斑马鱼胚胎发育毒性评价方法的建立

目的以致胚胎毒性阳性药物全反式维甲酸（ATRA）及丙戊酸钠进行斑马鱼胚胎发育毒性试验,建立有效的斑马鱼胚胎发育毒性评价方法。方法采用水浴染毒法,将受精后2h（2hpf）的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度梯度的阳性约物。分别在24、48、72和144hpf观察并记录畸形及死亡的胚胎数目。统计阳性药物的EC50和LG50,计算致畸指数（TI=LC50／EG50）。结果两种阳性药物所致斑马鱼胚胎发育早期（24～48hpf）与发育后期（72～144hpf）的畸形表现不同。在72hpf,两种阳性药物对胚胎孵化率均有明显抑制作甩144hpf可见ATRA（≥1．6×10^-3mg／L）和丙戊酸钠（≥1．25×10^2mg／L）严晕致畸作用,T1分别为10.35和5．72。两种阳性药物胚胎敛畸率及死亡率均呈明显的浓度依赖关系,且与已有动物试验及体外试验结果相符。结论以两种阳性药物建立有效的斑马鱼胚胎发育毒性评价方法,可进行进一步的验证。     

药物神经毒性的评价模型及应用

药物神经毒性是指由药物引起的对神经系统功能和/或结构的损害。神经毒性是药物不良反应之一,也是药物临床前安全性评价的重要方面。一般来说,研究和评价神经毒性的模型主要指体外模型和体内模型。体外模型包括二维单细胞培养（神经细胞系、原代神经细胞和神经干细胞）,三维多细胞培养（再聚集脑细胞）,以及器官型培养（类器官、器官芯片）等。体内模型包括传统的哺乳动物模型和非哺乳动物模型。非哺乳动物模型由于其结构简单、操作方便也逐渐被广泛地用于神经毒性评价,主要包括线虫、斑马鱼、果蝇等。仅靠单一体内模型或体外模型无法完整全面地评价药物神经毒性,因此对于不同的药物,需要选择合适的方法及模型组合进行综合评价,才能得出准确可靠的结论。     

利用诱导多能干细胞构建流产毒性药物的体外筛查模型

妊娠期用药不可避免,如何帮助孕妇合理用药以减少自发流产、早产和低体重儿的发生,对于医务工作者至关重要.本研究建立了药物流产毒性的检测模型,可筛除疑似流产的药物,避免用药不当导致的孕妇流产.通过三维悬浮培养诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的方式,诱导其形成拟胚体(...     

丙戊酸钠与双丙戊酸钠的毒性比较

目的 比较丙戊酸钠与双丙戊酸钠2种供试品毒性的大小.方法 采用大鼠和小鼠2种动物,分别灌胃给予不同剂量的丙戊酸钠和双丙戊酸钠,观察大鼠和小鼠的毒性反应症状、死亡情况、病理变化,并计算出供试品对2种动物的LD50值.结果 2种供试品对大鼠和小鼠的毒性反应症状及病理变化基本一致,但是在剂量相当的情况下丙戊酸钠的毒性反应症状比双丙戊酸钠的严重,死亡的动物数更多,LD50值更小.结论 丙戊酸钠的毒性比双丙戊酸钠的毒性大.     

