人碱性成纤维细胞生长因子(hu-bFGF)在毕赤酵母中的分泌表达

通过PCR技术从pMD18-T/hu-bFGF质粒中扩增出hu-bFGF基因,并将其克隆到pGEM-T Easy克隆载体中。经测序鉴定后,目的基因通过XhoI和XbaI酶切后,以正确的阅读框插入到pGAPZ-αA的编码-αfactor信号肽序列的下游,构建成pGAPZ-αA/hu-bFGF重组分泌表达载体。表达载体用BlnI线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,转化子经Zeocin抗性筛选、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE复筛获得分泌表达hu-bFGF的工程菌。Western Blot结果表明:重组蛋白能够与兔抗人bFGF抗体发生特异性反应,具有良好的抗原性。对工程菌培养条件的优化表明:以麦芽糖为碳源、培养基起始pH值为6.5、培养96 h时重组蛋白的表达水平最高。     

人胰岛素样生长因子I在毕赤氏酵母中的表达研究

利用PCR定点突变技术对人胰岛素生长因子（huIGF-I)基因进行改造，克隆到pGEMT载体测序。并构建酵母表达载体pGαAIGF－I，转化毕赤氏酵母GS115。摇瓶发酵4d后，检测表达水平占可溶性总蛋白的15％以上，且表现出较好细胞增殖活性。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

重组人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达的研究

目的构建含有人组织因子(h TF)基因的毕赤酵母高效表达系统,实现胞外高效分泌表达。方法全基因合成h TF胞外区序列,PCR扩增该基因片段,经Xho I和Xba I双酶切后,和表达载体p GAPZa A相连,并电转化毕赤酵母SMD1168H。在YPD培养基中进行表达,取培养基上清进行SDS-PAGE检测,并利用Western进行确证,通过BCA法检测胞外蛋白表达量。结果在毕赤酵母中成功表达人组织因子,通过Western确证目的蛋白分子量大小正确,BCA法检测摇瓶表达胞外总蛋白达1 g/L,Bandscan软件分析目的蛋白占胞外总蛋白80%以上。结论本研究实现了截短型人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达,获得了具有与完整因子相同凝血活性的截短型组织因子。     

乳糖诱导人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的表达

目的以含有人源性胰岛素样生长因子-1（hIGF-1）基因的大肠杆菌DH5a为研究对象,研究以乳糖作为诱导剂时目的融合蛋白的表达规律。方法利用可表达hIGF-1的工程菌,研究乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌在不同条件下表达目的蛋白的一般规律．并优化表达条件,表达结果借助SDS-PAGE等方法进行分析。结果乳糖可诱导hIGF-1在大肠杆菌中的表达．最优表达条件为37℃下重组菌株生长至OD600值为0．7时加入诱导浓度为0．8％的乳糖继续诱导4h。诱导的目的融合蛋白相对表达量能够达到占总蛋白的40-60％水平,接近IPTG的诱导表达水平。结论乳糖能够代替IPTG作为诱导剂成功诱导hIGF-1在大肠杆菌中的表达。     

人内皮抑素在毕赤酵母中的组成型表达及其活性检测

为获得大量具有生物学活性的重组人内皮抑素(Endostatin),在毕赤酵母中进行组成型表达的研究。将由毕赤酵母偏爱密码子组成的Endostatin cDNA插入组成型载体pGAPZαA中,构建表达载体pGAPZαA-ENDO,并转化到毕赤酵母X-33中。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下,进行组成型表达Endostatin蛋白。重组人Endostatin产量达到102mg/L。Western blot显示:表达蛋白能与兔抗Endostatin的多克隆抗体特异性结合。纯化后的重组Endostatin具有抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞增殖的活性。利用毕赤酵母组成型表达系统能获得大量具有生物活性的Endostatin蛋白。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及在真核细胞的表达

目的 构建人胰岛素样生长因子—1(IGF1)真核表达载体,并在成纤维细胞NIH3T3细胞内进行表达。方法 用RT-PCR法从人肝细胞中克隆人IGF1的基因,将其连入真核表达载体pSec-Tag／FRT／V5一His,PCR法及测序鉴定阳性克隆;用脂质体法将阳性克隆转染NIH3T3细胞;收集转染后的细胞上清,用Western blot进行检测。结果 琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出315bp的条带;与载体连接后的克隆进行测序得到一个阳性克隆;Western blot检测显示转染后细胞上清出现与预计值相符的特异性条带。结论 成功克隆并构建人IGF1基因的真核表达载体,转染后NIH3T3细胞成功表达IGF1重组蛋白。     

影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素

巴斯德毕赤酶母表达系统是广泛使用的真核表达系统,但有些蛋白在该系统中表达量低,甚至不表达。本文从外源基因的内部结构、宿主菌、信号肽、转化子的拷贝数和发酵条件五个方面综述影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素。     

新型甘露聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

构建土壤基因组文库,通过功能筛选得到一水解底物魔芋粉的阳性克隆,测序后,序列分析表明:该基因全长为1 530 bp,包含一个糖基水解家族26结构域,编码510个氨基酸,相对分子质量为56 438。此基因推导的氨基酸序列与Cellulomonas fimi的Man26A和Cellvibrio japonicus的mannanase A氨基酸序列同源性分别为64.3%、38%。将此基因的成熟肽的编码序列克隆到表达载体pHBM905上,得到重组质粒pHBM730,将pHBM730经SalI酶切线性化后转化3株毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168,该甘露聚糖酶基因在这3种毕赤酵母中均实现分泌表达。将此3种重组毕赤酵母GS115(pHBM730)、KM71(pHBM730)、SMD1168(pHBM730)诱导产酶,对这3种重组酶进行相关的酶学性质研究。分析表明,在KM71中表达量最高,其最适反应pH值均约为6.6,最适反应温度均约为45℃。在最适反应条件下测得其酶活力为19.64 U。此结果为瓜尔豆胶降解产物的工业化应用提供了参考。     

