慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

稳定靶向干扰候选抗药基因UGT1A9鼻咽癌细胞株建立

目的构建针对UGT1A9基因的shRNA慢病毒干扰表达载体;建立稳定UGT1A9干扰鼻咽癌细胞株,测定干扰效率。方法应用荧光定量PCR法检测UGT1A9 mRNA在鼻咽癌成瘤高转移细胞株5-8F和成瘤非转移细胞株6-10B之间的差异表达水平。构建重组UGT1A9 shRNA表达质粒pLentiU6/UGT1A9,经293FT细胞包装后,产生的慢病毒感染5-8F细胞,荧光定量PCR检测干扰效率。结果 UGT1A9在鼻咽癌细胞株中明显高表达。PCR、测序验证pLentiU6/UGT1A9-shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未干扰组相比,可明显抑制UGT1A9 mRNA水平。结论成功构建了稳定靶向干扰候选抗药基因UGT1A9的鼻咽癌细胞株,为研究UGT1A9可能参与介导鼻咽癌抗药的分子机理奠定了基础。     

Cycl慢病毒干扰载体的构建及在鼻咽癌细胞中干扰效率检测

目的 检测Cycl在鼻咽癌中的表达.构建稳定干扰Cycl慢病毒载体及检测其在鼻咽癌细胞中的干扰效率.方法 应用基因芯片技术检测Cycl基因在鼻咽癌组织中的表达.Real-time PCR确证Cycl基因在鼻咽癌组织和细胞中高表达.构建重组靶向Cycl的shRNA慢病毒质粒pLentiU6/Cycl-shRNA.建立稳定干扰Cycl基因的鼻咽癌细胞系,荧光定量PCR检测干扰效率.结果 基因芯片检测显示,Cycl基因在鼻咽癌组织中高表达.qRT-PCR确证了墓因芯片结果的可靠性.在8个鼻咽癌细胞株中,Cyc1基因基本上都显示了高表达,其中最高的为鼻咽癌5-8F细胞.测序验证pLentiU6/Cycl-shRNA重组质粒构建成功.重组质粒能明显稳定地抑制Cycl基因在鼻咽癌细胞中的表达.结论 Cycl 基因在鼻咽癌中高表达.构建的靶向Cycl基因的慢病毒载体能明显抑制其表达.这为研究Cycl基因在鼻咽癌中的功能及分子机制奠定了基础.     

慢病毒介导shRNA沉默巢蛋白表达对人黑色素瘤细胞转移特性的影响

摘要：目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默黑色素瘤细胞株UACC903 巢蛋白（nestin）的表达,研究其对黑色素瘤
细胞转移能力的影响。方法以人nestin mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒基因PLL3.7 作为质粒载体,构建靶向人
nestin的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,分别感染UACC903细胞并流式分选获
得高纯度的nestin 干扰或对照组细胞。应用RT-PCR、免疫荧光及Western blotting 检测不同组别nestin 表达的变化。分别用
Transwell侵袭试验检测跨膜细胞的数量评估各组黑色素瘤细胞的侵袭能力,划痕法检测迁移能力改变。光镜观察各组细胞形
态变化,免疫荧光检测E-cadherin、N-cadherin 和β-catenin 在不同组别的表达变化。结果成功构建nestin shRNA慢病毒载体
nestin-RNAi-LV。RT-PCR 及免疫荧光结果显示干扰组UACC903 细胞nestin mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低。
nestin下调的UACC903细胞黏附、侵袭及迁移能力下降（P<0.05）。结论慢病毒介导的shRNA 能有效地静默食管癌细胞nestin
基因的表达,能抑制黑色素瘤细胞UACC903迁移。
     

FoxM1 shRNA慢病毒载体构建及感染人前列腺癌细胞的稳定细胞株筛选

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人FoxM1 shRNA重组慢病毒载体,并构建筛选FoxM1敲低的人前列腺癌稳定细胞
株,检测FoxM1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人FoxM1基因的shRNA靶序列,构建到
pHBLV-U6-ZsGreen-Puro 慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观
察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞FoxM1 mRNA水平,经嘌呤霉素
筛选建立FoxM1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中FoxM1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,
流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对FoxM1
shRNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素
抗性筛选建立了FoxM1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中FoxM1蛋白表达明
显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示FoxM1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表
明FoxM1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了FoxM1 shRNA慢病毒载体,建立了FoxM1敲低稳定前列腺
癌细胞株,抑制细胞内FoxM1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。
     

