心肌细胞体外微环境中骨髓间质干细胞向心肌样细胞的分化

目的：分析心肌组织内何种细胞对骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的定向分化起决定作用。方法：利用BMSCs与心肌细胞（cardiomyocytes,CM)、内皮细胞（endothelial cells,EC)共培养和单独培养，分析形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果：与CM共培养后，相邻的BMSCs之间融合成肌管样结构，并与相邻胎鼠CM初步形成闫盘样结构。心肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC)抗体染色呈阳性。在与EC共培养以及BMSCs单独培养时，BMSCs均未出现肌管样结构，MHC染色呈阴性。结论：CM对BMSCs的定向分化具有一定作用。     

犬骨髓多能成体祖细胞的体外培养、鉴定及向平滑肌样细胞的诱导分化

目的：探讨犬骨髓多能成体祖细胞（MAPC）的体外培养条件、生物学特性及其向平滑肌样细胞分化的可能性。方法：观察体外培养犬骨髓多能成体祖细胞的形态、生长情况，检测其表面标志，利用流式细胞技术检测MAPC的生长周期及特异表面标志表达率；并以分化培养基诱导培养，采用RT-PCR方法检测骨髓多能成体祖细胞OCT-4及分化细胞SM-MHC（smooth muscle cells-myosin heavy chain）表达；检测分化细胞有无平滑肌细胞表面标志的表达。结果：光镜下观察犬骨髓多能成体祖细胞体积偏大，长多角型，数个细长伪足，细胞核大，胞质丰富，细胞增殖能力旺盛；表达表面标志CD13和SSEA-1，不表达CD44、CD45、CD133和MHCⅡ；RT-PCR结果显示表达OCT-4。诱导分化后，分化细胞表达平滑肌细胞表面标志——a-SMA、calponin、SM-MHC；RT-PCR结果显示表达SMMHC。结论：体外成功培养犬骨髓多能成体祖细胞，具有与文献报道类似的生物学特征；MAPC在一定诱导条件下具有向平滑肌样细胞分化的潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外诱导分化

目的 通过体外药物诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化，进一步验证其多能分化特性。方法 分离培养大鼠MSCs，5－脱氧杂氮胞苷（5－Aza－cdR）作用24h后继续培养4wk，电镜超微结构观察，免疫细胞化学染色鉴定。结果 5－Aza-cdR诱导4wk后的部分大鼠骨髓间充质干细胞α-Actinin,Troponin T阳性表达，电镜观察可见横纹样结构形成，核呈卵圆形，位于细胞中央位置，胸质中可见富集的糖原颗粒及大量线粒体。结论 MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞，能在体外条件下经5－Aza-cdR诱导分化成心肌细胞。     

体外诱导分化的多能成体祖细胞移植到帕金森病大鼠模型后的形态学观察

目的：探讨骨髓间质分离的多能成体祖细胞（MAPCs）移植后在大鼠脑组织内神经细胞分化的形态学观察。方法：制作帕金森病（PD）大鼠模型,将在体外纯化、增殖和用5-溴-2脱氧尿苷（BrdUrd）处理过的MAPCs注入PD大鼠脑内。3个月后,对移植大鼠采用免疫组化技术、免疫电镜等方法鉴定和分析MAPCs在大鼠脑组织内神经元样细胞分化的形态学。结果：MAPCs在中脑黑质和纹状体区分化为神经元样细胞和多巴胺能神经元;电镜下观察到MAPCs所分化的神经细胞与其他神经细胞形成突触联系。结论：骨髓间质分离的MAPCs移植后能在大鼠脑组织微环境中自主分化为多巴胺能神经细胞并有效地与其他神经细胞形成突触联系。因此MAPCs有望成为中枢神经系统疾病自体移植治疗的最佳候选干细胞之一。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

【目的】探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的潜能。【方法】取大鼠下肢骨骨髓，分离培养MSCs，用5-氮胞苷(5-aza)定向诱导24h，相差显微镜下观察其形态变化，免疫组化法检测肌钙蛋白(cTnT)和心肌细胞结蛋白(desmin)表达，并通过RT-PCR对肌球蛋白重链(MHC)在细胞中的表达进行鉴定。【结果】MSCs经5-aza诱导后，部分细胞呈梭形，并可见肌管样结构。免疫组化检测示诱导后MSCs的cTnT阳性细胞数为15％，Desmin表达强阳性，RT—PCR示诱导后MSCs有MHC表达。【结论】MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞，是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源。     

