ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型的影响

目的 以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORCl基因表达抑制后对VSMCs表型的影响.方法 实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性siRNA组.应用Western blot检测ORC1基因表达的变化;免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构;应用流式细胞仪检测细胞表型标志蛋白表达.结果 ①siRNA转染后,阳性siRNA组ORCI基因表达水显著降低,而正常对照组及阴性siRNA组间ORC1基因表达水平无显著差异.②siRNA转染后,阳性转染组细胞呈现收缩型形态特征,空白对照组及阴性对照组细胞呈现合成型形态特征.③siRNA转染使ORCI表达减弱后,VSMCs收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)和平滑肌肌动蛋白重链2(SM-2)表达水平明显升高.合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin)表达水平明显降低,空白对照组及阴性对照组间3种标志物表达水平无显著差异.结论 RNA干扰介导的ORC1基凶沉寂可促使VSMCs由合成型向收缩型转化.     

两种原代培养方法对血管平滑肌细胞收缩表型的影响

目的：探究胶原酶消化法和植块法培养原代血管平滑肌细胞（VSMCs）对细胞收缩表型影响的特点。方法：使用II型胶原酶消化法和植块法分别离体培养原代VSMCs,并获取第1代、第2代、第4代、第8代、第12代VSMCs,Western blot检测不同代数表型标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（SMA-α）、调宁蛋白（calponin）和骨桥蛋白（OPN）表达情况;随后检测不同培养方法间表型标志蛋白表达差异,并用划痕实验和MTT实验检测迁移、增殖水平,免疫荧光检测SMA-α胞内表达。结果：消化法最初可获得明显优于植块法的VSMCs收缩表型,表现为SMA-α和calponin高表达,OPN较低表达,增殖、迁移能力相对较弱。培养至第8代后,2种方法的细胞都发生显著的表型改变,增殖、迁移能力增强且消化法细胞呈现更强的去分化表型趋势。结论：II型胶原酶消化法可快速获得良好收缩表型的VSMCs,在第4代前具有优于植块法的收缩表型。     

益肾活血汤通过p38MAPK信号途径调控系膜细胞纤连蛋白及Ⅳ型胶原的研究

目的探讨中药方剂益肾活血汤通过p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号转导途径对肾小球系膜细胞纤连蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（COL Ⅳ）表达的影响。方法采用血清药理学方法制备中药血清,体外培养肾小球系膜细胞分组为：对照组（正常鼠血清）、IL 1β组（正常鼠血清+10%IL 1β）、中药血清组（中药血清+10%IL 1β）。采用双抗体夹心ELISA法检测大鼠系膜细胞FN、COL Ⅳ表达,蛋白印记法（Western blot）检测磷酸化p38MAPK（p p38MAPK）及α 平滑肌肌动蛋白（α SMA）水平。结果与IL 1β组相比,中药血清组FN、p p38MAPK蛋白的表达量降低（P＜0.01）。α SMA、COLⅣ的表达亦降低（P＜0.05）。结论中药益肾活血汤可降低肾小球系膜细胞α SMA的表达,从而抑制肾小球系膜细胞的表型转化,减少细胞外基质FN、COL Ⅳ的表达,该作用可能是通过抑制p p38MAPK信号通路而实现的。     

脑出血患者脑小动脉壁α-平滑肌肌动蛋白的表达

目的探讨脑出血时脑小动脉平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达与动脉粥样硬化的关系.方法应用免疫组化技术并结合计算机图像分析,检测人类高血压脑出血脑小动脉内α-SMA的表达程度.结果在脑出血组脑小动脉内α-SMA的表达明显增加.结论α-SMA的表达可作为血管平滑肌细胞(VSMC)激活的标志,它的出现标志着VSMC被激活并处于增殖/分泌表型.     

脑出血患者脑小动脉壁a—平滑肌肌动蛋白的表达

目的 探讨脑出血时脑小动脉平滑肌肌动蛋白（a-SMA）表达与动脉弱样硬化的关系。方法 应用免疫组化技术并结合计算机图像分析，检测人类高血压脑出血脑小动脉内a-SMA的表达程度。结果 在脑出血组脑小动脉内a-SMA的表达明显增加。结论 a-SMA的表达可作为血管平滑肌细胞(VSMC)激活的标志，它的出现标志着VSMC被激活并处于增殖/分泌表型。     