四溴双酚A对斑马鱼胚胎发育毒性和神经毒性研究

目的 研究四溴双酚A (Tetrabromobisphenol A,TBBPA)对斑马鱼胚胎的发育毒性和神经毒性.方法 采用斑马鱼胚胎模型,利用胚胎暴露实验分析剂量效应和畸形表观等发育毒性指标;利用胚胎自主运动、接触反应和仔鱼游泳运动,分析神经毒性指标.结果 TBBPA对斑马鱼胚胎的发育具有中度毒性,在受精后48 h(Hours Post Fertilization,hpf)的半数致死量(Concentration that led t0 50％ mortality,LC50)和半数致畸量(Concentration that led t0 50％ malformations,EC50)分别是7.9和4.7 μmol·L-1,以及在120 hpf的LC50和EC50分别是5.3和1.9 μmol·L-1.发育毒性效应具体表现为(1)在48,60,72,96 hpf均表现为低浓度促进孵化,高浓度抑制孵化;(2)引起胚胎发生尾部弯曲、未吸收卵黄囊、心包囊肿、卵黄囊水肿、游囊关闭等畸形现象;(3)胚胎畸形率和死亡率均具有剂量依赖效应,即与暴露浓度成正比.TBBPA对斑马鱼的神经毒性表现为(1)增加胚胎在19～26 hpf的自主运动频率;(2)降低胚胎在27,36,48 hpf时的接触反应能力;(3)降低胚胎在120 hpf的行为运动速度.结论TBBPA对斑马鱼胚胎具有发育毒性和神经行为毒性.     

丙戊酸钠的肝脏毒性及防治

本文介绍了丙戊酸钠肝毒性的临床表现为肝酶增加、血氨升高、抑制凝血、低血糖和酸中毒、微囊状脂肪变性及抑制β氧化;并对其提出了预防和治疗措施.     

药物神经毒性评价体外模型的研究进展

神经毒性是药物安全性评价的重要方面。体外模型相比较体内动物实验在药物高通量筛选、分子机制研究、检测分析技术应用上具有显著优势。至今,研究和评价药物神经毒性的体外模型主要包括原代神经细胞培养、神经细胞系培养、诱导神经干细胞分化模型,三维细胞培养模型等。这些体外模型的复杂程度、对药物的敏感性及检测方法不尽相同。概述各种神经毒性体外模型的应用领域及研究进展,提出了神经毒性体外评价模型研究应用中存在的问题及今后的发展方向。     

斑马鱼胚胎评价5种药物的发育毒性与模型验证

目的用斑马鱼胚胎探究环磷酰胺、乙酰水杨酸、盐酸四环素、乙酸地塞米松、阿扎胞苷5种已知对人类胚胎致畸药物的毒性和安全性。方法挑选4 hpf发育正常的受精卵,采用水浴染毒法,将药物添加到人工海水中,每种药物分别设置5个浓度组,另设空白对照组和溶剂对照组,观察给药120 hpf后斑马鱼的死亡情况,统计各实验组斑马鱼胚胎的死亡数、畸形数,并求出120 hpf时斑马鱼胚胎的死亡率、畸形率、半数致死浓度(LC50)、半数致畸浓度(EC50)、致畸指数(TI)。并利用公式:TI=LC50/EC50计算出阳性药物的致畸指数。根据已经测得的LC50,求出各药物的最大非致死浓度(MNLC),分别设置1/10 MNLC、1/3 MNLC,MNLC和LC104个浓度,以沙利度胺为阳性对照,维生素C为阴性对照,人工海水为空白对照,0.5%DMSO为溶剂对照,28.5℃下作用至120 h,每天观察胚胎的发育情况,统计胚胎死亡及畸形状态。结果 5种药物的LC50从大到小依次为:环磷酰胺>阿扎胞苷>盐酸四环素>乙酰水杨酸>乙酸地塞米松。EC50从大到小依次为:环磷酰胺>盐酸四环素>阿扎胞苷>乙酰水杨酸>乙酸地塞米松。环磷酰胺、乙酰水杨酸、盐酸四环素、乙酸地塞米松、阿扎胞苷TI值分别为1.92,1.11,1.05,1.44,2.99。结论斑马鱼胚胎模型可用于初步评价药物的发育毒性和安全性。     

药物非临床发育神经毒性研究的神经病理学评价策略

神经病理学评价是药物非临床发育神经毒性评价的重要组成部分和金标准,本文从发育神经毒性神经病理学评价的实验动物设计、优选的动物年龄、神经系统解剖和组织处理、以及病理结果的解释方面概述了标准化的发育神经毒性神经病理学评价原则和方法。介绍了药物非临床发育神经毒性研究神经病理学评价相关国际指导原则要求,为减少我国和其它国家及地区间实验程序的差异,为我国从事药物非临床发育神经毒性研究的病理学家提供一定参考。     

