自组装纳米短肽RADA16-Ⅰ水凝胶在肿瘤细胞三维培养中的应用

背景:已有研究表明培养在三维环境中的细胞,其基因表达模式和生物学活动更接近生命有机体.目的:拟采用自组装纳米短肽RADA16-Ⅰ水凝胶建立乳腺癌细胞MDA-MB-231的三维培养体系以揭示自组装纳米短肽在肿瘤细胞三维培养中的作用.设计,时间及地点:体外观察实验,于2006-09/2007-12在四川大学华西医院纳米生物医学技术与膜生物学研究所细胞学实验室完成.材料:RADA16-Ⅰ由美圈BD公司提供:人乳腺癌细胞株MDA-MB-231由中国科学院上海细胞生物学研究所提供.方法:利用圆二色谱仪、原子力显微镜、流变仪对三维培养基质RADA16-Ⅰ水凝胶进行材料表征.通过F-肌动蛋白及细胞核的荧光复染来揭示细胞在三维环境中的细胞形貌.利用钙黄绿素AM对活细胞进行荧光染色,观察细胞在三维基质中的存活力.主要观察指标:①RADA16-Ⅰ的二级结构,纳米纤维网络,凝胶流变性质.②MDA-MB-231在三维培养中的细胞表型,细胞活性.结果:①自组装短肽RADA16-Ⅰ形成了纳米纤维网络结构,纤维直径20～50 nm,具有类似体内细胞外基质的结构,形成基质凝胶后可模拟体内的细胞微环境,用于细胞的三维培养.②MDA-MB-231细胞在三维基质中生长呈现出纺锤状的细胞形貌,在基质中的生存状态均较好,细胞与材料具有较好的生物相容性.结论:自组装纳米短肽RADA16-Ⅰ有良好的结构与性能,能充分支持MDA-MB-231细胞的三维培养.     

含IKVAV肽自组装成凝胶的实验

目的:利用特定结构的多肽在生理条件下的自组装特性构筑功能性再生支架,对神经修复和再生具有重要意义,并可望突破其他支架材料的局限性。设计合成含IKVAV肽(C16H31O-AAAAGGGEIKVAV),并诱发其自组装过程。方法:实验于2005-01/2006-07在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。实验方法:①寡肽的合成:采用固相法合成肽。②寡肽自组装:取质量分数为0.01的寡肽溶液150μL,置于玻璃小瓶中,pH值调整为9.5,然后滴加等体积的磷酸盐缓冲液,震荡离心(2000r/min,离心10min)。实验评估:①高效液相色谱仪测肽纯度;色谱仪测肽的相对分子质量。②透射电镜下观察自组装凝胶超微结构。结果:①高效液相色谱仪示多肽纯度为95%,质谱仪示肽的相对分子质量为1351.6。②质量分数为0.01的肽溶液在磷酸盐缓冲液触发下数秒钟形成凝胶,透射电镜示自组装的凝胶为交织成网状的纤维结构,直径3～6nm,长度100～1500nm。结论:实验合成了含IKVAV肽,在磷酸盐缓冲液中可自组装成多孔凝胶结构。     