脑出血患者脑小动脉壁α-平滑肌肌动蛋白的表达

目的　探讨脑出血时脑小动脉平滑肌肌动蛋白 (α- SMA)表达与动脉粥样硬化的关系。方法　应用免疫组化技术并结合计算机图像分析 ,检测人类高血压脑出血脑小动脉内 α- SMA的表达程度。结果　在脑出血组脑小动脉内 α- SMA的表达明显增加。结论　 α- SMA的表达可作为血管平滑肌细胞 (VSMC)激活的标志 ,它的出现标志着 VSMC被激活并处于增殖 /分泌表型。     

SM22α、α-SMA、OPN在人胸主动脉夹层中的表达及血管平滑肌细胞表型的变化

目的:探讨平滑肌22α(SM22α)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、骨桥蛋白(OPN)在人胸主动脉夹层中的表达及血管平滑肌细胞(VSMC)表型的变化。方法:收集人胸主动脉夹层(TAD)动脉壁组织和正常人胸主动脉壁组织标本,采用免疫组化方法观察SM22α、α-SMA、OPN的表达。结果:与正常主动脉组相比,TAD组SM22α、α-SMA表达水平显著降低,OPN表达显著增高。结论:TAD主动脉壁VSMC表型由收缩型转变为增殖型为主,从而导致血管壁中膜性状改变,最终导致主动脉夹层病变。     

厄贝沙坦对2型糖尿病大鼠肾脏系膜细胞表型转变的影响

目的 探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体抑制剂厄贝沙坦对2型糖尿病大鼠肾脏系膜细胞表型转变的影响。方法 应用高糖高脂馀食加小剂量链脲佐菌素（STZ）制备2型糖尿病大鼠模型。厄贝沙坦（每日50mg/kg灌胃）治疗6周后，采用免疫组织化学技术和计算机图像分析系统分析肾组织中α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA）、Ⅳ型胶原表达水平。结果 厄贝沙坦可抑制糖尿病大鼠肾小球内α－SMA、Ⅳ型胶原蛋白的高表达。结论 厄贝沙坦对实验性2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能与抑制系膜细胞表型转化，减少胶原沉积有关。     

大鼠体外循环后血浆二胺氧化酶与小肠黏膜基质蛋白变化的相关性研究

目的探讨大鼠体外循环(CPB)后血浆二胺氧化酶活性与小肠黏膜细胞外基质蛋白变化的相关性,为阐明CPB后肠黏膜屏障损害的发生机制提供依据。方法健康成年雄性清洁级SD大鼠40只,随机分为CPB组(n=20)和假手术组(n=20),另取10只作为正常对照组。应用大鼠CPB模型进行操作并于转流结束后取血液标本及小肠组织标本,分光光度法测定血浆二胺氧化酶活性,免疫组化、放射免疫法和天狼星红苦味酸染色法测定小肠组织层粘连蛋白、Ⅳ型胶原和间质中Ⅰ、Ⅲ型胶原构成及含量变化,并进行统计学分析。结果 CPB组血浆中二胺氧化酶活性比假手术组和正常对照组显著增高(P=0.018);免疫组化显示CPB组小肠组织中层粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达下降,出现上皮基底膜变薄,部分出现断裂消失,含量明显低于假手术组和正常对照组;CPB组小肠间质中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原相间排列紊乱交错,Ⅰ型胶原减少明显。图像分析表明CPB组小肠组织胶原容积分数明显减少,而假手术和正常对照组之间无显著差异。线性回归及相关分析结果CPB后小肠黏膜层粘连蛋白、Ⅳ型胶原含量、胶原容积分数与血浆二胺氧化酶活性呈显著的负相关。结论 CPB后肠黏膜细胞外基质各成分含量下降与结构破坏是肠黏膜屏障功能损害的重要因素之一。     

CPI-17调控血管平滑肌表型对动脉粥样硬化形成的影响

目的  研究CPI-17（PKC-potentiated protein phosphatase inhibitory protein-17）通过诱导血管平滑肌细胞表型改变影响动脉粥样硬化形成的作用。方法  载脂蛋白E基因敲除（ApoE-knockout）小鼠经颈动脉套管术诱导形成动脉粥样斑块,以野生型C57BL/6小鼠为对照,分离颈动脉并提取总RNA,采用实时荧光定量PCR技术对比检测斑块组织与对照小鼠颈动脉中CPI-17及血管平滑肌细胞收缩功能相关蛋白-平滑肌肌球蛋白重链（sm-MHC）、α-肌动蛋白（α-actin）的mRNA水平。然后分别用50mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激及乏氧环境下培养作用于小鼠平滑肌细胞系MOVAS 细胞,实时荧光定量PCR检测两种刺激条件下CPI-17表达的变化。结果  ApoE-knock out小鼠粥样斑块平滑肌细胞的CPI-17 mRNA水平及sm-MHC、α-actin显著低于C57BL/6小鼠,ox-LDL刺激及乏氧培养的MOVAS细胞的CPI-17表达水平显著降低（P均<0.05）。结论  ox-LDL刺激及乏氧培养使MOVAS 细胞的CPI-17表达水平降低,可能通过调控血管平滑肌细胞的收缩特性参与动脉粥样硬化的发生。     

