铜绿假单胞菌外毒素A基因DNA片段的克隆及序列测定

目的 建立含有铜绿假单胞菌外毒素A基因DNA片段的克隆株。方法 根据已报道的序列设计铜绿假单胞菌外毒素A基因的特异引物,用PCR方法从标本扩增出预期大小的DNA片段,并将该片段纯化后与T载体连接,转化到大肠埃希菌,筛选出含有插入片段的克隆。结果 阳性克隆株经DNA序列测定,证实与已报道的铜绿假单胞菌外毒素A基因DNA序列,在399个碱基中仅有3个碱基不同,但编码的氨基酸完全一致。结论 成功构建含有铜绿假单胞菌外毒素A基因的克隆,为大量制备探针和用PCR方法检测铜绿假单胞菌提供了基础。     

嗜麦芽窄食单胞菌所产L1型金属β内酰胺酶的序列分析及原核表达

目的对嗜麦芽窄食单胞菌所产L1型金属β内酰胺酶基因进行测序、原核表达。方法PCR扩增L1酶的编码基因，将其亚克隆入pUCm—T载体后测定核苷酸序列，将u酶基因克隆至表达载体pET-41a( )后在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况，等电聚集电泳测定表达蛋白的等电点。结果本实验中L1的编码基因与国外同类酶的氨基酸同源性为92．44％。此L1酶基因可在大肠埃希菌BL21(DE3)中大量表达，等电点为6．7。结论对L1型金属β内酰胺酶的克隆测序及成功表达为进一步研究该酶的分子生物学特性奠定了基础。     

三维试验检测革兰阴性杆菌ESBLs及AmpC酶

目的了解革兰阴性杆菌中产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、染色体头孢菌素酶（AmpC）的分布及分离率。方法准确鉴定菌株,采用底物为头孢噻肟的三维试验,测定菌株中ESBLs及AmpC酶。结果临床分离175株革兰阴性杆菌中产ESBLs 49株,阳性率28.0%,包括阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、克雷伯菌属、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和弗劳地枸橼酸菌。产AmpC酶22株,阳性率12.6%,包括阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、产酸克雷伯菌。其中阴沟肠杆菌产ESBLs及AmpC酶分离率均居首位（分别为55.6%、33.3%）。3株铜绿假单胞菌同时产AmpC酶和ESBLs。结论我院产ESBLs菌以阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌为主。产AmpC酶以阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌为主。超超广谱β-内酰胺酶（SSBLs）菌株在医院有流行。     

重症监护病房产VIM-2型金属酶绿脓假单胞菌的研究

目的分析重症监护病房产金属β内酰胺酶绿脓假单胞菌的同源性、金属酶基因型及转移机制。方法用2-巯基丙酸协同试验筛选重症监护病房分离的对亚胺培南耐药的绿脓假单胞菌中的产金属酶株，聚合酶链反应(PCR)、克隆测序确定耐药基因，整合子PCR扩增，脉冲场凝胶电脉分析同源性。结果26株绿脓假单胞菌2-巯基丙酸协同试验阳性，酶粗提液能水解亚胺培南，活性能被EDTA抑制。VIM型金属酶引物PCR扩增阳性，经克隆测序证实为VIM-2型金属酶。整合子可变区序列分析表明，blaVIM-2位于Ⅰ类整合子上，该基因上游含有1个aacA4基因，下游为aadB基因。脉冲场凝胶电脉结果证实产酶株均来自同一克隆。结论医院重症监护病房有产VIM-2型金属酶绿脓假单胞菌的流行，耐药基因位于Ⅰ类整合子上。     

产KPC铜绿假单胞菌的耐药性研究

目的探讨产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）铜绿假单胞菌的耐药性。方法铜绿假单胞菌菌株来自2例痰液标本。采用VITEK 2COMPACT全自动微生物鉴定/药敏分析仪进行细菌菌株的鉴定,应用聚合酶链反应（PCR）及基因测序法鉴定KPC酶基因型,采用肉汤稀释法进行抗菌药的最低抑菌浓度（MIC）测定。结果 2例菌株均对β-内酰胺类抗菌药、左氧氟沙星耐药,对环丙沙星中介,对庆大霉素、奈替米星、妥布霉素、黏菌素及多黏菌素B敏感;其中1株还对替加环素敏感。2例菌株所产碳青霉烯酶不是金属β-内酰胺酶,其亚型为KPC-2。接合实验未能证明bla KPC基因能接合转移到大肠埃希菌J53中。结论产KPC铜绿假单胞菌的出现给临床抗感染治疗带来严峻挑战。     