戊型肝炎病毒结构区OFR2基因在毕赤酵母中的分泌型表达

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗，利用甲醇营养型酵母Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒（HEV）结构区ORF2 1．3kb基因。对构建的酵母分泌型表达载体pHIL-S1/HEV和pPIC9/HEV重组体，酶切线性化后转化入GS115酵母菌，经表型鉴定，PCR扩增筛选阳性克隆，对不同表型，不同表达载体的重组株用含甲醇的培养基诱导表达，ELISA及SDS－PAGE筛选表达活性菌株，Western-blot证实表达蛋白与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株并初步优化表达条件。     

人胰岛素样生长因子—1在大肠杆菌中的表达

为获得大量的人胰岛素样生长因子-1（human Insulin-like Growth Factor-1,hIGF-1)产品,构建了hIGF-1原核表达系统。设计引物,引入Nde I和Hind Ⅲ酶切位点,以人工合成构建的pUCIGF质粒为模板,CR扩增hIGF-1基因。酶切后,克隆于原核表达载体pRSET B中,构建pRSET-IGF重组质粒,转化入肠杆菌BL21（DE3）进行表达。带有重组质粒pRSET-IGF的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明：可表达出相对分子质量78000的蛋白,重组蛋白以非融合、可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白量的10%～20%,Western印记表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原活性。构建的pRSET-IGF重组质粒成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中高效可溶性表达,为获得大量基因工程产品奠定了基础。     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体。方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITF cDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF。结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段。结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF。并制备其抗体的进一步研究提供基础。     

胰岛素样生长因子-1及其受体在肺癌中的表达

目的研究胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及其受体在各种类型肺癌中的表达。方法应用免疫组化法对非小细胞肺癌和小细胞肺癌及其癌旁组织和正常肺组织进行IGF1及其受体的检测。结果IGF-1及IGF-1受体在鳞癌、腺癌、小细胞癌和癌旁肺组织中均有不同程度的表达。在伴有淋巴结转移的肺癌组织中的表达较强。结论IGF-1及其受体在不同类型肺癌中均有表达,可能在肺癌的发生发展中发挥一定的作用。     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性，作为真核表达系统，具有严格调控外源蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高，营养要求低等优点；在该表达系统中，主要有3种表达宿主菌，其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体，其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂；巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外，从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。     

人凝血因子IX在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的人凝血因子Ix（hFIX蛋白）在人类内源性凝血过程中起着非常重要的作用。hFIX表达量绝对或相对不足会导致B型血友病。本研究用毕赤酵母生产重组hFIX。方法首先用RT-PCR将人肝脏hFIX的mRNA进行扩增、测序并插入到pPIC9K中载体,构建pPIC9K—hFIX酵母分泌表达载体,再将pPIC9K—hFIX电转化进入毕赤酵母SMDl168,然后通过G418抗药性能力的大小筛选获得高拷贝且表达量高的重组菌株。结果通过SDS—PAGE和免疫印迹分析表明本研究获得的重组毕赤酵母hFIX表达量达到100mg／L;经过阴离子交换和半透膜扩散透析得到纯化的蛋白。检测重组hFIX的比活力,约为天然hFIX凝血活性的5．5％。结论我们可以优化找到更好的生产条件,使用其他比SMDll68更好的菌株,以获取更好生产量和质量;另外,我们也有很多可以增强在酵母生产的hFIX的活性。     

重组人白介素-18在毕赤酵母中的表达和纯化

构建了含重组人白介素-18(rhIL-18)基因的酵母表达载体pPIC9k-il18,利用电转化法将pPIC9k-il18线性化质粒转入毕赤酵母GS115中,筛选出高表达菌株.通过离子交换亲和层析和分子筛凝胶层析两步纯化,可获得rhuIL-18试剂品HPLC纯度>97%,纯化得率49mg·L-1发酵液.IL-18具有促进KG-1细胞产生IFN-γ的活性,并且产生的IFN-γ的量与IL-18的量成剂量依赖性,测定产生IFN-γ量与商业化的rHu-IL18标准品相当.本研究为进一步规模化制备rHu-IL18奠定了基础.     

鲑鱼降钙素前体多肽在毕赤酵母中的分泌表达

将鲑鱼降钙素前体多肽（sCTGly）基因克隆到表达载体pPIC9K上,然后转化毕赤酵母营养缺陷型菌株GS115,利用酿酒酵母分泌信号肽α-factor将目的产物分泌到发酵上清液中.经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,获得较高水平表达菌株GS115-sCTGly.酶联免疫反应检测上清液中酶的活性,表明sCTGly产量在10mg/L以上.通过5L发酵罐发酵条件优化,表达水平提高到200mg/L上.     

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的 构建含有人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）前体编码基因的重组载体,在E.coli BL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法 用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK 8／hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a（＋）／hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果 重组持粒pET29a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论 成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统 ,由于其有许多突出的优点 ,越来越受到分子生物学界的重视 ,已有多种重组蛋白在该系统成功表达。本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述 ,并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的表达

用ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ酶切，获得人碱性成纤维细胞生长因子基因，将该基因插入原核高效表达载体ＰＢＶ２２０的ＰＬＰＲ启动子下游，获得重组质粒ＰＢＶ－ＦＧＦ，转化大肠杆菌ＤＨ５α，４２℃诱导使重组子表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ、ＭＴＴ活性检测结果表明，该重组菌能够表达具有生物活性的ｈｂＦＧＦ。