新型纳米自组装短肽KVDV-16作为生物支架材料的可行性

背景:设计合成和构建纳米生物材料如纳米自组装短肽是以一种"从下而上"的方式完成,其在生物医学工程方面潜在的应用价值引起了众多研究团队越来越广泛的兴趣.目的:初步探讨纳米自组装短肽KVDV16水凝胶在细胞三维培养方面的可行性.设计、时间和地点:体外观察实验,于2007-11/2008-11在四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所纳米生物实验室进行.材料:短肽KVDV16(纯度为95%,为了保护肽的两端,对其N端和C端分别进行乙酰化和酰胺化);人肝细胞系L-02和肝癌细胞系SMMC7721.方法:圆二色谱仪和傅里叶红外光谱检测短肽KVDV16水凝胶在不同理化条件下的二级结构;原子力显微镜检测其水凝胶形成的纳米级结构特征;扫描电子显微镜观察其形成的纳米三维支架.主要观察指标:β折叠二级结构,纳米纤维结构特征,细胞在肽支架材料中的生长、增殖情况.结果:短肽KVDV16形成的β折叠二级结构在高温下很稳定.在不同的pH(3,7,10)甚至变性剂1%十二烷基磺酸钠的作用下,β折叠二级结构也只发生轻微的变化.原子力显微镜证实其由纳米纤维结构组成.L-02和SMCC7721细胞进入了KVDV16支架材料,镶嵌在纳米纤维网中,并很好地在此三维环境中生长.结论:实验设计的短肽KVDV16是对自组装系统的一个补充,此短肽表现出来的性质使其能发展成为组织工程中细胞培养的三维支架材料.     

自组装多肽纳米纤维水凝胶在细胞三维培养中的应用及特征

背景：自组装多肽类材料因其独特的设计及良好的生物相容性和可降解性在众多三维支架材料中脱颖而出。目的：综述RADA类离子互补型自组装多肽支架材料的结构和功能化设计,从细胞三维培养方面探讨多肽类材料作为细胞载体材料在细胞治疗中的应用前景。方法：由作者通过PubMed、Web of science数据库及CNKI数据库检索有关自组装多肽水凝胶的相关文献,检索词为“self-assembly peptide, tissue engineering;自组装多肽,组织工程”,检索文献量总计224篇,纳入包含多肽材料设计、功能化多肽材料、多肽材料用于细胞三维培养方面的研究,最终纳入48篇。结果与结论：从物理结构角度讲,多肽材料可以在生理环境中自组装成具有纳米级纤维和较高孔隙率的水凝胶,最大程度上模拟细胞外基质的结构,保障细胞生存在一个真正的三维环境中。从生物功能角度讲,多肽材料可以根据不同需求复合特异性的生物活性短肽片断,赋予材料一定的细胞特异性,可以促进细胞的黏附、增殖或分化。     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的:研究软骨组织工程中传代软骨细胞与原代的差异。方法:用5个月人胎关节软骨分离培养细胞,观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学的改变。结果:(1)软骨块在4℃下,3d 内细胞存活率可达 93.4％～97.6％。(2)原代细胞为圆形或三角形;第4代有一半转变成梭形,到第6代全部变为长梭形。(3)传代细胞贴壁时间(2～3h)短于原代(4～7h)。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为78.7％～85.5％,原代8.8％。(4)生长曲线表明,从原代到第4代都有高增殖力;到第8代时增殖降低;到第12代几乎丧失细胞增殖。结论:软骨块4℃冷藏,3d内对细胞存活率无明显影响。第4代细胞贴壁快、增殖快,适于作为组织工程用细胞。第8代以后不适合。     

体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象

背景：兔是软骨组织工程研究中应用非常广泛的实验动物模型,关节软骨细胞的去分化现象已经被广泛认可.目的：观察体外传代培养过程中兔关节软骨细胞的去分化现象.方法：将从新西兰大白兔膝关节分离获取的原代软骨细胞进行传代培养至第7代,对细胞生长、形态、基质分泌以及基因表达等方面分别采用细胞计数,显微镜观察,F机动蛋白染色、番红O染色,糖胺聚糖定量测定以及半定量聚合链式反应进行鉴定和比较.结果与结论：光学显微镜下,兔关节软骨细胞在体外传代培养过程中细胞形态由小且圆形或多角形,逐步转变大且为成纤维细胞样的梭形形态,对F机动蛋白的染色进一步佐证了这样的形态变化.细胞计数结果表明,细胞增殖能力随代次增加显著下降,特别是第3代以后的软骨细胞基本无明显增殖;经过番红 O 染色以及定量测定糖胺聚糖的含量,发现软骨特性胞外基质分泌量从第2代细胞开始就呈现显著的降低.半定量聚合链式反应检测结果表明,随着传代次数的增加,特别是第3代以后,软骨相关特征分子（包括Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白和SOX9等）基因表达水平下调;而与去分化相关的特征分子Ⅰ型胶原和多能蛋白聚糖基因表达水平上调,同时,细胞表面分子CD90基因表达上调,而CD14基因表达未见明显变化.结果证实,兔软骨细胞在体外传代过程中可出现快速地去分化现象,呈现出特征基因表达水平的变化,第3代以内的软骨细胞适合应用于软骨组织再生修复.     

