NET-1蛋白表达与肝癌临床病理因素相关性探讨

NET-1属于四次跨膜蛋白（TM4S）家族成员,其有显著上调癌形成的作用。我们在研究人体组织中NET-1表达及分析肝与肝癌组织中NET-1表达差异的基础上,通过基因生物工程的方法制备NET-1多克隆抗体,用免疫组织化学方法检测肝癌中NET-1蛋白表达,探讨其临床病理因素的关系。     

人鳞状细胞癌细胞株(A431)中NET-1基因对癌细胞增殖和浸润的影响

目的 探讨小分子干扰核酸(siRNA)对皮肤鳞状细胞癌(简称皮肤鳞癌)细胞株(A431)中NET-1基因的抑制作用,及其基因对癌细胞增殖、浸润的影响.方法 构建针对人NET-1基因的siRNA NET-1真核表达载体(pU6H1-GFP-siRNA NET-1),转染A431细胞后通过半定量RT-PCR检测细胞中NET-1 mRNA水平以筛选较有效的siRNA NET-1.同时设置针对NET-1的正、反义真核表达载体和随机序列对照组siRNA表达载体,体外瞬时转染A431细胞,RT-PCR、Western blot分别检测癌细胞内NET-1 mRNA和蛋白的表达,经免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察NET-1蛋白在细胞内的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪分别榆测A431细胞增殖与占不同细胞周期中细胞增殖指数(PI);划痕试验和Transwell迁移试验分别检测A431细胞的迁移和侵袭能力.结果 测序证实编码NET-1序列的siRNA已经插入载体pU6H1-GFP中U6和H1两个启动子之间,其他载体测序结果 符合设计要求.pU6H1-GFP载体转染A431细胞后其转染率达到80%.转染siRNA NET-1和反义NET-1后分别与未转染组比较,A431细胞中NET-1 mRNA分别减少72%和62%(t值分别为-36.01,-17.65;均P<0.05)和蛋白表达水平分别减少61%和69%(t值分别为-21.13,-33.14;均P<0.05);在转染48 h后能显著抑制A431细胞的增殖、迁移和浸润(均P<0.05).在转染对照组siRNA后并未见到明显的抑制效果.转染正义NET-1后,能分别增加细胞内52%NET-1 mRNA和49%蛋白表达水平(t值分别为12.49,13.98,均P<0.01).结论 靶向NET-1的siRNA真核表达载体能特异、有效的下调NET-1基因蛋白的表达,并抑制A431细胞增殖、迁移和浸润.进而证明内源性NET-1基因的功能与A431细胞增殖、迁移、浸润有关.靶向NET-1的siRNA显示基因抑制效率比反义核酸技术更好.     

NET-1通过激活EMT过程促进肺鳞癌转移

目的:探讨神经上皮细胞转化基因1(NET-1)表达对肺鳞癌(LSC)转移的影响及分子机制。方法:免疫组化检测53例肺鳞癌(LSC组)、24例正常肺上皮(NLE组)及27例肺鳞状上皮内病变(SIL组)组织中NET-1蛋白的表达,并统计分析其表达水平与临床病理因素的相关性;Western blot实验检测人肺鳞癌细胞系H226、H1703、H2170、SK-MES-1、H520和YTMLC-90中NET-1的表达;构建针对NET-1基因的RNA干扰重组腺病毒(Ad-NET-siRNA)及含对照序列的重组腺病毒(Ad-control)感染人肺鳞癌细胞YTMLC-90;Western blot实验检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B及人肺鳞癌细胞YTMLC-90中各组NET-1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)蛋白和Snail1蛋白的表达变化;通过qPCR实验检测各组细胞E-cadherin和vimentin的mRNA表达;利用Transwell小室侵袭实验检测各组细胞侵袭能力的变化。结果:LSC组中NET-1的阳性表达率显著高于NLE组和SIL组(P0.05)。NET-1蛋白阳性表达人群的分布与组织学分级、是否有淋巴结转移以及TNM分期相关,其中淋巴结有转移组的NET-1表达率显著高于淋巴结无转移组。体外实验发现,YTMLC-90细胞中的NET-1蛋白过表达并促进细胞侵袭,并且在YTMLC-90细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达降低,vimentin的mRNA和蛋白以及Snail1蛋白表达升高;而随着敲减NET-1的表达,YTMLC-90细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达升高,vimentin的mRNA和蛋白以及Snail1蛋白表达降低。结论:NET-1表达可促进肺鳞癌淋巴转移,这种促进作用可能是通过表达NET-1从而激活上皮-间充质转化(EMT)过程实现的。     

