基因GRIM-19表达的影响。方法:实验分为Rh₂高剂量组（40 mg·L^-1）、Rh₂中剂量组（30 mg·L^-1）、Rh₂低剂量组（15 mg·L^-1）及对照组（未加药组）。分别作用于PC-3M细胞24 h,吖啶橙染色观察其对PC-3M细胞的促凋亡作用;RT-PCR和Western blotting方法分别检测Rh₂对PC-3M细胞GRIM-19 mRNA及其蛋白表达的影响。结果:Rh₂高、中、低剂量组作用于PC-3M细胞24h吖啶橙染色均呈阳性结果。Rh₂低剂量组出现典型“出芽”现象,细胞中出现致密鲜亮橙色斑点。对照组细胞呈均匀绿色;RT-PCR结果显示,GRIM-19 mRNA随Rh₂浓度的增加表达逐渐增强,Rh₂中、低剂量组与对照组比较差异具有显著性（P<0.05）,Rh₂高剂量组GRIM-19 mRNA表达与对照组比较差异具有高度显著性（P<0.01）。Western blotting结果与RT-PCR结果相一致,GRIM-19蛋白随Rh₂浓度的增加其表达逐渐增强,Rh₂中低剂量组与对照组比较差异具有显著性（P<0.05）,Rh₂高剂量组GRIM-19蛋白的表达与对照组比较差异具有高度显著性（P<0.01）。结论:Rh₂诱导PC-3M细胞凋亡与上调GRIM-19基因和蛋白表达有关,其表达强度呈剂量依赖性。     

杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA片段的克隆与分析

目的:克隆杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段,并对其进行测序和序列分析.方法:根据衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿等14-3-3蛋白的高度保守序列SVAYKNV、DSTLIMQ设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.PCR产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落,测序,BLAST进行同源性比对.结果:克隆获得531 bp的cDNA片段,编码177个氨基酸(GenBank AN:AY965896).同源性比较显示,序列与其他生物具有高度的同源性,其与衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿、人等的同源性分别为:94%,84%,84%,83%,83%和80%.结论:克隆得到了杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.     

Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的：获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白（GFP）标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法：应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5和1.0 mmol•L^-1）和不同温度（22℃和37℃）诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。 结果：0.5和1.0 mmol•L^-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温（22℃）诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。 结论：低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。     

类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建pGEX-4T- 1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白.方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312 bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测...