氨基末端B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体的构建及纯化

目的 克隆人氨基末端B型钠尿肽（NT-proBNP）基因,构建原核表达载体并纯化其表达蛋白.方法 用聚合酶链反应（PCR）从正常成人cDNA库中扩增出人NT-proBNP基因,将其克隆进pUCm-T中测定核苷酸序列.构建大肠杆菌分泌性表达载体pGEX-4T-3-NT-proBNP,IPTG诱导表达,GSH-agarose亲和纯化该表达蛋白.结果经PCR扩增成功获得228 bp的NT-proBNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的23%,用SDS-PAGE和Western blot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子质量为34 600.经亲和纯化后的GST-NT-proBNP的纯度可以达到95%,得率为1.7 mg/100 ml.结论 NT-proBNP基因的克隆、表达和纯化成功,为建立NT-proBNP检测方法奠定了基础.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprM原核表达及抗体制备

目的制备铜绿假单胞菌（PA）主动外排系统外膜蛋白OprM及抗OprM多克隆抗体,为深入研究主动外排系统奠定基础。方法从PA基因组中克隆oprM基因,构建pET28 a-c-OprM表达载体,在大肠埃希菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并用免疫转印试验（W estern b lot）验证,建立重组OprM纯化方案,免疫动物制备多克隆抗体。结果扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点及保护碱基的oprM基因序列,构建了pET28 a-c-OprM表达载体,诱导表达的重组OprM蛋白为带有H is标签的不可溶包涵体,建立并优化了重组OprM的纯化方法,免疫小鼠获得抗OprM蛋白的多克隆抗体。结论成功制备了OprM蛋白和抗OprM多克隆抗体,为深入研究该蛋白及相关的主动外排系统提供了有效手段。     

产AmpC酶铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制的研究

目的研究产AmpC酶的铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的分子机制。方法2003-2007年从临床标本中分离到铜绿假单胞菌220株，采用三维试验筛选产8内酰胺酶（包括AmpC酶）的铜绿假单胞菌，应用多重PCR检测产AmpC酶的铜绿假单胞菌质粒携带的AmpC耐药基因，应用荧光定量RT—PCR的方法检测染色体AmpC酶基因和oprD2基因的表达情况。结果共检出40株产口内酰胺酶的菌株，其中产AmpC酶、ESBLs、金属酶（MBL）和未知酶型铜绿假单胞菌的构成比分别是62．5％（25／40）、20％（8／40）、7．5％（3／40）和10％（4／40）。25株产AmpC酶菌株均有不同程度AmpC酶基因表达量升高，其中，仅1株细菌携带DHA质粒型AmpC酶基因，12株菌oprD2基因表达量减低，这些菌株均对亚胺培南耐药，13株菌oprD2基因表达量正常，其中仅5株菌对亚胺培南耐药；7株菌（占产AmpC酶菌株的28％，不产金属酶）的酶粗提物能微弱水解IPM，这7株菌AmpC酶基因的表达量均有明显升高，其中5株菌同时伴有oprD2基因表达量降低。结论铜绿假单胞菌产生的AmpC酶可做弱水解亚胺培南，且其水解亚胺培南可能与AmpC酶产生量有一定关系；产AmpC酶铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的原因可能是细菌AmpC酶表达量增加和oprD2表达量减低两者共同作用的结果。     

大肠埃希菌中质粒AmpC酶的流行分布

目的了解河南地区大肠埃希菌中质粒AmpC酶的流行分布及其基因特征。方法对380株大肠埃希菌进行AmpC酶表型筛选,对筛选阳性株进行多重聚合酶链反应（PCR）及型特异PCR、克隆、测序;等电聚焦电泳检测细菌β-内酰胺酶等电点;接合实验验证质粒传递性;肠杆菌科基因组内重复一致序列（ERIC-2）PCR检测同源性。结果380株大肠埃希菌中2．1％（8株）的细菌产AmpC酶,经测序证实均为DHA-1型质粒AmpC酶基因,ERIC-2PCR结果显示质粒AmpC酶主要以非克隆传播为主。结论河南地区发现DHA-1型质粒AmpC酶以非克隆传播为主。     