NET-1活化NF-κB信号途径促进子宫颈鳞癌微血管生成

目的 探讨NET-1表达与子宫颈癌微血管生成的关系及其分子机制。方法 采用免疫组化Max Vision法检测80例子宫颈鳞癌、10例慢性子宫颈炎组织中NET-1、NF-κB p65、VEGF蛋白表达。采用CD34内皮标记,结合Weinner计数法检测子宫颈鳞癌组织的微血管密度(microvascular density,MVD)。通过阳离子脂质体将真核表达质粒p CMV6-NET-1转染子宫颈鳞癌细胞以获得NET-1基因过表达;利用NF-κB特异抑制剂PDTC处理子宫颈鳞癌细胞以抑制NF-κB的激活;应用Western blot法检测细胞蛋白的表达。结果 子宫颈鳞癌组织中NET-1呈高表达,NET-1表达与子宫颈鳞癌MVD、NF-κB p65和VEGF蛋白表达呈正相关。NET-1基因转染引起子宫颈鳞癌Si Ha细胞胞核NF-κB p65和胞质VEGF水平上高,应用NF-κB抑制剂PDTC预处理Si Ha细胞能显著抑制NET-1引起的VEGF表达上调。结论 NET-1促进子宫颈鳞癌微血管生成,其机制与NET-1激活子宫颈鳞癌NF-κB信号途径上调VEGF表达有关。     

肝癌中NET-1基因表达和意义

目的 研究NET-1基因在人体组织中的表达，以确定该基因是否可作为恶性特异性的标记。方法 在47种人类不同的正常组织与肿瘤组织cDNA中用RT-PCR方法研究NET-1基因表达，进一步在13例人肝正常组织与癌组织cDNA中用半定量PCR分析NET-1基因表达的意义。结果 胰腺、肝脏(包括成人和胎儿肝)、心、骨髓组织和造血细胞中NET-1阴性表达。11种恶性肿瘤组织和细胞中，除了造血系统恶性肿瘤(淋巴瘤和白血病)外，其它组织均为NET-1阳性表达。特别在4例肝癌组织标本中发现均有NET-1基因表达(100％)，2例癌旁肝组织显示一个弱的阳性信号。结论 NET-1基因在人体正常组织、肿瘤组织和细胞中表达不同，特别是NET-1基因表达于肝癌组织而不表达于正常肝组织。提示NET-1基因可能是肝癌临床诊断的一个潜在的组织标记。     

Survivin shRNA对食管癌细胞c-myc、核因子-κB基因表达的影响

目的探讨Survivin对c-myc、核因子(NF)-κB基因的调控作用。方法 shRNA干扰沉默食管癌ECA109细胞系中Survivin基因表达,观察c-myc、NF-κB基因的表达变化,流式细胞术检测细胞周期的改变。结果1.食管癌ECA109细胞系中,Survivin shRNA干扰下调Survivin表达后,c-myc mRNA及蛋白的表达水平明显降低;2.Survivin表达后,NF-κB mRNA及NF-κB总蛋白无明显变化,但其蛋白活化表达水平明显降低,NF-κB上游调控核因子κB抑制物激酶(IKK)α、IKKβmRNA表达下调; 3.Survivin表达下调导致G2期延长,G2期细胞比例增加,细胞增殖阻滞。结论 Survivin在转录及蛋白水平对c-myc具有正向调控作用,Survivin表达下调抑制了IKKα、IKKβmRNA的表达及NF-κB的磷酸化。     