内源性硫化氢在糖尿病大鼠肾脏的变化及作用

新型内源性气体信号分子-硫化氢(内源性H₂S)具有类似氧化亚氮(nitric oxide,NO)的某些特征,如松弛血管、抑制血管平滑肌细胞增生、调节血管平滑肌细胞张力等作用.本系列研究观察了糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)大鼠肾脏内源性H₂S的变化以及与H₂S合成酶-半胱氨酸胱硫醚2β2合成酶(cystathionine 2β2 synthase, CBS)、胱硫醚2γ2裂解酶(cystathionine 2γ2 lyase, CSE)的关系,对DN大鼠肾脏病理改变的影响,对成肌纤维细胞特征性标志物-a平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, α-SMA)和细胞外基质成分-纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)在大鼠肾组织分布和表达的影响,来探讨内源性H₂S在糖尿病肾病发病机制中的作用.结果显示:1DN大鼠内源性H₂S量明显减少,肾脏CSE的表达亦明显减少.2内源性H₂S的减少与DN大鼠临床表现和肾脏病理改变密切相关.3DN组大鼠肾组织中α-SMA 和肾小球基质中FN均增加,分布增多,补充外源性H₂S后,α-SMA和 FN明显下降.DN大鼠肾脏内源性H₂S降低.肾脏CSE的减少可能是导致DN大鼠肾脏内源性H₂S降低的直接因素.外源性补充H₂S可抑制糖尿病肾病大鼠肾脏中成肌纤维细胞的生成和细胞外基质的过度积聚.提示,内源性H₂S的减少与糖尿病肾病的发生有关.     

高龄大鼠血管钙化及血管壁骨桥蛋白、骨钙素表达的研究

目的研究高龄大鼠血管钙化的发生情况,以及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OC)在高龄大鼠动脉血管壁表达的变化。方法选择20只20月龄的SD大鼠为实验组,20只3月龄的SD大鼠为对照组,取大鼠的主动脉条、心脏和肾组织备检。HE染色观察血管形态,Von Kossa染色判断钙盐沉积程度,免疫组化和蛋白质印迹法(Western-blot)测定血管壁OPN、OC的表达情况。结果实验组大鼠血管平滑肌细胞排列紊乱,中膜层厚度增加,弹力板断裂,血管纤维化程度增高;对照组大鼠血管内膜内皮细胞、血管平滑肌细胞排列整齐,弹力板完整。实验组大鼠的大动脉和微小动脉内均可见钙盐沉积,对照组动脉未见钙盐沉积。实验组大鼠血管壁OPN、OC的表达较对照组明显上调(P0.05)。结论血管中膜钙化可能是血管老化的病理表现,血管钙化的形成可能与骨形成相关蛋白OPN和OC的表达上调有关。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织贴块法培养及鉴定

目的:建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织贴块培养法.方法:取大鼠胸主动脉,切成1 mm×1 mm×1 mm的小块,均匀地种植于培养瓶壁上,约50 min后加入含有20%小牛血清的PRMI-1640培养基进行培养.结果:培养第5天时,可见少量梭形或长梭形细胞自组织块周围游出,至培养3周细胞融合成片,呈"峰、谷"状生长.肌动蛋白免疫组化染色,＞98%的细胞染色阳性,透射电镜观察,于基膜下和胞浆内可见密斑和密体.VG染色也证实几乎所有的细胞均为平滑肌细胞.结论:应用细胞贴块法培养大鼠平滑肌细胞,操作简单,结果稳定,纯度较高,具有应用价值.     