大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶的基因型检测

目的 了解大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶的现状及其基因型。方法 收集任一第三代头孢菌素和头孢两丁耐药的大肠埃希菌临床分离株42株．以改良三维试验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和AmpC酶。用碱裂解法提取质粒，应用多重聚合酶链反应（multiplex polymerase chain reaction，MPCR）对AmpC酶的基因进行检测。对PCR扩增阳性的样本进行基因测序以确定基因型。结果 42株大肠埃希菌中，经三维试验检测，单纯产ESBLs者18株（42．8％），单纯产质粒AmpC酶者4株（9．5％）．同时产质粒AmpC酶与ESBLs者1株（2．3％），5株AmpC酶三维试验阳性菌株，经PCR扩增其中4株扩增到了清晰的条带，1株扩增为阴性，PCR产物经测序分析其基因型均为DHA-1型。结论 大肠埃希菌临床分离株产ESBLs率较高，并己经出现了质粒介导的AmpC酶，其基因型为DHA-1型。     

耐亚胺培南革兰阴性杆菌产碳青霉烯酶研究

目的 了解细菌产碳青霉烯酶及其对亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗生素耐药性之间的关系。方法 应用改良Hodge Test和乙二胺四乙酸（EDTA）协同试验法对2003．6～2004．5收集自复旦大学华山医院的耐亚胺培南革兰阴性杆菌进行碳青霉烯酶筛选。blaVIM-1、blaVIM-2、blaIMP-2、blaIMP-2、blaSPM、blaOXA-23为引物进行PCR扩增，并对PCR扩增阳性产物进行DNA测序分析。结果 在75株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中，共检出产VIM-2型金属13内酰胺酶菌株2株（2／75），在10株耐亚胺培南的假单胞菌属细菌中检出2株产VIM-2型金属13内酰胺酶（2／10），均为恶臭假单胞菌；耐亚胺培南的8株弗劳地柠檬酸杆菌和6株不动杆菌中全部分别检出IMP金属酶新亚型和OXA-23型碳青霉烯酶。结论 细菌产碳青霉烯酶是不动杆菌和弗劳地柠檬酸杆菌对亚胺培南和美罗培南等碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因之一，但对铜绿假单胞菌而言，产碳青霉烯酶不是导致其对亚胺培南耐药的主要原因。     

产金属酶铜绿假单胞菌的检测及耐药现状调查

目的:研究临床中分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌的产金属酶的检测及耐药现状,为合理选择抗生素提供理论依据。方法:采用EDTA纸片复合法和E-test法分别筛选产金属β-内酰胺酶菌株,同时用PCR法检测blaIMP-1和blaVIM-2耐药基因,用MIC法测定产金属β-内酰胺酶菌株对8种常用抗菌药物的敏感度。结果:30株耐亚胺培南铜绿假单胞菌ED-TA纸片复合法筛选9株产金属酶菌株;E-test法筛选6株产金属酶菌株;PCR法仅检测到1株blaIMP-1和3株blaVIM-2耐药基因。产金属酶菌株呈多重耐药,尤其是PCR法产金属酶菌株耐药呈现为高水平耐药;阿米卡星抗菌活性最好,其次为环丙沙星。结论:金属酶是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的原因之一,我院临床分离铜绿假单胞菌中部分携带金属酶,该酶导致该菌对碳青霉烯类耐药。     

VEGFR-2/KDR三区的载体构建、表达及胃癌患者抗-KDR抗体的检测

目的扩增人血管内皮细胞生长因子受体-2／激酶插入受体（VEGFR-2／KDR）三区基因,构建表达载体,在大肠埃希菌中表达,获得纯化蛋白。检测胃癌术前患者外周血中抗-KDR抗体水平,为进一步研究KDR与抗-KDR抗体在胃癌中的作用奠定基础。方法从人血管内皮细胞株ECV304提取总RNA,逆转录后,聚合酶链反应（PCR）扩增KDR胞外段三区基因,连接到pMD18-T载体测序;酶切后将目的基因插入原核表达载体pET28α（＋）构建重组质粒,将重组质粒转化到大肠埃希菌DH5et内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达菌株BL21（DE3）,异丙基-B-D硫化半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用Ni^2＋-NTA树脂纯化、复性;用获得的蛋白包被酶联免疫吸附试验（ELISA）板,用ELISA检测32例胃癌患者和35名健康对照者外周血抗．KDR抗体水平。结果构建了表达载体pET28α（＋）-KDR3,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为16000,重组蛋白以包涵体形式存在。胃癌患者外周血中抗-KDR抗体水平显著高于健康对照组（P〈0．01）。结论VEGFR-2／KDR三区基因成功克隆到表达质粒内并表达。为进一步研究KDR与抗-KDR抗体在胃癌中的作用奠定了基础,及可能为胃癌的血清学诊断提供新的方法。     