胃癌NET-1、Ki-67表达及意义

目的 研究胃癌组织中NET-1和Ki-67表达与其预后的关系.方法 分别应用免疫组化EnVision两步法检测86例胃癌组织中NET-1和Ki-67的表达,对两指标均阳性病例行免疫组化双标双染方法,原位检测两指标的表达特点和比邻关系.所有病例随访60月以上.结果 胃癌组织中 NET-1和Ki-67高表达分别为56.98%和74.42%,两指标阳性表达呈正相关(P<0.01).两指标高表达分别与癌分化呈负相关(均P<0.01);与癌临床分期呈正相关(均P<0.05);与患者生存率呈负相关(均P<0.05),其3年、5年生存率均低于相应的低表达组或阴性组(P<0.05,P<0.01);NET-1表达还与癌淋巴结转移呈正相关(P<0.01).结论NET-1、Ki-67基因蛋白高表达反映胃癌细胞群体增殖活性,上调癌进展,预后较差.     

Survivin蛋白表达与胃癌发生发展的关系及意义--组织芯片技术研究

目的探讨凋亡抑制基因Survivin编码蛋白表达与胃癌发生发展的关系及其相关分子病理学机制。方法采用组织芯片仪(M icroarrayer,Beecher Instrum ents,USA)构建含98例胃癌及其癌前病变的直径1.0 mm的225个微组织阵列芯片,免疫组织化学方法检测分析survivin蛋白表达情况。结果胃癌及其癌前病变组织芯片蜡块组织阵列排列整齐,常规切片组织形态良好。凋亡抑制基因survivin编码蛋白在胃癌组织中的表达阳性率显著高于正常胃黏膜、肠上皮化生、不典型增生组织中的表达(P<0.01),胃癌转移组survivin蛋白表达阳性率显著高于无转移组(P<0.05)。Survivin蛋白表达与胃癌病理分期、组织学类型和大体类型没有相关性(P>0.05)。结论组织芯片技术在人胃癌早期诊断中具有其他组织病理学技术不可替代的高效、省时、低消耗的优点。Survivin在胃黏膜癌变过程中被激活而参与胃癌的发生和发展,可作为一个较为理想的肿瘤标志物用于胃癌的早期诊断和转移的预警。     

新疆哈萨克族食管癌中Survivin的表达及其与Caspase-9和Caspase-3基因的相关性

目的 探讨新疆哈萨克族食管癌中Survivin基因表达及其与半胱氨酸蛋白Caspase-9、Caspase-3基因的关系.方法 首先从52例哈萨克族食管癌标本中筛选出34例Survivin mRNA差异表达的标本(癌组织中的表达量高于远端无癌组织),采用RT-PCR、Western blotting方法检测半胱氨酸蛋白Caspase-9、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达.结果 1.Survivin在新疆哈萨克族食管癌组织高表达,差异具有统计学意义(P＜0.05);2.在Survivin差异表达的34例标本中,61.8％的肿瘤组织半胱氨酸蛋白Caspase-9低表达,并且Survivin mRNA与Caspase-9 mRNA的表达呈负相关(r=-0.244,P＜0.05);3.哈萨克族食管癌组织中,Caspase-9的蛋白活化降低(P＜0.05).结论 Survivin表达上调在新疆哈萨克族食管癌的发生、发展过程中发挥重要作用,Survivin可能通过直接抑制Caspase-9的转录以及抑制其活化水平发挥调控细胞凋亡的作用.     