SD大鼠神经干细胞评价药物神经毒性模型研究

目的：应用SD大鼠神经干细胞评价药物的神经毒性,为新药早期筛选和临床前安全性评价提供体外替代方法。方法：体外培养SD大鼠神经干细胞,传代后得到稳定的第二代神经球。以已知具有神经毒性的长春新碱、顺铂、瑞芬太尼、丙泊酚注射液、丙戊酸钠、苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇、氧化铁纳米粒子作为神经毒性阳性物质,以培养基作为神经毒性空白对照品;以没有神经毒性且具有促进神经细胞生长的神经生长因子作为检测模型的敏感性;以验证SD大鼠神经干细胞模型对神经毒性药物的检出能力。结果：长春新碱、顺铂、丙泊酚注射液、苯妥英钠、丙烯酰胺、氧化铁纳米粒子可引起全部或部分神经球解离破碎,神经干细胞坏死。顺铂、丙戊酸钠和苯妥英钠可见显著性的抑制神经球聚集。长春新碱、顺铂、瑞芬太尼、氧化铁纳米粒子、丙泊酚注射液、丙戊酸钠、苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇均表现剂量相关性的神经干细胞增殖毒性作用。神经生长因子可见促进神经球聚集及神经干细胞增殖。结论：本文以SD大鼠神经干细胞模型,以神经干细胞体外生长发育指标,验证了已知神经毒性抗肿瘤药物、麻醉剂、抗癫痫药物等的神经毒性特征。评价结果与这些药物已知的神经毒性作用特点一致,该评价方法可作为药物神经毒性临床前安全性评价研究的体外替代试验。     

大鼠原代培养肝细胞作为早期肝毒性筛选模型的研究

目的研究大鼠原代培养肝细胞作为早期肝毒性的筛选模型的生物学特征。方法采用二步灌流法分离提取大鼠肝细胞进行培养;采用荧光倒置显微镜观察原代培养肝细胞的生长情况;采用MTT法绘制肝细胞生长曲线;采用全自动生化分析仪检测细胞上清液的ALT、AST、ALP、CK、LDH、TP、ALB、GGT值;采用爬片技术进行HE检查;采用Elisa法检测细胞上清液中细胞色素P450(CYP450)的总量,并采用肝细胞毒性药物对乙酰氨基酚对肝细胞作为早期肝毒性筛选模型进行验证。结果肝细胞培养4 h后开始贴壁,24 h后绝大多数肝细胞贴壁,体积明显增大;48 h后肝细胞贴壁牢固,维持至第8日,细胞开始逐渐脱落。肝细胞的对数生长期为第2至第3日,ALT、AST、LDH、CK在提取4 h后增高,第1日大幅降低后趋于平稳至第7日。TP、ALB、GGT、ALP提取4 h降低,后趋于平稳至第7日,肝细胞CYP450第1日至第5日分泌呈上升趋势,第6⁷日,轻微下降。HE结果显示提取的肝细胞与肝组织的HE涂片基本一致。对乙酰氨基酚对肝细胞的生长具有抑制作用,IC50为20.5 mmol·L-1,能使肝细胞肿胀,细胞核萎缩,使肝细胞分泌ALT、ALP、LDH增多,对肝细胞分泌CYP450的功能具有抑制作用。结论系统全面的阐述肝细胞的生物学特征及在早期毒性评价中的应用,肝细胞作为肝早期毒性筛选模型敏感的评价指标,对于原代培养肝细胞用于药物的早期毒性筛选研究起到了一个示范作用。     