犬关节软骨细胞的体外分离与培养

背景：自1967年Manning等提出的通过胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法分离软骨细胞以来,软骨细胞的体外分离培养研究较多,但目前尚无统一标准。目的：研究犬关节软骨细胞在体外分离以及培养的条件,寻求体外扩增软骨细胞较简便、可行、高效的实验方法。方法：取3周龄幼犬关节软骨组织,应用胰酶、胶原酶制定8种消化方法获取软骨细胞,对比不同方法所获取细胞数量及细胞成活率,分离细胞进行原代及传代培养,观察各代软骨细胞形态。结果与结论：在体外分离犬关节软骨细胞的各种方法中,单纯应用Ⅱ型胶原酶消化法获得的软骨细胞数最多,细胞成活率最高。软骨细胞可以通过体外培养获得扩增,并且维持良好的细胞形态及表型,但仅限于5代以内。     

含IKVAV两亲性肽自组装凝胶二维诱导神经干细胞的分化

背景:脊髓基质支架是构建脊髓组织工程的关键因素,目前,各种无机或有机高分子材料均不是构建脊髓组织工程理想支架材料,含有活性结构的多肽在体液或培养液促发下可形成与脊髓黏弹性一致多孔支架,有望成为优良脊髓组织工程支架材料.目的:将鼠神经干细胞接种于含IKVAV两亲性肽自组装凝胶表面,观察其对细胞分化影响.设计、时间及地点:细胞水平对照观察,实验于2006-10/11在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室完成.材料:多肽序列C16H31O-A3G4D2IKVAV(Mw=1 438.31,纯度=96.06%)为自行设计合成.乳鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.方法:机械分离法从乳鼠大脑皮质获取神经干细胞;10 g/L两亲性肽溶液在DMEM/F12触发下自组装为三维多孔凝胶;1×108L-1神经干细胞悬液分别接种于凝胶表面(实验组)及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面(对照组)培养2周,免疫细胞化学染色鉴定.主要观察指标:①分离细胞免疫组织化学染色观察巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达.②凝胶纳米纤维形态.③凝胶表面免疫细胞化学染色观察巢蛋白、神经丝及胶质纤维酸性蛋白表达.结果:分离的细胞为巢蛋白阳性的神经干细胞,可分化为神经元特异性烯醇化酶阳性神经元及胶质纤维酸性蛋白表达阳性胶质细胞:透射电镜示凝胶由纳米纤维构成,纤维直径有3～5nm,长度100～1 500 nm:培养7 d后,实验组观察到细胞长出突起,可发现神经丝阳性神经元样细胞,标记为红色荧光,胶质纤维酸性蛋白阳性胶质细胞样细胞,标记为绿色荧光;对照组仅形成未分化细胞球,巢蛋白阳性,标记为绿色荧光.结论:含IKVAV肽自组装三维凝胶与神经干细胞有良好的细胞相容性,可诱导神经干细胞分化为神经元及胶质细胞.     