Survivin特异小干扰RNA表达载体构建及对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的测定Survivin特异小干扰RNA(siRNA)表达载体对肺腺癌细胞A549 Survivin基因表达的抑制及对增殖和凋亡的影响。方法构建Survivin特异性小干扰RNA表达载体,转染A549细胞,筛选出稳定表达的细胞株。用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法、Western blot和免疫组化法检测Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果经测序鉴定证实成功构建Survivin-siRNA表达载体。Survivin基因mRNA表达量下降76.4%,Western blot显示蛋白表达下降84.5%,免疫组化法也显示Survivin蛋白表达下降。MTT法测定细胞增殖较对照组减慢(P<0.01),细胞凋亡率较对照组增加8.95%(P<0.01)。结论Survivin特异siRNA表达载体下调Survivin基因表达,抑制A549细胞的增殖,促进凋亡。     

检测膀胱肿瘤Survivin蛋白及其mRNA表达的临床意义

目的为明确Survivin作为膀胱肿瘤患者的肿瘤诊断和监测标志物的可能性,我们检测了Survivin在膀胱肿瘤和非肿瘤患者病变组织的Survivin蛋白及其mRNA表达情况。方法从我科住院病人和膀胱镜检患者中获取31例膀胱癌患者(实验组)和24例非肿瘤患者(对照组)的组织标本,用免疫组织化学法(IHC)和RT-PCR检测Survivin蛋白和基因在肿瘤组织和非肿瘤组织中的表达情况。并对结果行相应的统计学分析。结果IHC检测实验组和对照组Survivin蛋白的阳性率分别为74%(23/31)和4%(1/24),χ2检验P<0.001,IHC的阳性率与肿瘤的分级分期有一定的关系;实验组和对照组RT-PCR检测Survivin mRNA的表达阳性率分别为90%(30/31)和4%(1/24),χ2检验P<0.001。结论膀胱肿瘤组织Survivin蛋白和基因的表达量高于对照组,因此,Survivin有望成为膀胱瘤高危人群筛选,肿瘤诊断和监测的工具之一。     

不同瘢痕组织中Survivin蛋白的表达及临床意义

目的分析不同瘢痕组织中Survivin蛋白的表达及临床意义。方法选取58例病理性瘢痕组织,20例正常皮肤组织,检测病理性瘢痕及正常皮肤中Survivin蛋白表达的阳性率、分布情况及Survivin蛋白IOD值。结果光学镜下,病理性瘢痕在表皮基底层、部分棘层和表皮下均可见Survivin阳性细胞,胞浆及部分胞核颜色为棕黄色至褐色;病理性瘢痕组织中Survivin蛋白阳性表达率显著高于正常皮肤(P0.05)。瘢痕疙瘩中和癌变瘢痕中Survivin蛋白IOD值均显著高于增生性瘢痕(P0.05);癌变瘢痕与瘢痕疙瘩中的Survivin蛋白IOD值比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论 Survivin抗凋亡的作用参与了病理性瘢痕形成过程,研究Survivin蛋白的表达对鉴别和诊断不同瘢痕组织有重要的意义。病理性瘢痕组织中Survivin蛋白阳性表达率显著高于正常皮肤,瘢痕疙瘩和癌变瘢痕中Survivin蛋白IOD值显著高于增生性瘢痕,故Survivin蛋白的阳性表达情况及Survivin蛋白IOD值对鉴别和诊断不同瘢痕组织有重要的意义。     

HCV核心基因插入突变体编码蛋白对人肝癌细胞系(Huh-7)细胞基因表达的影响

目的用基因表达分析法鉴定丙型肝炎病毒(HCV)核心(Core，C)区基因插入突变体编码蛋白在人肝癌细胞系(Huh-7)表达，探讨该蛋白生物学功能及其基因表达改变与致病的关系。方法构建HCV-1bc基因插入突变体编码蛋白重组表达质粒，建立表达c基因插入突变体编码蛋白Huh-7细胞系，按Affymetrix公司实验程序制备探针、再与该公司H0u133A和Hg-u133b芯片杂交。对基因表达上调或下调≥3倍的基因，用NetAflk作进一步分析。并用半定量RT-PCR对其中3个上调基因进行鉴定。结果Microarray分析显示，HCV-1b C基因插入突变体编码蛋白比c蛋白引起更多的基因表达改变，主要集中在信号传导、蛋白酶活性、分子转运、免疫反应等，特别是免疫反应基因表达更加显著。C基因插入突变体编码蛋白表达可同时导致凋亡基因／抗凋亡基因表达上调或下调及致癌基因上调。半定量RT-PCR对有趣的致癌基因FHL2、抗凋亡基因PRKCZ和凋亡基因LGALSI的鉴定结果表明，FHL2、PRKCZ和LGALSI基因的表达比空载体转染对照组相同基因明显上调。结论Hcvc基因插入突变体编码蛋白在Huh-7细胞表达对其基因表达有很大影响，其中对免疫反应基因的影响更明显，这一结果对理解HCV C基因插入突变体编码蛋白在HCV致病过程中的作用及其研制抗HCV药物均有重大的参考价值。     