慢病毒介导的犬WRD细胞p53基因沉默及稳定感染细胞系的建立

目的构建靶向犬p53基因慢病毒干扰载体,建立稳定沉默p53 基因的WRD/p53-细胞系。方法设计并构建4条针对犬
p53基因的特异性shRNA干扰质粒。将构建的慢病毒表达载体（pGMLV-p53）和包装质粒（packaging mix）组成的包装系统共
转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。包装好的慢病毒感染WRD细胞,Western blot 和实时荧光定
量PCR方法检测不同靶点RNA干扰载体对p53基因的干扰效果,确定有效靶点。针对有效靶点慢病毒颗粒以最适感染复数
（multiplicity of infection, MOI）感染WRD细胞,puromycin抗生素筛选稳定感染细胞系WRD/p53-。结果结果显示p53 RNAi
慢病毒载体构建成功,成功包装四种不同靶点的p53基因RNA干扰慢病毒, 病毒滴度均达到1×109 TU/ml。四种干扰载体慢病
毒均具有较好的干扰效果,选用沉默效果最好的pGMLV-p53A1 为最优靶点,成功建立p53 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系
WRD/p53-。结论成功构建p53 RNAi慢病毒载体,并有效干扰WRD细胞中p53 mRNA和蛋白表达,同时成功筛选并建立p53
RNAi慢病毒稳定感染WRD/p53-细胞系。
     

人SR-BI基因表达抑制慢病毒载体构建及其稳定细胞株的筛选

目的 建立SR-BI表达抑制的肝癌细胞系,以作为研究SR-BI基因突变对HCV感染性影响的细胞模型.方法 构建SR-BI短发夹状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒重组质粒Lv-SR-BI-shRNA,挑取克隆进行PCR扩增和序列测定;将阳性重组质粒与慢病毒辅助质粒共转染HEK2973T细胞,包装SR-BI shRNA慢病毒并进行病毒滴度测定.SR-BI shRNA慢病毒感染人肝癌细胞株Huh7和Huh7.5.1细胞,嘌呤霉素筛选,Real-time PCR和Western blot法检测SR-BI mRNA转录和蛋白表达.结果 测序结果证实Lv-SR-BI-shRNA慢病毒载体构建成功并获得HEK293T细胞中包装的慢病毒,Lv-SR-BI-shRNA重组慢病毒感染Huh7和Huh7.5.1细胞,感染组SR-BI mRNA转录降低,蛋白表达降低.结论 建立了SR-BI表达抑制的人肝癌细胞株Huh7-siSR-BI和Huh7.5.1-siSR-BI稳定细胞系.     

长非编码MALAT1基因在人鼻咽癌细胞株的表达及生物学意义

目的探讨MALAT1在鼻咽癌细胞细胞株中的表达及生物学功能。方法通过Real-time PCR检测MALAT1基因在鼻炎
癌细胞株5-8F、C666-1、CNE-1、CNE-2、HONE-1、6-10B及永生化鼻咽上皮细胞NP69株中的表达;采用RNAi技术和RNA激活
技术,构建MALAT1慢病毒干扰载体和激活载体载体并稳定转染鼻咽癌细胞株CNE-1,采用CCK8、平板克隆、划痕等试验分析
MALAT1基因对CNE-1细胞生物学行为的影响。结果MALAT1在高转移的鼻咽癌细胞株中高表达,在正常鼻咽上皮细胞低
表达;经激活过表达MALAT1 后,CNE-1 细胞的上皮性标志物E-Cadherin 的表达显著下调,间质细胞标志物Vimentin 表达上
调,侵袭转移能力明显增强（P<0.05）。结论MALAT1基因上调能够促进鼻咽癌CNE-1细胞的增殖、侵袭和转移能力。
     