组织工程软骨细胞体外培养技术要点

通过组织工程技术，采用自身软骨细胞体外增殖构建软骨来修复关节软骨损伤，在临床上已成为一种有效的新方法。近年来，有关体外软骨细胞培养技术的研究较多。通过对入选文献进行分析、整理，对影响体外构建软骨的因素包括培养空间、应力、细胞密度和氧张力等方面进行分析，体外采用三维多条件联合培养软骨细胞可以改善构建软骨的生物品质。但是影响软骨细胞生长的因素众多复杂，在体外如何更好地构建软骨，有待进一步研究。     

含肝细胞生长因子水凝胶修复家兔股骨颈部缺损

背景：肝细胞生长因子可促进骨组织再生,在骨组织修复方面有着巨大的潜力,但是在体内较短的半衰期限制了其在临床的应用。目的：观察含有肝细胞生长因子的半合成细胞外基质样水凝胶体内促进股骨颈骨缺损修复的作用。方法：取12只兔制作双侧股骨颈骨缺损模型,采用自体配对对比,左侧为对照侧不对骨缺损做任何处置,右侧为实验侧植入含有肝细胞生长因子的半合成细胞外基质样水凝胶。结果与结论：苏木精-伊红染色见2周时实验侧缺损修复区血管分布较对照侧均匀;4周时实验侧缺损区均匀填充新生骨小梁,而对照侧由外向内骨小梁形成减少;8周时实验侧缺损区皮质骨形成,并且骨髓腔再通,有骨髓细胞填充,对照侧仍有粗大骨痂填充缺损区,堵塞髓腔。钼靶X射线观测到8周时,实验侧难以区分正常骨质与新生骨质交界线,而对照侧缺损区与周围骨质分界明显。证实含有肝细胞生长因子的半合成细胞外基质样水凝胶可以促进家兔股骨颈部骨缺损的骨组织修复。     

同种异体血清体外培养兔膝关节软骨细胞的增殖

背景:兔关节软骨细胞体外单层培养采用胎牛血清培养基易去分化,有必要寻找合适培养基来提高兔关节软骨细胞培养质量。目的:观察同种异体兔血清对体外培养的兔膝关节软骨细胞增殖能力的影响。方法:以0.4%链霉蛋白酶和0.025%Ⅱ型胶原酶分离成年兔膝关节软骨细胞,将获得的软骨细胞随机分为实验组和对照组。实验组以体积分数10%异体兔血清+DMEM/F12培养;对照组以体积分数10%胎牛血清+DMEM/F12培养,传代培养至4代。结果与结论:实验组前4代软骨细胞增殖较对照组慢,但软骨细胞形态未发生明显改变而对照组软骨细胞出现去分化现象。提示体积分数10%异体兔血清培养利于维持软骨细胞增殖和形态的稳定,是较好的获取大量优良软骨细胞的体外培养方式。     

高密度细胞培养对兔关节软骨细胞糖胺多糖合成的作用

背景:软骨细胞体外培养时常发生失分化,合成糖胺多糖的能力下降,延缓软骨细胞的失分化速度是组织工程学需要解决的重要课题.目的:观察不同接种密度下,软骨细胞合成糖胺多糖的能力.设计、时间及地点:对比观察细胞学实验,于 2007-01/05在山西医科大学第二医院骨科实验室完成.材料:1月龄新西兰兔5只.方法:采用0.4%Pronase酶和0.025%Ⅱ型胶原酶消化分离双膝关节关节软骨细胞,来源于同一只兔的软骨细胞分为两部分,一部分以2×104/cm2接种,传代时仍以相同密度接种.另一部分在细胞贴壁后,人工降低细胞密度至2×103/cm2培养.倒置显微镜下观察细胞形态和增殖情况.原代和传1代细胞于细胞融合后换液.主要观察指标:换液后12,24,36,48,60 h以改良Alcian blue染色沉淀法测定糖胺多糖质量浓度.结果:原代高密度培养组关节软骨细胞为多边形,轮廓清晰,三四天即可见集落形成,集落周边细胞较中心瘦长,为长多边形,传1 代细胞形态无明显变化.低密度培养细胞早期散在分布,7 d左右形成集落,细胞形态与高密度培养无明显差异.原代低密度培养软骨细胞长到融合所需时间较原代高密度培养细胞所需时间长.原代低密度培养组上清液中糖胺多糖质量浓度显著低于原代及传1 代高密度培养组软骨细胞(P＜0.001,P＜0.05),且时间越长,质量浓度相差越大.结论:与低密度培养相比,平面高密度培养可提高软骨细胞合成糖胺多糖的能力,明显减缓软骨细胞的失分化速度,提示高密度培养更有利于软骨细胞维持表型,是软骨平面培养的较好方式.     