原发性高血压合理用药类别筛选模型的建立和检验

目的：建立原发性高血压合理用药类别筛选模型并检验其在实践中的应用。方法：抽取大连医科大学附属第二医院2017年3月至2018年12月心内科门诊和住院的原发性高血压患者的医嘱记录,共计4 597条,再从以上记录中筛选出满足纳入标准的549条记录。医嘱记录均为高血压治疗达标患者,且为单药治疗,患者信息完整。判别分析模型建立过程中,分组变量的选择是根据管理学80/20法则找出占比例80%以上的药物分类,自变量的选择是采用单变量分析的方法筛选。用549条记录中的384条（70%）建立模型,求解判别函数,剩余165条（30%）用于训练模型,以验证模型的预测效果。结果：分析得出,纳入病例中血管紧张素类、β受体阻滞剂类、钙拮抗类三类药品的应用合占所有用药类别的94%,将它们作为判别分析的分组变量,然后从10个自变量中采用单变量分析方法筛选出对用药分类筛选具有显著统计学意义的自变量,结果年龄、就诊时情况、既往用药和主要合并疾病被选为自变量（P<0.05）,用于建模,模型拟合良好,可以进行原发性高血压合理用药类别筛选。通过验证,该模型的准确率在50%左右。结论：原发性高血压合理用药类别筛选模型可提高原发性高血压治疗中的合理用药水平。     

Meta-analysis of toxicity and teratogenicity of 133 chemicals from zebrafish developmental toxicity studies

Zebrafish developmental toxicity testing is an emerging field, which faces considerable challenges regarding data meta-analysis and the establishment of standardized test protocols. Here, we present an initial correlation study on toxicity of 133 chemicals based on data in the literature to ascertain predictive developmental toxicity endpoints. We found that the physical properties of chemicals (BCF or log P) did not fully predict lethality or developmental outcomes. Instead, individual outcomes such as pericardial edema and yolk sac edema were more reliable indicators of developmental toxicity. In addition, we ranked the chemicals based on toxicity with the Toxicological Priority Index (ToxPi) program and via a teratogenic ratio, and found that perfluorooctane sulfonate (PFOS) had the highest ToxPi score, triphenyltin acetate had the highest average ToxPi score (corrected for missing data and having more than 4 outcomes), and N-methyl-dithiocarbamate had the highest teratogenic ratio.     

Developmental toxicity of auranofin in zebrafish embryos

Auranofin (AF) is used in clinic for the treatment of rheumatoid arthritis, repurposing of AF as an anticancer drug has just finished a phase I/II clinical trial, but the developmental toxicity of AF remains obscure. This study focused on its developmental toxicity by using zebrafish embryos. Zebrafish embryos were exposed to different concentrations (1, 2.5, 5, 10 μm ) of AF from 2 h post‐fertilization (hpf) to 72 hpf. At 72 hpf, two major developmental defects caused by AF were found, namely severe pericardial edema and hypopigmentation, when embryos were exposed to concentrations higher than 2.5 μm . Biochemical detection of oxidative stress enzyme combined with expressions of a series of genes related to oxidative stress, cardiac, metal stress and pigment formation were subsequently tested. The superoxide dismutase activity was decreased while malondialdehyde content was accumulated by AF treatment. The expression of oxidative stress‐related genes (sod1 , gpx1a , gst ), pigment‐related genes (mitfb , trp‐1a ) and one metal stress‐related gene ctr1 were all decreased by AF exposure. The expressions of cardiac‐related genes (amhc , vmhc ) and one metal‐related gene hsp70 were found to be significantly upregulated by AF exposure. These findings indicated the potential developmental toxicity of AF on zebrafish early development. Copyright © 2016 John Wiley & Sons, Ltd.     

L-鸟氨酸脱羧酶抑制剂筛选模型的建立

目的：基于酶促反应法,利用HPLC测定腐胺含量,评价待筛选药物对PC-3M细胞中L-鸟氨酸脱羧酶（ L-ODC）活性的影响,建立鸟氨酸脱羧酶抑制剂的筛选模型。方法将与药物反应后的细胞处理样本,以TSKge lODS-80TM凝胶色谱柱（150 mm ×4．6 mm,5μm）为分析柱,在甲醇-水（8∶2）保持3 min,从4 min到14 min,甲醇比率由80％梯度增至100％梯度洗脱,流速为0．8 ml/min,激发波长为340 nm,发射波长为515 nm,柱温为50℃,进样量10μl。按内标法定量。结果 ODC特异性抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO）对ODC活性的抑制率为（59．3±5．4）％,雷帕霉素对ODC活性的抑制率为（29．8±6．4）％,姜黄素对ODC活性的抑制率为（26．1±6．6）％。结论本模型通过测定药物对ODC细胞内鸟氨酸脱羧酶的作用,利用HPLC分离法测定在药物抑制影响下的鸟氨酸脱羧酶的活性,这一模型有望成为筛选ODC抑制剂的快速方便准确的检测方法。     