靶向YWHAE基因shRNA慢病毒表达质粒的构建及功能验证

目的 构建靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,并验证其对AGS胃癌细胞增殖的影响. 方法 设计并合成5对针对人YWHAE基因的shRNA序列,分别克隆入pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达质粒,接着将重组的慢病毒表达质粒和包装质粒PHR、包膜质粒VSVG一起采用磷酸钙法转染293T细胞包装慢病毒,收集制备的慢病毒感染AGS细胞,用抗生素Puromycine进行筛选.Western-blot检测感染细胞YWHAE蛋白的表达.选取干扰效率最高的慢病毒表达质粒,针对性设计siRNA的点突变引物,重叠延伸PCR法扩增获得点突变的YWHAE基因,克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A载体,构建YWHAE点突变的表达质粒,转染YWHAE沉默效果最好的AGS细胞株,Western-blot检测转染细胞YWHAE蛋白的回复表达.采用MTS法检测YWHAE-shRNA慢病毒对AGS细胞增殖的影响. 结果 5对针对人YWHAE基因的shRNA序列构建的慢病毒中,pLL3.7-siYWHAE-5包装成的慢病毒抑制AGS细胞的YWHAE蛋白表达的效果最明显,仅为对照组相对表达量的(0.269±0.083)倍;pLL3.7-siYWHAE-5包装的慢病毒,其干扰效应可经由YWHAE点突变表达质粒回复.与对照组比较,YWHAE-shRNA组AGS细胞增殖能力明显下降. 结论 成功构建了靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,获得YWHAE基因表达显著下调的AGS细胞株;探明YWHAE表达的下调可有效抑制AGS细胞的增殖,提示YWHAE在胃癌中的致癌潜能.     

siRNA靶向稳定干扰HDGF基因胃癌细胞株的建立

目的 构建针对肝癌衍生生长因子(HDGF)基因的siRNA表达载体,建立稳定干扰HDGF表达的胃癌细胞株. 方法 常规聚合酶链反应(PCR)检测HDGF基因在胃癌SGC-7901细胞株的表达情况.构建重组靶向HDGF shRNA慢病毒表达质粒pLentiU6/ HDGFshRNA,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞株.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株.荧光定量PCR检测干扰效率. 结果 在胃癌SGC-7901细胞株中,HDGF显示高表达.测序验证pLentiU6/HDGFshRNA重组质粒构建成功;在将干扰表达质粒稳定转染入胃癌细胞株后能明显抑制HDGF mRNA表达水平. 结论 成功构建了pLentiU6/HDGFshRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰HDGF表达的siRNA胃癌细胞株.     

重组腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞影响的动物试验

目的 探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对于鼻咽癌细胞在体内增殖及转移能力的影响.方法 设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(rAAV)载体:(增强型绿色荧光蛋白,EGFP)rAAV-EGFP和rAAV-shRNA-LMP-1,以不同滴度rAAv-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞确定最佳转染复数(MOI),rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1,RT-PCR鉴定抑制效率,将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下制作鼻咽癌异位肝种植的肝肺转移模型,观察肝脏成瘤及肝内、肺转移情况,分析LMP-1基因沉默在动物水平对鼻咽癌细胞成瘤及转移能力的影响.结果 rAAV-EGFP以5×104v.g(virus genome,病毒基因组数)/细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,RT-PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×104v.g/细胞转染C666-1后目的 基因抑制效率大于90%,动物试验结果显示rAAV-shRNA-LMP-1组肝脏成瘤体积与对照组rAAV-EGFP无显著差异,但显著减少了种植肿瘤的肝内及肺转移率.结论 通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,可在动物水平抑制鼻咽癌细胞转移,但对鼻咽癌细胞生长无显著影响.     