地塞米松磷酸钠对体外培养关节软骨细胞增殖的影响

背景:研究表明,地塞米松可以使关节软骨表层基质中的Ⅱ型胶原减少,Ⅰ型胶原增多,但糖皮质激素对关节软骨细胞增殖作用的机制尚不十分清楚.目的:验证地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞增殖的影响.设计:对比观察.材料: 1月龄新西兰白兔用于软骨细胞的分离与培养.方法:兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组,对照组用不含地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同质量浓度地塞米松磷酸钠(0.02,0.1,0.5 g/L)的DMEM培养液.主要观察指标:①原代及传代兔关节软骨细胞的形态学观察.②应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖及其合成Ⅱ型胶原能力.③透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化.结果:实验组软骨细胞贴壁、增殖较对照组缓慢.各实验组Ⅱ型胶原平均灰度值均显著高于对照组(P<0.05).实验组软骨细胞进入S期、G_2+M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G_0/G_1期的细胞比率增加.电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少.结论:地塞米松磷酸钠抑制软骨细胞的增殖,可能与抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白的合成能力有关.     

Methods for the isolation and culture of human articular chondrocytes

The tissue engineering of cartilage implants may open new paths for the surgical treatment of joint surface defects. Autologous chondrocyte transplantation (ACT) has been gaining in clinical significance over the last several years. This study presents the methods used for isolation, monolayer culturing, multipication and assesment in transmission light microscopy of human chondrocytes. The tissue was gained from resected fragments of joint during total knee replacement.     

关节软骨损伤后体外培养软骨细胞的功能变化

背景:关节软骨损伤可以影响软骨细胞功能,诱发创伤性骨关节炎.目的:观察关节软骨损伤后体外培养的软骨细胞功能的变化.方法:通过酶消化法分离培养高能量、低能量撞击后和正常兔膝关节透明软骨细胞,观察创伤能量对软骨细胞生存能力的影响;检测软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力,检测细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平,检测细胞合成白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的表达.结果与结论:高能量和低能量关节软骨损伤后,软骨细胞的存活率下降,原代细胞的贴壁细胞数量减少,贴壁时间延长,生长曲线下移,细胞甲苯胺蓝染色异染反应减弱,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度减弱,软骨细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平上升,细胞培养液中白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的质量浓度升高,其中高能量组效果更为显著(P < 0.05).说明关节软骨损伤后软骨细胞的功能受到影响,受损程度与创伤强度及炎性细胞因子的表达相关.     

关节软骨损伤后体外培养软骨细胞的功能变化

背景：关节软骨损伤可以影响软骨细胞功能,诱发创伤性骨关节炎。目的：观察关节软骨损伤后体外培养的软骨细胞功能的变化。方法：通过酶消化法分离培养高能量、低能量撞击后和正常兔膝关节透明软骨细胞,观察创伤能量对软骨细胞生存能力的影响;检测软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力,检测细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平,检测细胞合成白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的表达。结果与结论：高能量和低能量关节软骨损伤后,软骨细胞的存活率下降,原代细胞的贴壁细胞数量减少,贴壁时间延长,生长曲线下移,细胞甲苯胺蓝染色异染反应减弱,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度减弱,软骨细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平上升,细胞培养液中白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的质量浓度升高,其中高能量组效果更为显著（P〈0.05）。说明关节软骨损伤后软骨细胞的功能受到影响,受损程度与创伤强度及炎性细胞因子的表达相关。     

