重组人肝细胞生长因子真核表达载体的构建

目的构建重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的真核表达载体,为后续毕赤酵母蛋白高效表达提供基础。方法根据酵母表达偏爱密码子合成rhHGFcDNA全长序列,将rhHGF和pGAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体pGAPZαA-rhHGF,并鉴定。结果重组真核表达载体pGAPZA-rhHGF经限制性内切酶分析,与理论值相符,测序结果未见碱基变异。结论成功构建了pGAPZαA-rhHGF真核表达载体,为后续毕赤酵母高效表达rhHGF蛋白提供了可行性。     

毕赤酵母表达重组人干扰素α2a发酵诱导时机的研究

目的 对研究毕赤酵母表达重组人干扰素α2a发酵诱导时机.方法 在相同培养条件下,在OD600分别为150、250、300的菌体密度下进行诱导.结果与结论 在OD600为250左右时为诱导的最佳时机,诱导48h时菌体生物量(OD600)达395、重组人干扰素α2a蛋白表达达700～900mg·L-1.其结果为毕赤酵母表达重组人干扰素α2a的工业化生产奠定了良好的基础.     

毕赤酵母N-糖基化改造的研究进展

毕赤酵母表达系统具有诸多优点,广泛用于生产重组蛋白.由于其糖基化途径与人不同,表达的糖蛋白为高甘露糖型,改变了糖蛋白的结构,影响其特性和功能,且具有免疫原性,限制了以毕赤酵母为表达系统大量生产重组蛋白的应用.在过去的20多年里,很多研究集中在毕赤酵母N-糖基化人源化改造研究上,希望产生类人的糖链结构,但进展缓慢.近期,毕赤酵母N-糖基化改造研究已经取得了重大进展,产生了类人的末端为唾液酸的糖链结构,为应用毕赤酵母表达系统大量生产重组蛋白铺平了道路.现对毕赤酵母N-糖基化的研究进展进行简述.     

人内皮抑素在毕赤酵母中的组成型表达及其活性检测

为获得大量具有生物学活性的重组人内皮抑素(Endostatin),在毕赤酵母中进行组成型表达的研究。将由毕赤酵母偏爱密码子组成的Endostatin cDNA插入组成型载体pGAPZαA中,构建表达载体pGAPZαA-ENDO,并转化到毕赤酵母X-33中。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下,进行组成型表达Endostatin蛋白。重组人Endostatin产量达到102mg/L。Western blot显示:表达蛋白能与兔抗Endostatin的多克隆抗体特异性结合。纯化后的重组Endostatin具有抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞增殖的活性。利用毕赤酵母组成型表达系统能获得大量具有生物活性的Endostatin蛋白。     

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。     

重组人源白介素-1β发酵条件的优化及其产品的纯化

目的初步建立重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的培养体系;进一步优化大规模培养重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的条件;探讨大规模纯化重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母表达产物的条件;鉴定酵母表达产物及纯化样品。方法在菌体湿重达190g.L-1左右时开始甲醇诱导表达;选用了SP Sepharose XL阳离子交换层析和反相疏水柱层析进行纯化。结果在pH4.5的含0.5%蛋白胨的FM21培养基中发酵时,放罐时间在30h较为适宜;经过纯化蛋白纯度即可达95%以上。结论最终经过鉴定,表达和纯化的样品就是我们想要得到的IL-1β。     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