体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的：研究骨髓基质干细胞体外向心肌细胞分化的能力。方法：通过密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠骨髓基质干细胞,首先将第3代细胞用5-氮胞苷诱导24h,传至4代时再次诱导24h,当培养细胞汇合并形成肌管时传代;出现跳动细胞时用免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达。结果：原代细胞首先形成细胞集落,10d后集落间接近汇合,传代细胞体积变大,5—7d传代1次,两次诱导后细胞呈梭形,约15d后细胞汇合并出现肌管,再传代时,细胞出现跳动。免疫细胞化学显示细胞表达cTnT。结论：骨髓基质干细胞在体外能够诱导分化为心肌细胞。     

微管在骨髓基质细胞向肌细胞分化过程中的表达

目的 探索微管在骨髓基质细胞（BMSCs）向肌细胞分化过程中的动态变化，为研究BMSCs向肌细胞分化的信号传导途径提供思路。方法 实验分3组，A组：单纯培养BMSCs；B组：将BMSCs与心肌细胞共同培养．但两种细胞不相互接触；C组：将BMSCs与心肌细胞共同培养，使细胞间相互接触，以模拟其所处的心脏微环境。使用4，6-二胺基苯吲哚（DAPI）标记BMSCs并追踪微管组装的动态过程，分析各组BMSCs的形态结构和表型的变化。结果 A、B组BMSCs无明显改变。C组BMSCs在共同培养7d后，与相邻的心肌细胞形成同步收缩的细胞团块，邻近心肌细胞的BMSCs首先表现出微管的组装明显增加，随后才表达出肌细胞特异性蛋白。结论 BMSCs与心肌细胞相互作用过程中，微管可能起信号传导作用，心肌细胞对邻近BMSCs的周期性机械牵拉作用是促进微管的组装及细胞分化的关键因素。     

大鼠骨髓基质干细胞的神经分化以及神经生长因子的表达

目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞神经分化以及神经生长因子的表达.方法 体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSC),传代至第6代,进行神经诱导分化.先以bFGF (10 ng/ml)预诱导24 h,然后以胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)10 ng/ml在胎肠培养基(fetal gut condition midium,FGCM)条件下诱导10 d.免疫荧光法检测神经元标志神经特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)的表达.RT-PCR法检测神经营养因子GDNF和神经生长因子(nerve growth factor,NGF) mRNA的表达.结果 流式细胞检测BMSC高表达CD90(99.7%), 而CD45表达阴性.诱导10 d后,部分细胞在形态上表现出神经元样改变,免疫荧光染色神经元标志NSE和NF阳性,而胶质细胞标志GFAP阴性.RT-PCR检测显示,BMSC诱导前低表达神经营养因子NGF和GDNF mRNA,而诱导后表达水平显著增加.结论 GDNF不仅能在体外诱导BMSC分化为神经样细胞,而且能促进神经营养因子表达显著增加.     

Oct-4在精原干细胞定向诱导分化中的表达

目的：检测Oct-4在小鼠精原干细胞（mouse spermatogonial stem cells,mSSCs）体外诱导分化中的表达。方法：①体外培养mSSCs;②用干细胞因子（SCF,stem cell factor）对mSSCs进行精母细胞方向诱导分化;③通过形态学观察和c-kit,GCNF间接免疫荧光染色鉴定mSSCs是否发生分化;④通过间接免疫荧光染色和RT-PCR分别从蛋白水平和mRNA水平检测Oct-4在mSSCs诱导分化前后的表达情况。结果：①形态学观察mSSCs细胞核较大,细胞质少,SCF诱导培养后,随着培养时间的延长,细胞克隆逐渐增长缓慢,并出现衰退、凋亡的细胞;②c-kit,GCNF间接免疫荧光染色结果显示,mSSCs经SCF诱导后发生分化;③Oct-4间接免疫荧光染色和RT-PCR结果显示,Oct-4在mSSCs诱导前表达水平最高,诱导2天后下降,5天后几乎不表达。结论：Oct-4是mSSCs未发生分化的标志。     