温敏性壳聚糖水凝胶复合细胞因子修复兔关节软骨缺损

背景：单独以细胞因子修复软骨缺损时局部很难保持有效浓度,且维持时间非常有限。目的：观察负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1温敏性壳聚糖水凝胶修复兔关节软骨缺损的可行性。方法：通过京尼平的交联作用制备温敏性壳聚糖水凝胶,并负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1。取24只兔制作双侧膝关节软骨全层缺损模型,随机分为3组：结合组软骨下骨钻孔后以负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1的温敏性壳聚糖水凝胶充填软骨缺损,钻孔组行软骨下骨钻孔,对照组不做任何处理。结果与结论：温敏性壳聚糖水凝胶在37℃凝胶时间为3min,结构致密,为多孔三维支架,能缓慢释放基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1。结合组软骨修复在组织细胞形态、超微结构、Ⅱ型胶原含量等方面均明显优于钻孔组和对照组（P〈0.05）。说明负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1温敏性壳聚糖水凝胶结合软骨下骨钻孔能有效修复兔膝关节软骨全层缺损。     

Species differences in cell culture of mammalian articular chondrocytes.

Articular chondrocytes from eight mammalian species (rabbit, opossum, woodchuck, cat, dog, sheep, rhesus and cebus monkeys) were grown in monolayer culture using a single regimen. The animals were immature or young adults. Ham's F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum was employed for the primary cultures and Dulbecco-Vogt medium, for the secondary. Marked species differences were found with respect to cell morphology, growth in primary and secondary cultures, incorporation of radiosulfate into macromolecules, adhesion to the flask surface, response to vitamin C, and chondroid expression in spinner bottles. Under these particular conditions, rabbit chondrocytes grew most rapidly and incorporated several times more sulfate than did the others. Additional experiments carried out with other media on four of the species indicate that optimal conditions for culturing mammalian chondrocytes must be determined for each species individually.     

以胶原水凝胶为支架构建肝细胞三维培养系统*

背景：肝细胞体外培养时快速失去功能限制了肝细胞疗法的发展。目的：以胶原水凝胶为支架建立能够长时间有效维持肝细胞功能的肝细胞三维培养系统。方法：将SD大鼠肝细胞与预混肝细胞生长因子及DMEM的液态Ⅰ型胶原混合,形成肝细胞/胶原凝胶复合物,将该复合物接种至培养板,待形成胶冻状凝胶后再加培养液进行培养。通过光学显微镜、苏木精-伊红染色及透射电子显微镜对肝细胞的形态学特征及超微结构进行观察;并通过糖原染色、免疫荧光染色、实时定量PCR进一步对肝细胞特异表型及功能进行检测。收集培养上清,检测细胞白蛋白及尿素合成能力。结果与结论：①肝细胞/胶原水凝胶复合物形成后,可见肝细胞呈圆形分布于水凝胶中,培养14 d后仍保持肝细胞形态并呈类似肝脏结构的肝索样聚集排列,超微结构观察显示肝细胞之间形成紧密连接。②培养14 d后,糖原染色、白蛋白及肝细胞核因子4α免疫荧光染色呈阳性,证实肝细胞具有糖原及白蛋白合成能力并仍具有分化潜能。③三维培养中,肝细胞的白蛋白及尿素合成能力及分泌水平明显高于二维培养,且至少能够在较高水平维持15 d。④培养7 d后,Albumin、HNF-4α、Claudin-3、CYP1A1、CYP3A1以及G6P等肝细胞特异性基因的表达水平明显高于二维培养。以上结果证实,以胶原水凝胶为支架构建的三维培养系统使肝细胞在结构上更类似肝脏组织,并能在更长时间内有效的维持肝细胞合成代谢等各方面功能。