藤黄微球菌RPF基因蛋白的克隆、表达与鉴定

目的构建表达藤黄微球菌RPF基因蛋白的重组质粒,并在大肠埃希菌中表达获得基因重组蛋白。方法提取藤黄微球菌基因组DNA,以PCR扩增RPF基因,克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),在30℃用IPTG诱导3 h后进行SDS-PAGE分析。结果测序结果证实获得了藤黄微球菌RPF基因,其序列与GenBank中报道完全一致;SDS-PAGE分析表明,RPF基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达了重组蛋白,表达的蛋白量约占菌体蛋白的33.8%。结论成功克隆了藤黄微球菌RPF基因,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,为进一步研究该蛋白的生物学活性及其功能奠定基础。     

膜孔蛋白在产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的作用

目的调查产头孢菌素β-内酰胺酶（AmpC酶）的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌膜孔蛋白的表达情况,分析其耐药机制。方法收集2003至2009年间产AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌65株,三维试验确定细菌AmpC酶的产生情况,多重聚合酶链反应（PCR）扩增ampC基因和膜孔蛋白ompF、ompK35、ompK36基因,实时定量逆转录RT-PCR检测膜孔蛋白的相对表达量,纸片扩散法检测抗菌药物的敏感性。结果 32株大肠埃希菌中,14株（43.75%）膜孔蛋白ompF转录水平下调;33株肺炎克雷伯菌中,17株（51.52%）膜孔蛋白ompK35、ompK36转录水平下调。结论在产AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中膜孔蛋白的低表达是造成耐药不可忽视的因素之一。     

大肠埃希菌和克雷伯菌临床分离株中整合子介导的多重耐药性的相关性分析Ⅰ

目的研究整合子介导的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的多重耐药性。方法采用聚合酶链反应（PCR）对临床分离的135株大肠埃希菌和59株克雷伯菌进行Ⅰ型和Ⅱ型整合酶基因的检测。结果在135株大肠埃希菌和59株克雷伯菌中，大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）率为50．4％，克雷伯菌产ESBLs率为37.3％，共检出105株细菌携带Ⅰ类整合酶基因，72株为大肠埃希菌，占53.33％（72／135），33株肺炎克雷伯菌，占55.93％（33／59）；其中携带Ⅱ类整合酶基因3株，全部为大肠埃希菌，此3株同时携带Ⅰ类整合酶基因并产ESBLs。结论Ⅰ类整合子在大肠埃希菌和克雷伯菌中分布广泛。整合子与大肠埃希菌和克雷伯菌的耐药有关，即整合子阳性菌比整合子阴性菌更容易产生耐药。     

人线粒体肌酸激酶广泛型亚型在大肠埃希菌中的表达及抗体制备

目的　获得人线粒体肌酸激酶广泛型亚型 (uMtCK)的全长基因 ,在大肠埃希菌中表达 ,研制抗uMtCK多克隆抗体。方法　采用逆转录PCR从培养的肿瘤细胞 (Hela细胞 )中成功扩增出 10 6 2bp的uMtCK的基因片段 ,插入到质粒pMD18 T中 ,经酶切和测序证实为uMtCK的基因编码序列 ,再插入到质粒pQE30 ,转化大肠埃希菌 ,诱导重组质粒pQE30 uMtCK表达酶融合蛋白。经亲和层析纯化 ,并进行SDS PAGE、westernblot鉴定及酶活性测定。纯化的uMtCK蛋白免疫家兔制备抗uMtCK多抗。结果　RT PCR扩增出的片段经酶切鉴定和测序证实为uMtCK的基因 ;在大肠埃希菌M15中实现了高效、可溶性的融合表达 ,表达量约 17%。重组uMtCK具有CK样催化活性 ,表明原核表达的uMtCK具有类似于天然蛋白质的生物学活性。经免疫印迹分析 ,制备的抗uMtCK多抗适合作uMtCK的进一步分析之用。结论　人uMtCK在大肠埃希菌中实现了高效表达 ,制备了针对uMtCK的抗体。     