干扰长链编码RNA FOXCUT能抑制鼻咽癌细胞上皮间质转化及诱导线粒体损伤

目的 探讨干扰长链编码RNA FOXCUT对鼻咽癌细胞上皮间质转化及线粒体功能的影响。方法 RT-PCR检测50例鼻咽癌患者癌组织及癌旁组织和NP69、CNE1、CNE2、SUNE2、HER2和5-8F细胞株中FOXCUT表达水平;将shRNA FOXCUT转染至CNE1细胞,随机分组为Control组、shRNA-NC组和FOXCUT-shRNA3组。采用CCK8法和克隆形成实验检测细胞增殖;显微镜观察细胞形态;免疫荧光检测Vimentin+含量;试剂盒检测氧化应激标记物SOD、MDA、LDH的水平;流式检测线粒体膜电位的变化;Western blot法检测E-cad、N-cad、Vimentin、Bax、Bcl-2、caspase-3和c-Myc蛋白表达水平。结果 与癌旁组织相比,鼻咽癌组织中FOXCUT表达水平均升高（P<0.001）。与NP69细胞相比,CNE1、CNE2、SUNE2、HER2和5-8F细胞FOXCUT表达水平均升高（P<0.001）。与Control组相比较,FOXCUT-shRNA3组细胞增殖倍数及克隆形成率降低（P<0.001）,细胞形态呈短梭形、扁平型或圆形,细胞间的连接较为紧密,具有铺路石样特征;N-cad、Vimentin的表达水平降低,E-cad的表达水平升高（P<0.05）,Vimentin+含量降低（P<0.001）,MDA、LDH的含量明显升高（P<0.05）,SOD的活性明显降低（P<0.05）,红色荧光细胞向绿色荧光细胞转变较明显,绿色荧光细胞百分比增加,Bax/Bcl2、Cleaved cas3/cas3表达显著上升,c-Myc表达显著降低（P<0.001）。结论 干扰长链非编码RNA FOXCUT能够抑制鼻咽癌细胞增殖,减少上皮间质转化,增强氧化应激、降低膜电位,诱导CNE1细胞线粒体功能损伤,促进凋亡;干扰长链非编码RNA FOXCUT对CNE1细胞抑制效果显著,具有靶向治疗鼻咽癌的潜力。     

短发夹RNA对头颈肿瘤细胞端粒酶活性和增殖的影响

目的:观察靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的短发夹RNA(shRNA)对喉癌Hep-2细胞株和鼻咽癌NEC细胞株端粒酶活性和生长增殖影响,探讨抑制端粒酶活性途径治疗头颈肿瘤的可行性。方法:根据hTERT cDNA序列构建表达shRNA、含荧光素基因、靶向hTERT mRNA的真核表达质粒shRNA1和表达shR-NA的、含荧光素基因的、靶向非人类基因的真核表达质粒shRNA2。分别以质粒shRNA1、shRNA2、转染试剂及空白培养液处理体外培养的Hep-2细胞和NEC细胞。转染48 h后以TRAP PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性并行HE染色;倒置显微镜下每天观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖活性。结果:①Hep-2细胞和NEC细胞shRNA1处理48 h后与空白对照组比较端粒酶活性下降,P<0.05。②HE染色发现shRNA1处理后Hep-2和NEC细胞胞体缩小、核固缩,同等培养条件下,细胞生长密度变稀,见许多圆形死亡细胞。③与相应时间点空白对照组细胞平均吸光度(A)值比较,shRNA1处理组Hep-2细胞和NEC细胞24,48,72 h A值均减小,P<0.05。结论:靶向hTERT mRNA的小干扰RNA能够显著降低Hep-2细胞和NEC细胞的端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖,并诱导细胞凋亡。     

Nestin特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

目的构建人nestin基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制nestin基因表达对人黑色素瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法分别用30、50、80 nmol/L干扰或80 nmol/L对照siRNA转染人黑色素瘤细胞株UACC903,48 h后用免疫荧光、RT-PCR和Western-blot鉴定nestin基因表达并筛选有效的序列,用有效或对照组序列的正义链和反义链,通过酶切、连接、转化和筛选,获得长期下调人nestin基因表达的慢病毒载体,并包装慢病毒感染人UACC903细胞,免疫组化和Western-blot鉴定干扰有效,以此获取nestin表达下调的UACC903细胞株。结果重组质粒成功转化高感受态大肠杆菌,经XhoⅠ和HPAⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。干扰组或对照组慢病毒感染UACC903细胞后与对照组比较,干扰组mRNA和蛋白表达明显降低。结论成功构建了针对人nestin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制nestin基因的表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。     