肝细胞生长因子诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化的可行性

目的探索人骨髓来源多能成体祖细胞(mulfipotent adult progenitor cells from human bone marrow，hMAPCs)在一定诱导条件下分化为肝细胞的可行性，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分组：A组1(hepatocyte growth factor，HGF)20ng／mL诱导；B组(阳性对照组)：L-02人肝细胞株；C组(阴性对照组)：未加任何诱导因素的MAPCs。免疫细胞化学鉴定不同诱导分化阶段细胞的白蛋白(albumin，ALB)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AVP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK-18)、细胞角蛋白19(cytokeratin 19，CK-19)等肝细胞特征的表型变化并计数阳性细胞比率；Western blot检测诱导分化第21、35天后细胞的ALB的表达。结果免疫细胞化学结果：ALB、CK-18在不同时间段基本为阳性着色；CK-19在各组均为阴性着色，AFP作为早期不成熟肝细胞的一个标志，仅在诱导第7天为阳性着色；Western blot检测结果：在诱导分化第21、35天，ALB均有阳性表达。结论hMAPCs在一定诱导条件下具有向肝样细胞分化的潜能。     

肺癌干细胞基因Oct-4表达的临床意义

目的研究肺癌干细胞的基因表达与临床特征、病理特征、预后间的关系。方法应用流式细胞仪分选出肺癌干细胞,并应用RT^2 Profiler TMPCR仪检测肺癌干细胞与非肺癌干细胞问的差异性基因表达。应用免疫组化分析十细胞基凶Octamer-4（Oct-4）的表达与临床病理特征之间的关系。应用Western—blot检测肺癌干细胞中Oct-4蛋白的表达情况。结果肺癌干细胞与非肺癌干细胞间显著差异性表达的基因共7种,包括干细胞分化相关因子（CD44、Oct-4和nestin）、细胞周期调节因子（APC和CDC2）以及生长因子（HGF和TGF）。其中,Oct-4蛋白在癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P=0．001）。经过生存分析,Oct-4蛋白高表达病例的术后无病生存期明显短于Oct-4低表达或无表达的病例（P=0．001）。在Cox回归模型中,肿瘤大小、淋巴结转移和Oct-4的表达为独立预后网子（分别为P=0．031、0．002和0．003）。结论Oct-4在肺癌干细胞中高表达,并可作为肺癌发生、进展及分化的潜在生物标志。     

小鼠骨髓基质干细胞体外分化为前体心肌细胞的初步实验

目的 研究体外诱导小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)向心肌细胞分化的可能性。方法 MSCs通过细胞传代培养,并通过流式细胞仪进行鉴定。MSCs经过5-杂氮胞苷诱导后,通过RT-PCR、半定量RT-PCR、Western-blotting和透射电镜检测诱导后的MSCs。结果 培养的MSCs为形态均一的梭形细胞,有时可见细胞融合。流式细胞仪显示诱导后的MSCsCD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45表达阴性。经过5-杂氮胞苷诱导后的MSCs表达Nkx2-5/Csx、GATA4、β-MHC基因和α-sarcomericactin和desmin蛋白,透射电镜显示诱导后的MSCs有肌丝形成。诱导后的MSCsDNA甲基化转移酶表达降低。结论 小鼠MSCs能够向前体心肌细胞分化。     

Oct-4在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的 分析Oct-4在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达特点及规律,探讨Oct-4的表达在NSCLC发生、发展中的意义及其与肿瘤干细胞的关系.方法 采用免疫组化SP法检测Oct-4蛋白在135例NSCLC组织和20例正常对照肺组织中的表达情况.结果 NSCLC组织中Oct-4表达的阳性率明显高于正常对照肺组织,二者之间的差异具有显著性（P＜0.05）.Oct-4表达的阳性率与NSCLC患者的临床分期、有无淋巴结转移及肿瘤分化程度有关（P〈0.01）,而与患者的性别、年龄及NSCLC的组织学类型无关（P＞0.05）.结论 Oct-4的表达与NSCLC的分化程度、临床分期和淋巴结转移有关,提示Oct-4的表达在NSCLC发生、发展中的可能具有一定的意义,表达Oct-4的肿瘤细胞很可能是肿瘤干细胞,推测Oct-4有可能成为分离和鉴定NSCLC肿瘤干细胞的标志物.     

双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

目的 建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(MAPCs)的方法.方法 取健康成人志愿者适量骨髓采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,流式细胞术鉴定分选后细胞纯度;对传代到不同阶段的细胞进行CD45、GlyA流式细胞分析,初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性.结果 通过miniMACS分选,平均每1×10⁶/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×10⁴/ml的MAPCs,分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;自制的培养基培养分选后的MAPCs生长良好,最长传代到第16代;流式细胞仪分析获取的CD45、G1yA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪分析传代第4、8、12代MAPCs,CD45^-、G1yA^-细胞纯度大于98%.结论 CD45、GlyA miniMACS负分选可从骨髓中分离高纯度的MAPCs;MAPCs在本室自制的人MAPCs培养基中体外有较强的增殖能力,且能保持较长时间的稳定状态.     