人组织因子的密码子优化及其在毕赤酵母中的高水平发酵制备

优化人组织因子编码序列利用毕赤酵母表达系统高水平发酵制备重组人组织因子。将人组织因子胞外活性区(hTF219)编码序列进行密码子偏爱性、GC含量及富AT区的优化,优化序列电转入毕赤酵母表达系统;利用博莱霉素(Zeocin)梯度抗性平板筛选出高表达转化子;在1L发酵罐中采用混合碳源连续补料方式发酵制备重组蛋白。替换hTF219编码cDNA的165个碱基,获得的优化序列与原始序列的相似性为75%;在Zeocin浓度为500μg/mL的YPD平板上筛选得到高表达转化子tfPP-502,该重组菌株以组成型方式分泌表达重组人组织因子,在1L发酵罐中发酵110 h胞外总蛋白含量为6.27 g/L,目的蛋白占比约80%。在毕赤酵母表达系统中实现了重组人组织因子的高水平发酵制备获得的重组菌株可用于重组人组织因子的大规模发酵制备。     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人C-型利尿钠肽(CNP)-人血清白蛋白(HSA)融合蛋白质的毕赤酵母。方法重叠PCR拼接CNP(400 bp)-HSA(1 800 bp)成融合基因,双酶切后克隆至表达载体pPIC9K中。电穿孔法转染毕赤酵母菌KM71,摇瓶培养分泌表达。结果融合基因约为2 200 bp,序列测定正确。SDS-PAGE分析相对分子质量约为80 000,Western blot和RIA鉴定显示其为CNP与HSA的杂合分子。结论实现了HSA-CNP融合蛋白质在毕赤酵母中的分泌表达。     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体。方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITF cDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF。结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段。结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF。并制备其抗体的进一步研究提供基础。     

人胰岛素B27K-DTrI前体在毕赤酵母中发酵条件的优化

B27K-DTrI(B27位突变为赖氨酸的去三肽胰岛素)具有单体性质好,生物活性高等特点,是潜在的速效人胰岛素药物。在前期实验中,筛选到了一株高拷贝、高表达B27K-DTrI前体的S菌株。为提高人胰岛素B27K-DTrI前体在重组毕赤酵母S菌中的表达量,优化了S菌5 L发酵条件(温度、pH)。结果显示:pH 5.0,温度25℃,诱导108 h后,人胰岛素B27K-DTrI前体蛋白的表达量最高,可达114 mg/L。     

蝎毒镇痛活性肽基因BmK AngM1的密码子优化及其真核表达分析

密码子的偏爱性是影响基因异源表达的重要因素,通过对外源基因的密码子序列进行优化可提高其表达水平。为了获得蝎毒镇痛活性肽基因BmK AngM1在毕赤酵母中的高效表达,根据毕赤酵母密码子偏爱性,将BmK AngM1基因中的毕赤酵母低利用率密码子突变为其高利用率简并密码子,克隆到表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母,甲醇诱导表达;重组蛋白表达量测定结果显示,优化后的BmK AngM1基因在毕赤酵母中的表达水平是优化前的3.7倍。研究结果表明,密码子优化能显著提高BmK AngM1基因在毕赤酵母中的表达水平。     

人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA hbsp能高效地表达rhBSP并分泌到胞外     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度发酵及分离纯化

目的研究重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白(Tα1-HSA)基因工程菌在30 L发酵罐中高密度发酵表达Tα1-HSA融合蛋白的发酵工艺及产物的分离纯化方法。方法采用两步发酵法进行重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌的高密度发酵。发酵液经超滤浓缩,阴离子交换色谱,亲和色谱,凝胶过滤色谱等步骤进行分离纯化。结果发酵结束后,菌体细胞湿重达到350 g/L,发酵液中蛋白产量达到2.0 g/L。发酵液经分离纯化后获得了纯度较高的重组Tα1-HSA融合蛋白,HPLC分析纯度达97.5%。结论重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌高密度发酵的成功及分离纯化方法的建立为Tα1-HSA的进一步研究和开发奠定了基础。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

重组人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1在毕赤酵母中表达条件的优化

采用单因子和正交试验对毕赤酵母重组菌株产生人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(rhLOX-1)的发酵过程进行了优化,确定了最佳发酵条件:0.8%甲醇,1.8%酪蛋白水解物,初始pH 7.0,3×接种量。在此培养条件下,rhLOX-1在毕赤酵母重组菌株中的表达量可超过100 mg/L,比对照提高了1倍以上。本研究为大规模发酵制备rhLOX-1蛋白奠定了基础,更好地满足了LOX-1的理论研究及新药筛选的需要。     

N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。