应用RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白-1表达对鼻咽癌细胞生长的影响

目的探讨能否通过siRNA人工诱导RNA干扰,在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C611中,选择性抑制潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达,并了解LMP1抑制对鼻咽癌细胞生长的影响。方法利用脂质体转染的方法,将人工合成的双链siRNA导入鼻咽癌细胞,通过半定量RT-PCR检测LMP1 mRNA水平的变化。并采用MTT法和流式细胞仪检测LMP1表达抑制后,鼻咽癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果C611细胞转染siRNA可使LMP1 mRNA水平下降90%以上。LMP1基因抑制后,C611细胞增殖速度下降33%;流式细胞检测显示,C611细胞周期在G0-G1期受阻。结论本研究证明,全新的人工诱导RNA干扰技术,能够有效抑制LMP1基因的表达,并降低鼻咽癌细胞的增殖能力,为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。     

应用PNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白-1表达对鼻咽癌细胞生长的影响

目的 探讨能否通过siRNA人工诱导RNA干扰，在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C611中，选择性抑制潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达，并了解LMPl抑制对鼻咽癌细胞生长的影响。方法利用脂质体转染的方法，将人工合成的双链siRNA导入鼻咽癌细胞，通过半定量RT-PCR检测LMP1 mRNA水平的变化。并采用MTT法和流式细胞仪检测LMP1表达抑制后，鼻咽癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果C611细胞转染siRNA可使LMP1 mRNA水平下降90％以上。LMP1基因抑制后，C611细胞增殖速度下降33％；流式细胞检测显示，C611细胞周期在G0-G1期受阻。结论 本研究证明，全新的人工诱导．RNA干扰技术，能够有效抑制LMP1基因的表达，并降低鼻咽癌细胞的增殖能力。为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。     

慢病毒介导shRNA沉默巢蛋白表达对人黑色素瘤细胞转移特性的影响

目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默黑色素瘤细胞株UACC903巢蛋白(nestin)的表达,研究其对黑色素瘤细胞转移能力的影响。方法以人nestin mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒基因PLL3.7作为质粒载体,构建靶向人nestin的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,分别感染UACC903细胞并流式分选获得高纯度的nestin干扰或对照组细胞。应用RT-PCR、免疫荧光及Western blotting检测不同组别nestin表达的变化。分别用Transwell侵袭试验检测跨膜细胞的数量评估各组黑色素瘤细胞的侵袭能力,划痕法检测迁移能力改变。光镜观察各组细胞形态变化,免疫荧光检测E-cadherin、N-cadherin和β-catenin在不同组别的表达变化。结果成功构建nestin shRNA慢病毒载体nestin-RNAi-LV。RT-PCR及免疫荧光结果显示干扰组UACC903细胞nestin mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低。nestin下调的UACC903细胞黏附、侵袭及迁移能力下降(P<0.05)。结论慢病毒介导的shRNA能有效地静默食管癌细胞nestin基因的表达,能抑制黑色素瘤细胞UACC903迁移。     

活体成像观察Ascl2-RNAi对结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长的影晌

目的小动物活体成像直观观察转录因子Ascl2对结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法构建Ascl2的shRNA干扰质粒,对人结肠癌HT-29细胞进行瞬时转染48h,G418筛选、克隆挑取、扩增培养建立稳定转染的细胞系,采用小动物活体成像仪直观观察Ascl2-RNAi对裸鼠移植瘤生长的影响。结果成功构建Ascl2的shRNA干扰质粒,并进行测序验证;质粒转染HT-29细胞,经G418筛选后挑选稳定转染的克隆,进行扩增培养,成功建立稳定转染的细胞系,命名为shRNA-Ascl2／HT-29和shRNA-control／HT-29细胞,并采用Western-blot证实干扰效果（P〈0．01）;采用小动物活体成像仪直观观察发现Ascl2-RNAi抑制HT-29细胞裸鼠移植瘤的生长。结论Ascl2-RNAi导致结肠癌HT-29细胞体外致瘤能力下降,小动物活体成像技术直观、灵敏度高、实验成本低,值得进一步推广应用。     

抑制Pygo2表达对U251细胞增殖的影响

目的 构建RNA干扰(RNAi)重组体抑制Pygo2的表达,并探讨其对脑胶质瘤U251细胞增殖的影响.方法 针对Pygo2 cDNA序列设计并合成一对特异性的含有"短发卡"的寡核苷酸序列及其随机对照序列,经退火后插入pSuper中构建重组体.经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序后,用脂质体2000将其转染脑胶...