1612例痰标本细菌培养及药敏分析

[目的]探讨痰标本细菌感染的分布及耐药状况,为临床抗感染治疗提供参考依据.[方法]总结分析本院2009年3月至2011年3月两年间1 612例痰标本细菌培养及药敏检测结果.[结果]从1 612例痰标本中共检出 497株病原菌.其中革兰阳性菌189株占38.0%,前3位为表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌;革兰阴性菌277株占55.7%,前3位为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌;真菌感染31株占6.2%.497株细菌中对第三代头孢菌素2种或以上有中介或耐药的革兰阴性杆菌108株.其中产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的阳性率为大肠埃希菌40%（6/15）、肺炎克雷伯菌48.8%（21/43）、阴沟肠杆菌61.1%（11/18）、铜绿假单胞菌46.8% （15/32）;产AmpC酶的阳性率为大肠埃希氏菌20%（3/15）、肺炎克雷伯菌9.3%（4/43）、阴沟肠杆菌33.3%（7/18）、铜绿假单胞菌6.3%（2/32）.其他革兰阴性杆菌未检出ESBLs、AmpC酶.[结论]肺部感染常见病原菌发生变化,产ESBLs酶和AmpC酶阳性株发现率越来越高.临床应重视并开展ESBLs、AmpC的检测和耐药率监测,合理使用抗生素,以减少耐药菌株的产生.     

4株产TEM型超广谱β内酰胺酶肠杆菌科细菌的研究

目的：鉴定临床分离的3株大肠埃希菌和1株肺炎克雷伯菌所产的TEM型β内酰胺酶编码基因的序列，并进行原核表达，了解其相关特性。方法：聚合酶链反应(PCR)扩增TEM型β内酰胺酶编码基因片段，克隆入pGEM—T easy载体，表达于感受态细胞大肠埃希菌DH5a中，双脱氧链终止法测定核苷酸序列，确定基因型；其基因与原核表达载体(pET-28c)连接，并在感受态细胞大肠埃希菌DH5a中进行原核表达，提取质粒，用PCR进行表达鉴定，用超广谱β内酰胺酶(ESBLs)表型确认试验鉴定表达菌株的表型，另外对这些临床菌株进行接合试验。结果：PCR扩增结果显示这4株细菌产生的TEM型β内酰胺酶编码基因片段含981个核苷酸，其表达酶的性质均为ESBLs，临床菌株的质粒接合试验均为阳性。这4株临床菌株所产生的TEM型β内酰胺酶的编码基因已被GenBank命名为TEM-10(GenBank注册号：U95363)。结论：安徽地区这4株细菌所产TEM型β内酰胺酶均为TEM-10，在国内我们首次从临床分离株中发现TEM-10。     

临床革兰阴性杆菌整合子携带情况及其与耐药性的相关性分析

目的研究临床分离的4种革兰阴性杆菌耐药性与整合子的关系。方法收集江苏大学附属医院2017年10月—12月临床分离的肺炎克雷伯菌56株、大肠埃希菌49株、铜绿假单胞菌45株及鲍曼不动杆菌48株,Vitek 2 Compact全自动鉴定和药敏分析仪及K-B法进行药敏试验;多重PCR法检测细菌携带Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子情况,并比较细菌耐药性与携带整合子之间的关系。结果 4种革兰阴性杆菌中共有37.37%的菌株检出Ⅰ类整合酶基因,其中鲍曼不动杆菌的阳性率为54.17%,大肠埃希菌的阳性率为46.94%,肺炎克雷伯菌的阳性率为39.29%,铜绿假单胞菌的阳性率为6.67%,所有菌株均未检测到Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因。4种革兰阴性杆菌中,铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌携带Ⅰ类整合子菌株对部分药物的耐药率较未携带整合子菌株差异有统计学意义,而携带Ⅰ类整合子的鲍曼不动杆菌的耐药率较未携带菌株差异均无统计学意义。结论Ⅰ类整合子在镇江地区临床分离革兰阴性杆菌中普遍存在,且与铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性存在一定的相关性。