转录因子Oct-4在皮肤鳞状细胞癌、脂溢性角化病的组织表达及其意义

目的检测干细胞转录因子Oct-4皮肤鳞状细胞癌(SCC)、脂溢性角化病(SK)的组织表达,分析其表达差异及与肿瘤干细胞的关系。方法采用免疫组织化学方法检测Oct-4在35例SCC、21例SK及15例正常对照皮肤组织中的表达。结果 Oct-4在正常皮肤组织表达为阴性,在SCC、SK之间表达有显著性差异(P<0.05),间接反映SCC、SK的恶性程度不同。结论 SCC、SK中表达Oct-4基因的细胞很可能是SCC、SK的干细胞,这将为其最终分离和鉴定人SCC、SK干细胞提供重要基础,将有助于揭示SCC、SK的肿瘤起始细胞,从而对预防和治疗SCC、SK有重大意义。     

双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

OBJECTIVE: To establish a method for purifying and culturing human multipotent adult progenitor cells (MAPCs) in vitro. METHODS: Mononuclear cells were separated from the bone marrow of healthy adult volunteers by density gradient centrifugation and cultivated in adherent culture. The plastic-adherent cultured bone marrow cells were isolated by magnetic-activated cell sorting with CD45 and GlyA magnetic microbeads, and the purity of CD45-/GlyA- cells evaluated by flow cytometry. Phase-contrast microscopy was used to detect morphological changes of the cells in different stages of culture. RESULTS: Approximately (5-10)x10(4)/ml MAPCs could be separated from every 1x10(6)/ml bone marrow mononuclear cells by magnetic- activated cell sorting. The viability of the cells before and after separation was (96.7+/-1.7)% and (96.0+/-2.4)%, respectively. The isolated MAPCs grew well in a self-prepared culture medium till the16th passage. The purity of CD45-/GlyA- separated from the bone marrow was more than 98% as examined by flow cytomety even till the 12th passage. CONCLUSIONS: MAPCs derived from adult human bone marrow can be purified by magnetic-activated cell sorting with CD45 and GlyA microbeads and retain the undifferentiated state for a long time. The self-prepared culture medium is appropriate for MAPCs cultures in vitro.     

RT-PCR技术检测石蜡包埋恶性生殖细胞肿瘤．组织中Oct4的表达

目的：用逆转录PCR技术（RT-PCR）技术从石蜡包埋的恶性生殖细胞肿瘤组织中检测Oct-4基因（目的片段）的表达。方法：用Trizol法从上述3种肿瘤组织抽提总RNA,取出1μl作为模板进行反转录合成cDNA第一链,然后进行PCR反应。PCR产物用1．2％的琼脂糖凝胶电泳检测。结论：RT—PCR技术可以检测石蜡包埋肿瘤组织Oct．4基因。     

Oct-4在胃癌组织中的表达及临床意义

目的研究干细胞相关标志物Oct-4在胃癌组织中的表达及临床意义。方法收集1996年6月-2006年3月胃癌手术石蜡标本63例,免疫组化法检测组织中Oct-4表达,分别以58例癌旁正常组织和10例正常胃黏膜组织标本作为对照。回顾63例患者的临床病理学指标,并分析各项指标与Oct-4表达的关系。对63例中的50例患者进行为期8年的生存随访,Kaplan—Meier法和Log-rank检验分析Oct-4表达与患者生存的关系;构建Cox回归模型,评估Oct-4作为胃癌患者预后的独立影响因素的可能性。结果Oct-4在胃癌组织中阳性表达率为80．95％（51／63）,显著高于癌旁正常组织的5．2％（3／58）和正常胃黏膜组织（0）（P〈0．01）。Oct-4表达的阳性程度与胃癌的临床分期呈正相关（P〈0．01）。Oct-4表达在不同分化程度胃癌组织及不同年龄和性别患者间比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。Oct-4表达阳性程度高的患者生存时间明显短于Oct-4表达阳性程度低的患者（P〈0．05）。Oct-4表达水平与胃癌患者预后无明显相关性（RR0．554,95％C10．209～1．466）。结论Oct-4在胃癌组织中表达的阳性程度与肿瘤临床分期及患者生存期有关,但不是胃癌患者预后的独立影响因素。