暂时阻断夹对局部血管壁损伤的电镜研究

目的探导暂时阻断夹夹闭颈内动脉、大脑中动脉不同时限对局部血管壁损伤的情况。方法将SD大鼠64只随机分为颈内动脉和大脑中动脉两组,每组又随机分为四个亚组。手术暴露颈内动脉或大脑中动脉后,用动脉暂时阻断夹夹闭颈内动脉或大脑中动脉,分别阻断0．5h,lh,2h,2．5h后,再灌流至24h,然后处死动物。取夹闭段动脉,用电镜观察血管壁超微结构改变。结果夹闭30min组,偶见内皮细胞浆内出现空泡,细微处可见平滑肌细胞粗面内质网扩张;夹闭60min组可见平滑肌细胞线粒体轻度肿胀,肌层稍变厚,其间偶见有新分泌形成的胶原蛋白或／和弹性蛋白,内皮细胞浆内出现散在空泡,有少许疏松的细胞间质;夹闭120min组见肌层增厚明显,平滑肌线粒体肿胀,中膜平滑肌伸出较长的突起。穿越附近的平滑肌细胞及内弹力层而达内皮下层,其细胞突起周围则见有较多新分泌形成的胶原蛋白或／和弹性蛋白;部分可见内皮细胞层与内弹力膜层分离;夹闭150min组内皮细胞核出现固缩,部分内皮细胞层脱落。结论夹闭60min是血管壁能耐受的最大极限,如进一步延长夹闭时间,可引起局部血管壁的损伤和管腔的狭窄,以及内皮细胞的脱落形成栓子,造成不可逆的脑缺血损害。     

Geminin基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)Geminin基因的表达观测VSMCs增殖情况及表型标志物。方法分别利用RT-PCR,Western blot检测VSMCs中Geminin基因、蛋白表达的变化,筛选出干扰效果最为显著的序列用于构建慢病毒包裹的稳定干扰模型。应用[3H]-TdR、EdU掺入试验检测VSMCs增殖的情况;同时使用Western blot分别检测干扰前后相关标志性基因的表达。结果①siRNA转染后,以第1亚组干扰效果最为显著,与另外2个阳性亚组及对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。②[3H]-TdR、EdU掺入实验显示:阳性干扰组的掺入量较两对照组明显升高(P<0.05)。③siRNA转染使Geminin基因表达减弱后,阳性组VSMCs合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达水平显著升高,收缩型标志物平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,α-Actin)表达水平明显降低,与对照组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 RNA干扰介导的Geminin基因沉寂可显著增强VSMCs的增殖能力,并有助于VSMCs的表型由收缩型向合成型转化。     

E1A激活基因阻遏子在不同表型血管平滑肌细胞中的表达

目的 探讨血管平滑肌细胞表型转换、分化过程中E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)的表达变化及其相关机制。方法 将PCR扩增的CREG片段插入pGEX-4T-1原核表达载体,纯化的CREG融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体。以人胸廓内动脉平滑肌细胞(human internal thoracic artery smooth muscle cells,HITASY)为模型,[^3H]标记脱氧胸苷掺入法测定去血清培养HITASY细胞DNA合成变化。以Western印迹观察HITASY细胞在去血清培养过程中SM α-肌动蛋白、肌钙结合蛋白(calponin)的表达,RT-PCR和Western印迹分析去血清培养诱导CREG mRNA和蛋白表达变化;免疫组化法观察CREG在细胞内的表达及定位。结果 构建载体并成功得到抗CREG多克隆抗体。去血清培养可使HITASY细胞DNA合成明显降低。随去血清培养时间延长,除SM α-肌动蛋白和肌钙结合蛋白表达逐渐上调之外,CREG mRNA转录活性和蛋白翻译合成亦上调。免疫组化显示去血清培养后,CREG蛋白在细胞内表达并主要位于细胞核周。结论 去血清能促使HITASY细胞由合成表型向收缩表型转换,同时伴CREG mRNA和蛋白表达上调。     