OX40信号上调Survivin表达对CD4+T淋巴细胞增殖存活的影响

目的　探讨OX4 0信号抑制活化后CD4 T细胞凋亡,维持细胞存活及促增殖作用是否与Survivin相关。方法　分离培养小鼠脾脏CD4 T淋巴细胞,以去除T细胞的脾细胞作为抗原呈递细胞,交联CD3单克隆抗体活化T细胞。用免疫印迹法比较不同时相点,加入OX4 0抗体及转染Survivin负显性突变体基因后,CD4 T细胞中Survivin蛋白表达差异。流式细胞仪检测AnnexinV染色后细胞凋亡数量。〔3H〕TdR掺入法测细胞增殖。结果　CD4 T细胞活化后2～8d ,OX4 0抗体刺激可明显增强Survivin表达,并减少2 5 %细胞凋亡;Survivin突变体降低Survivin蛋白表达后使凋亡增加2 2 %。结论　OX4 0信号能够通过上调Survivin表达来抑制CD4 T细胞凋亡,从而维持细胞存活和增殖。     

Survivin基因沉默鼻咽癌G666-1细胞的生物学特性

背景：Survivin基因是迄今发现的最强效的凋亡抑制因子,能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移能力,成为近年有关肿瘤研究的热点之一。目的：探讨Survivin基因沉默对鼻咽癌G666-1细胞生物学特性的影响。方法：设计及合成Survivin的siRNA序列,Lipofectamine^TM 2000转染G666-1细胞,利用RT-PCR、Western blot检测Survivin基因沉默后的G666-1细胞Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测G666-1细胞中肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺的表达变化。另外还采用CCK-8增殖实验、划痕愈合实验、细胞侵袭实验评价Survivin基因沉默对鼻咽癌G666-1细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。结果与结论：与对照组、空白组比较,实验组Survivin 基因沉默后的鼻咽癌G666-1细胞Survivin mRNA及蛋白表达显著降低,差异有显著性意义(P < 0.05);与对照组、空白组比较,实验组Survivin 基因沉默后的鼻咽癌G666-1细胞的生长速度明显减慢,增殖能力受到抑制,迁移能力和侵袭能力显著下降,差异有显著性意义(P < 0.05);肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺的表达比例显著降低(P < 0.05)。结果表明特异性干扰Survivin基因表达可抑制鼻咽癌G666-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力,使具有CD44⁺CD133⁺肿瘤干细胞特性的细胞比例降低,因此,Survivin基因沉默可能成为有效治疗鼻咽癌的新靶点。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