Generation of human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity screening

Because drug-induced liver injury is one of the main reasons for drug development failures, it is important to perform drug toxicity screening in the early phase of pharmaceutical development. Currently, primary human hepatocytes are most widely used for the prediction of drug-induced liver injury. However, the sources of primary human hepatocytes are limited, making it difficult to supply the abundant quantities required for large-scale drug toxicity screening. Therefore, there is an urgent need for a novel unlimited, efficient, inexpensive, and predictive model which can be applied for large-scale drug toxicity screening. Human embryonic stem (ES) cells and induced pluripotent stem (iPS) cells are able to replicate indefinitely and differentiate into most of the body's cell types, including hepatocytes. It is expected that hepatocyte-like cells generated from human ES/iPS cells (human ES/iPS-HLCs) will be a useful tool for drug toxicity screening. To apply human ES/iPS-HLCs to various applications including drug toxicity screening, homogenous and functional HLCs must be differentiated from human ES/iPS cells. In this review, we will introduce the current status of hepatocyte differentiation technology from human ES/iPS cells and a novel method to predict drug-induced liver injury using human ES/iPS-HLCs.     

高内涵筛选技术联合多能性基因Oct4、Sox2和Nanog检测建立药物胚胎毒性快速筛查方法

目的 通过高内涵筛选技术评价测试药对PA-1细胞的增殖毒性,并联合分化毒性的评价指标——多能性基因（Oct4、Sox2和Nanog）表达检测,初步建立药物胚胎毒性快速筛查方法。方法 选择维生素C、青霉素G、维生素E作为无胚胎毒性的阴性测试药,甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺作为具有胚胎毒性的阳性测试药。以测试药临床治疗剂量下的最大血药浓度（C_max）为基础设置加药浓度,阴性测试药设置浓度梯度为：1/2C_max、C_max、2C_max、3C_max、4C_max;阳性测试药设置浓度梯度为：1/8C_max、1/4C_max、1/2C_max、C_max、2C_max。测试药物在维持培养液（培养液加入1×10⁶ U·L^-1的白血病抑制因子）中作用于PA-1细胞24 h后,基于高内涵筛选技术,应用DAPI、Calcein-AM、PI共染PA-1细胞,通过共聚焦成像检测荧光强度,计算细胞存活率;测试药物在分化培养液（不加入白血病抑制因子）中作用于PA-1细胞24 h后,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达变化。结果 DAPI、Calcein-AM、PI 3者共染可以很好地区分活细胞及死细胞;阴性测试药维生素C、维生素E、青霉素G对PA-1细胞的增殖能力均无影响;与对照组比较,阳性测试药5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤1/4C_max及以上浓度引起PA-1细胞存活率显著下降（P＜0.05）;环磷酰胺1/8C_max及以上浓度引起PA-1细胞存活率显著下降（P＜0.05）。阴性测试药维生素C、维生素E、青霉素G对PA-1细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog的表达均无影响。与对照组比较,阳性测试药5-氟尿嘧啶1/8C_max及以上浓度使PA-1细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog的表达显著下降（P＜0.05）;甲氨蝶呤1/8C_max及以上浓度使Oct4、Nanog的表达显著增加（P＜0.05）,但当浓度达到2C_max时对Sox2的表达依然没有影响;环磷酰胺1/8C_max及以上浓度使Sox2、Oct4、Nanog的表达均显著增加（P＜0.05）。结论 高内涵筛选技术（DAPI、Calcein-AM、PI共染）联合多能性基因的检测可初步建立药物胚胎毒性快速筛查方法。