成年鼠骨髓间质细胞在体外培养中分化为平滑肌细胞

目的　探讨小鼠骨髓间质细胞在体外经条件培养基诱导定向分化成平滑肌细胞的可行性 ,为研究血管损伤后新生内膜形成机制奠定基础。方法　采用骨髓干细胞培养基和贴壁法从骨髓中分离骨髓间质细胞 ,通过补加人血管平滑肌条件培养基诱导骨髓间质细胞分化成平滑肌细胞 ,采用形态学和免疫荧光染色分析分化后的细胞特异性标志物 ,并测定 1μmol/L血管紧张素Ⅱ对细胞胞液钙离子浓度及细胞收缩功能的影响 ,通过加入氯沙坦抑制血管紧张素Ⅱ受体验证血管紧张素Ⅱ特异性激活钙通道引发的细胞收缩。结果　骨髓间质细胞经诱导在体外可传代生长 ,稳定传代 6代后 ,分化的细胞形态呈梭形平滑肌样 ,融合后形成峰谷状排列。表达平滑肌特异性蛋白标志物α 肌动蛋白、肌钙结合蛋白和平滑肌肌球蛋白。分化后的细胞经血管紧张素Ⅱ刺激产生瞬间胞液钙离子转移并偶联细胞收缩反应 ,细胞 [Ca2 + ]i呈现瞬间增高变化 ,[Ca2 + ]i为 2 131nmol/L± 14 0nmol/L ,经用氯沙坦后 [Ca2 + ]i被阻断 ,为 4 0 2nmol/L± 31nmol/L。结论　骨髓间质细胞经体外诱导可分化为有收缩功能的平滑肌细胞 ,可用于平滑肌细胞分化和血管损伤后新生内膜形成起源等研究。     

端粒酶活性对T2DM大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察2型糖尿病（T2DM）大鼠血管平滑肌细胞端粒酶活性及其对血管平滑肌细胞增殖的影响。方法应用高脂、高糖饮食以及腹腔注射小剂量链脲佐菌素的方法建立2型糖尿病大鼠模型,喂养1个月后检测大鼠血糖、血脂和血清胰岛素变化,收集胸主动脉平滑肌细胞,采用TRAP—ELISA法测量血管平滑肌细胞端粒酶活性,MTT法测定平滑肌细胞增殖程度。结果与对照组相比,2型糖尿病大鼠血糖、血脂和血清胰岛素均明显增高,血管平滑肌细胞端粒酶活性和平滑肌细胞增殖也增高（P〈0．05）,相关分析显示两者之间存在正相关关系（r=0．959,P〈0．01）。结论2型糖尿病大鼠血管平滑肌细胞端粒酶的活性明显增高,并与血管平滑肌细胞的增殖程度呈正相关,因此,端粒酶抑制剂有可能成为治疗2型糖尿病血管并发症的新途径。     

转录因子Ets差异基因5在血管平滑肌细胞表型转化中的作用

目的 探讨转录因子Ets差异基因5(ETV5)在血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中的作用.方法 分别采用ETV5过表达腺病毒载体(Ad-ETV5组)和绿色荧光蛋白(GFP)过表达腺病毒载体(Ad-GFP组)转染VSMC.人ETV5特异性小干扰RNA[血小板源性生长因子(PDGF)-BB+ siRNAETV5组]及其随机阴性序列(PDGF-BB+siRNAdacfsdmbk组)分别转染VSMC后采用PDGF-BB诱导VSMC表型转化.分别采用实时定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法检测各组细胞中VSMC表型标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和肌球蛋白重链11 (MYH11) mRNA和蛋白的表达水平.分别采用平板划痕实验和CCK-8试剂盒检测各组VSMC的迁移和增殖活性.结果 与Ad-GFP组相比,Ad-ETV5组VSMC中α-SM和MYH11 mRNA和蛋白的表达均降低(P＜0.05),迁移和增殖活性均升高(P＜0.05).与PDGF-BB+ siRNAdscvmble组相比,PDGF-BB+ siRNAETv5组VSMC中α-SMA和MYH11 mRNA和蛋白的表达均升高(P＜0.05),而迁移和增殖活性降低(P＜0.05).结论 ETV5参与了VSMC的表型转化.     

RhoA/ROCK信号系统对血管外膜炎症介导的大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖和表型变化的影响

 目的 探讨RhoA/ROCK信号系统在血管外膜炎症介导的大鼠颈动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖和表型变化中的作用机制。 方法 将20只Wistar大鼠按随机数字表法均分为模型组（用硅胶管包裹大鼠颈动脉1周,造成血管外膜的慢性炎性损伤）和对照组,取材后HE染色,分别观察2组血管形态学变化,采用RT-PCR和Western blot检测血管组织中SM α-actin 与ROCK2的表达。 结果 与对照组相比,模型组颈动脉血管外膜增厚,炎性细胞浸润,中膜平滑肌细胞增生,排列紊乱,VSMC中SM α-actin mRNA水平和蛋白表达水平均增高,ROCK2 mRNA水平与对照组相比无显著差异,蛋白表达水平均明显增高。 结论 RhoA/ROCK信号系统可能参与血管外膜炎症介导的大鼠颈动脉VSMC增殖和表型变化的调控。