Survivin基因mRNA和蛋白在鼻咽癌中的表达

目的 观察survivin基因mRNA及蛋白在鼻咽癌的表达及其与临床的关系.方法 采用原位杂交和免疫组织化学技术,分别检测survivin基因及蛋白的表达情况.结果 在64例鼻咽癌中,survivin基因mRNA阳性表达42例(65.6%),其中高表达30例(46.9%);在有详尽诊疗资料的22例鼻咽癌中,Ⅲ+Ⅳ期阳性表达率为66.7%,高于Ⅰ+Ⅱ期的50.0%.Survivin蛋白阳性表达46例(71.9%),其中高表达38例(59.4%);Ⅲ+Ⅳ期阳性表达率为61.1%,高于Ⅰ+Ⅱ期的50.0%.Survivin基因表达与鼻咽癌患者的年龄、性别无相关性(P＞0.05).30例慢性鼻咽炎患者鼻咽部组织survivin基因mRNA及蛋白阳性表达分别为10例(33.3%)及7例(23.3%),均低于鼻咽癌组,差异均有统计学意义(γ2=12.04和γ2=19.57,均P＜0.01).64例鼻咽癌中survivin基因mRNA及蛋白共同表达阳性者36例(56.2%),经相关检验它们的表达呈正相关(关联系数(4)=0.43).结论 Survivin基因表达可能在鼻咽癌发生、发展过程中起一定作用,检测survivin基因mRNA和蛋白在鼻咽癌中的表达对鼻咽癌的诊断、临床分期和预后有参考的价值.     

免疫缺陷病毒反式激活子rev能调控病毒调节基因的表达

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)可编码两种具有反式作用的核蛋白、tat和rev,其功能性表达在体外为病毒复制所必需。tat蛋白可显著促进HIV-1结构和调节基因的表达,而rev基因产物(以前被称为art或     

肿瘤标志物SURVIVIN及P27蛋白在肾细胞癌中表达的临床意义

目的：探讨新的凋亡相关基因Survivin蛋白和p27蛋白肿瘤标志物在人肾细胞癌中的表达及临床意义。方法：采用免疫组化SP法分别测定50例肾癌和12例正常肾组织中Survivin蛋白及p27蛋白的表达,并分析其与肾癌临床、病理的关系。结果：Survivin蛋白在肾癌组织中表达阳性率为68%（34/50）,而正常组织中未见表达,两者有统计学意义（P〈0.01）。肾癌中Survivin蛋白的表达与肾癌的病理分级呈正相关（P〈0.05）。而p27蛋白在正常肾组织中的阳性率为83.3%（10/12）,在肾癌组织中的阳性率为42%（21/50）,两者有统计学意义（P〈0.01）。p27蛋白表达与肾癌的分级呈负相关（P〈0.01）。结论：Survivin蛋白表达水平与肾癌的临床分期、淋巴结转移密切相关,且与p27蛋白呈负相关。联检Survivin蛋白和p27蛋白有助于提高对肾癌预后的评估,并可作为判定肾癌生物学行为的客观指标。     

重组人促红细胞生成素对心梗大鼠HIF-1α与Survivin表达的影响

目的探讨重组人促红细胞生成素(rHuEPO)对心梗大鼠心肌缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与生存素(Survivin)表达的影响。方法 45只SD大鼠,随机分为假手术组、心肌梗死组和rHuEPO治疗组。用Western blot方法检测各组大鼠梗死区周围心肌中HIF-1α与Survivin的表达水平,RT-PCR方法检测梗死区周围心肌HIF-1αmRNA与Survivin mRNA表达变化。结果心肌梗死组大鼠心肌梗死区周围心肌HIF-1α蛋白与mRNA的表达水平显著高于假手术组,而Survivin蛋白与mRNA的表达水平则显著降低(P0.01);与心肌梗死组相比,rHuEPO治疗组心肌梗死区周围心肌HIF-1α蛋白与mRNA的表达水平明显降低,而Survivin蛋白与mRNA的表达水平则显著升高(P0.01)。结论 rHuEPO能够抑制心梗大鼠心肌梗死区周围心肌HIF-1α过表达并上调Survivin的表达。     

FEZ1基因在肿瘤组织中的改变

FEZ1基因定位于 8p2 2上 ,编码一个 5 96个氨基酸的亮氨酸锌指蛋白 ,正常组织中广泛表达 ,对多种肿瘤的研究发现其表达有改变。FEZ1蛋白主要调节细胞的有丝分裂。阐明 FEZ1基因在肿瘤发生、演变中的作用 ,有可能为肿瘤的分子生物学研究提供新的思路