TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

Nestin转基因小鼠模型的建立及nestin基因在器官中的表达

目的构建人nestin基因表达载体,制备nestin过表达转基因小鼠。方法以人神经胶质瘤细胞株U251的cDNA为模板,分
3段扩增出nestin基因cDNA全序列,并将其克隆入含有强启动子ROSA26的pBROAD3载体,酶切鉴定、测序,除去原核序列,
纯化。显微原核注射建立转基因小鼠。PCR验证nestin基因整合,确定建立首建者。将阳性鼠传代。Western blot方法检测F3
代转基因小鼠与野生型小鼠主要器官（心、肺、脑、肾）的nestin 表达。结果测序结果证明成功构建了受ROSA26启动子调控的
nestin转基因载体。出生34只小鼠,PCR检测证实存在首建者2只。Western blot方法证实,与野生型小鼠相比,F3代转基因小
鼠脑、肺组织存在较高水平nestin 表达。结论首次成功建立nestin过表达转基因小鼠,外源基因可遗传到子代并在脑和肺组织
中稳定表达,为深入研究nestin在肿瘤转移、细胞“干性”的维持和细胞的分化等功能提供了良好的实验动物模型。
     

登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列具有干扰病毒复制的作用

目的构建含有登革Ⅱ型病毒（DENV-2）前膜蛋白（prM）基因反向重复序列（irRNA）的重组质粒,评价其抑制病毒复制的
效果。方法DENV-2接种乳鼠,提取总RNA,在正义和反义引物两端分别加上XhoⅠ和EcoRⅠ的识别位点,将经RT-PCR 扩增
的prM全长基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重组质粒pcDNA-asprM;于另一对正义和反义引物两端引
入酶切位点NheⅠ和BglⅡ,经RT-PCR 扩增prM 全长基因片段插入pMD18-T-vector 中,形成含有正向序列的重组质粒
pMD18-T-prM。限制性内切酶NheⅠ和KpnⅠ分别酶切重组质粒pMD18-T-prM和重组质粒pcDNA-asprM,得到片段prM和线
性化载体pcDNA-asprM,连接构建成含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。筛选的阳性重组质粒pcDNA-irRNA
用脂质体法转染至BHK-21细胞中,半定量PCR和实时荧光定量PCR分析评估该质粒抑制登革病毒复制的效果。结果成功构
建具有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。经转染pcDNA-irRNA的实验组与未转染质粒阳性对照组相比,半定量
PCR结果显示DENV-2攻击96 h后NS3的mRNA表达水平下降28%;实时定量PCR分析显示,DENV-2攻击72 h后实验组病毒
拷贝数比阳性对照组少1.44倍,攻击96 h后实验组的NS1表达量明显低于阳性对照组（P<0.05）。结论DENV-2 prM反向重复
序列具有干扰病毒复制的效果,为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据。
     

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6 的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因
装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染
Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫
小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6 特异性抗体IgG 的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;
ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,
测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处
见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组
（空质粒组和生理盐水对照组）明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对
照组（空质粒组和生理盐水对照组）。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细
胞免疫和体液免疫效应。
     

miRNA-30a/30e腺病毒表达载体的构建

目的构建稳定表达成熟miRNA-30a和miRNA-30e腺病毒表达载体。方法小鼠基因组中分别扩增出带有酶切位点的
mmu-miR-30a、mmu-miR-30e 目的基因,目的基因连接到穿梭质粒pSES-HUS,带有目的基因的穿梭质粒重组到骨架质粒
AdEasy1 上,重组质粒转染到Hek-293 细胞中包装成腺病毒载体,反复扩增之后获得高滴度的pAd-mmu-miR-30a、pAd-mmumiR-
30e 腺病毒。用目的腺病毒分3 组（RFP对照组,miR-30a 组,miR-30e 组）感染小鼠Mefs 细胞,用荧光定量PCR方法检测
mmu-miR-30a、mmu-miR-30e 表达情况。结果分别扩增出带有酶切位点的357 bp mmu-miR-30a,324 bp mmu-miR-30e,并成
功连接到pSES-HUS 上,进一步与AdEasy1 重组,包装得到腺病毒表达载体,通过荧光定量PCR 检测,Mefs 细胞中mmumiR-
30a升高26.46±7.46倍,mmu-miR-30e升高2.76±0.25倍。结论成功构建了成熟miRNA的腺病毒表达载体。
     

Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

接要：目的构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法扩增包含hsa-miR-335前体
序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至
psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),
以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因
RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-
RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负
相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3’UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表
达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论成功构建了PLVTHM-miR-335 慢病毒重组质粒,构建过表达
miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。
     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立

摘要：目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,
建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水
平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上
清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting 和Real-time
PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成
功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了
干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。
     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达

摘要：目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗
免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau 为模板,用PCR 扩增人Tau 多表位肽段基因,插入表达载体
pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21（DE3）中,经异丙基-β-D-
硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获
取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测
序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。
结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特
异性TauP1/P2抗体。
     

S100A16基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建S100A16基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒,转染3T3-L1小鼠前体脂肪细胞,初步鉴定其干扰效果.方法:以小鼠S100A16基因为靶基因,以PLKO.1-sP6-GFP质粒为载体,根据GenBank数据库提供的S100A16基因核苷酸序列,选择设计2条siRNA干扰序列,构建针对S100A16基因...     

脑心肌炎病毒内部核蛋白体进入位点介导白介素-12基因在B16F1细胞中的表达

目的：研究脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的鼠白介素12(mIL-12)的p40和p35双亚基基因在同一启动子的调控下能否得以有效地表达并形成异二聚体p70。方法：采用脂质体法将表达经脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的p40和p35的质粒mEL-12／AD1-1转染B16F1细胞，连续3d收集并换细胞培养液，并检测其中的mIL-12(p70)量。结果：ELISA结果显示，mIL12(p70)的表达量随着时间推移逐步下降，由第1天的15．5ng／ml逐步下降到第3天的9．3ng／ml。表明mIL-12p40和p35双亚基基因得到有效的表达并加工形成了异二聚体p70。结论：脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的双基因p40和p35在同一启动子的调控下得以同时表达。但其上游和下游的基因蛋白质翻译机制是不同的。     

人乳头瘤病毒16型基因组体外转化活性的研究

目的应用重组的人乳头瘤病毒16型（HPV－16）基因组体外转化NIH／3T3细胞，以评价HPV－16的转化活性。方法将HPV－16基因组正向括人pSV2／neo质粒，构建成pSV2－neo／HPV－16真核细胞表达质粒；用磷酸钙转染法，将其导人体外培养的NIH／3T3细胞；对经转化的细胞进行G418选择培养和核酸杂交分析。结果经选择培养获得了具有恶性表型的转化细胞，其主要表现为接触性抑制消失和非锚地依赖性生长；核酸杂交证明，转化细胞内含有HPV—16DNA序列。结论HPV—16基因组具有体外转化NIH/3T3细胞的活性。     

β防御素2在恶性黑色素瘤B16细胞中的稳定表达及其生物学效应研究

目的 建立稳定表达防御素mBD2的恶性黑色素瘤细胞B16-mBD2,研究mBD2对B16细胞生物学特性的影响.方法 在前期构建好mBD2真核表达质粒的基础上,脂质体法转染恶性黑色素瘤B16细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株B16-mBD2,RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表...     

单纯疱疹病毒荧光标记单克隆抗体的制备及临床应用

目的：为了了解所制备的单纯疱疹病毒荧光标记单克隆抗体的临床应用价值。方法：本研究利用杂交瘤技术制备了多株抗单纯疱疹病毒型共有及型特异性单克隆抗体（6B3－2－5、，Da5,5B4-6)，并通过BALB／C鼠体内诱生制备了较大量的单抗，经去脂澄清处理，利用辛酸－硫酸铵二步法纯化了单抗，经SDS－PAGE及薄层扫描分析显示其纯度，在pH9.0-9.5条件下，采用低温袋内透析法标记了单抗5H4－6及6B3－2－5，然后经透析及SephedexG-50柱去除游离荧光素，标记单抗采用直接免疫荧光法（DFA）检测各类临床标本110份及正常标本26份，并与间接免疫荧光法（IFA）及组织培养分离法作了初步比较，结果：1．纯化后的各单抗在解链状态下为二条链，一条为轻链，分子量各为20．6KD（5B4－6），24．6KD（6D3－2－5）及26．1KD（Da5)，一条为重链，分子量各为57．8KD（5B4－6），54．8KD（6B3－2－5）及52．7KD（Da5)，由此推算出其单抗分子量各为157KD，159KD，158KD，纯化回收率各为43．77％，47．21％及38．8％，2．标记单抗F／P值各为1．4及1．46，利用（DFA）法测定其效价各为1：32及1：16，。6．DFA与IFA的符合率达100％，而以组织培养法为“金标准”，其敏感性，特异性，阳性预测值及阴性预测值各为94％，95％，94％及95％，结论：这些单抗具有较好的应用价值。值得进一步研究及开发应用。     

pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达

目的：克隆小鼠分泌型Hemopexin (sPEX) 编码区的cDNA序列,构建含Egr-1启动子的pEgr-sPEX真核表达载体,检测辐射诱导重组质粒在B16F10细胞中的表达。 方法：用RT-PCR从NIH3T3细胞中扩增出sPEX,经测序证实后,构建pEgr-sPEX重组质粒,以脂质体转染B16F10细胞,用Western blotting方法检测B16F10细胞上清中辐射诱导PEX的表达。 结果：测序表明扩增的sPEX cDNA序列与GenBank中登录的序列完全一致,sPEX cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1-Egr-1,转染入B16F10细胞内PEX基因在体外辐射诱导下成功获得表达。结论：成功地克隆了小鼠sPEX基因,并在体外证实了pEgr-sPEX具有辐射诱导表达特性。     

侵袭性肺炎链球菌148株血清型、耐药性及分子分型研究

目的 研究临床分离的侵袭性肺炎链球菌血清型分布、耐药性及分子流行病学特点,为抗生素的应用和免疫预防提供参考依据.方法 收集2005年1月至2008年8月全国15个地区148株来自血液、脑脊液等侵袭性感染部位的肺炎链球菌.采用琼脂稀释法测定青霉素等抗生素对148株肺炎链球菌的最低抑菌浓度(MIC);采用简易棋盘式肺炎链球菌分型系统和荚膜肿胀实验进行血清分型;多位点序列分型(MIST)技术对53株19群菌株进行基因分型,了解其与国际流行株的关系.结果 血清分型共检出20个血清型/群,主要集中在19A、19F、3、23F、5、6、14和9血清型/群,共计105株,占70.9%,以19A(22.3%,33/148)、19F(16.9%,25/148)最常见,其次为3群(7.4%,11/148)和23F(6.8%,10/148).7价疫苗(PCV7)在2岁以下儿童中的覆盖率为33.3%(12/36).PCV7相关血清型肺炎链球菌对阿莫西林/克拉维酸、红霉素等耐药率均明显高于非疫苗相关血清型菌株(P<0.05).53株19群肺炎链球菌MIST分析共检出9种序列型(ST),其中以ST320(28/53,52.8%)和ST271(12/53,22.6%)为主.结论 我国侵袭性肺炎链球菌血清分型以19A、19F、3和23F血清型为主.侵袭性肺炎链球菌耐药情况严重.     

人乳头状瘤病毒16E7在人喉癌细胞系中的转染及表达

目的:构建含人乳头状瘤病毒16E7(HPV16E7)基因的真核表达载体,观察HPV16E7对人喉癌HEp-2细胞系生物学特性的影响,为后续实验提供研究对象.方法:以含HPV16E7基因的中间质粒pET28a-HPV16E7为模板扩增出HPV16E7基因全长序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,并进行序列分析和酶切鉴定.电穿孔法将重组体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入喉癌HEp-2细胞中,Western 印迹法检测HPV16E7蛋白的表达,相差显微镜观察转染前后的HEp-2细胞系形态学变化,流式细胞仪检测转染前后细胞生长周期的改变.结果:成功构建并将pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入人喉癌HEp-2细胞中;转染后HEp-2细胞增生活跃,S期明显延长,并能够稳定表达HPV16E7蛋白.结论:HPV16E7有促进HEp-2细胞的致瘤活性;真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7可为下一步建立动物模型和喉癌体外治疗实验提供研究工具.     

pEGFP-IL-24对B16F0细胞抑制效应的实验研究

目的:构建IL-24真核表达质粒,研究其体内外表达对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-IL-24。用脂质体法将重组质粒及空载体体外转染B16F0细胞后,经激光扫描共聚焦显微镜观察其表达,用MTT法检测B16F0细胞的体外增殖能力。用小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤生长的抑制。结果:pEGFP-IL-24转染B16F0细胞后,LSM可观察到其表达。IL-24基因转染的B16F0细胞体外增殖能力明显受到抑制。转染IL-24的B16F0细胞体内致瘤率降低。结论:IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。IL-24基因转染的肿瘤细胞体内生长能力显著降低。