DPC4基因对人胰腺癌细胞JF305增殖的影响

目的研究肿瘤抑制基因DPC4(deleted in pancreatic carcinoma)对人胰腺癌细胞系JF305增殖能力的影响.方法将携带DPC4基因的真核表达载体转入JF305细胞内,经G418筛选获得DPC4稳定表达细胞株,免疫细胞化学和RT-PCR法检测转染前后细胞内DPC4的表达.用MTT法、细胞计数法和流式细胞仪测定细胞生长曲线、细胞周期、细胞贴壁率和细胞克隆形成率.比较转染前后细胞增殖能力的变化.结果未转染及转染空质粒的JF305细胞无DPC4的表达,转染pBK-CMV-DPC4的JF305细胞可检测到DPC4的表达,且其细胞增殖能力较前明显下降(P < 0.001),细胞倍增时间显著延长(由11.8 d延长至18 d),细胞贴壁率和克隆形成率均明显下降(P < 0.0001),G1期细胞所占比例明显增加(P < 0.0001),G2/M期细胞所占比例明显下降(P < 0.0001).结论无DPC4表达的胰腺癌细胞株JF305可转基因获得DPC4稳定表达,DPC4转基因后可抑制其增殖能力,细胞G1期延长,G2/M期缩短.DPC4有望成为胰腺癌基因治疗新的候选基因.     

DPC4基因对人胰腺癌JF305细胞系生长抑制的初步研究

目的研究DPC4基因对人胰腺癌细胞系JF305的生长抑制作用,及DPC4基因与P21d的关系。方法采用脂质体介导法将pBK-CMV-DPC4质粒导入JF305中,经G418筛选培养获得稳定表达细胞株,采用流式细胞仪法,免疫印迹法检测上述3种细胞中DPC4的表达;同时检测P21在DPC4转染前后蛋白表达水平的变化,通过测定细胞生长曲线检测JF305转染DPC4前后生长、增殖等生物学行为的改变。结果转染pBK-CMV-DPC4的JF305细胞DPC4基因表达较前增加,而未转染及转染空质粒的细胞DPC4表达无明显改变。通过MTT法测定发现转染pBK-CMV-DPC4的JF305细胞增殖能力同未转染及转染空质粒的JF305细胞相比明显受到抑制。与未转染及转染空质粒的JF305细胞相比,转染pBK-CMV-DPC4的JF305细胞中的周期蛋白激酶抑制物P21表达明显增加。结论重组DPC4基因转染人胰腺癌细胞系JF305后,可明显的抑制其生长、增殖能力,进而使其恶性程度下降。DPC4基因可能是通过上调周期蛋白依赖性激酶抑制P21蛋白表达而抑制细胞周期,抑制胰腺癌细胞的生长。     

DPC4基因通过mTOR信号通路诱导胰腺癌细胞自噬

目的验证过表达DPC4基因对胰腺癌细胞增殖侵袭的抑制作用,探讨mTOR信号通路对其激活自噬的调控作用。方法构建DPC4过表达载体,转染胰腺癌JF305细胞,CCK-8、Transwell检测其对胰腺癌JF305细胞的增殖侵袭能力,透射电镜观察自噬小体,Western blotting法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1的表达。结果过表达DPC4可以抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭;激活自噬,电镜下DPC4过表达细胞中自噬颗粒明显增多;自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ在过表达DPC4的JF305细胞中表达升高,同时下调p-mTOR和p-4EBP1的表达水平。结论 DPC4基因可以抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭能力,其作用机制与抑制mTOR信号通路、激活自噬相关。     

p15~(INK4B)基因对人胰腺癌细胞系BxPC3增殖的影响

目的 探讨p15~(INK4B)(p15)基因转染对人胰腺癌细胞系BxPC3细胞增殖的影响.方法 采用脂质体将pCDNA3.1(+)-p15质粒及阴性对照pCDNA3.1(+)-neo质粒转染BxPC3细胞,以亲本细胞作为对照组.应用RT-PCR检测细胞p15 mRNA表达;Western blotting检测细胞p15蛋白表达;MTT法检测细胞增殖;透射电镜观察细胞超微结构变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率.结果 p15转染组细胞恢复p15 mRNA和蛋白表达.培养第2天生长被抑制,至第7天,生长抑制率达47.9%.G_0/G_1期细胞占(61.56±3.96)%,显著高于空质粒转染组的(47.44±6.35)%和对照组的(49.22±7.23)%(P<0.05).出现明显的G,凋亡峰,细胞凋亡率为(5.27±1.04)%,显著高于空质粒转染组的(0.11±0.06)%和对照组的(0.09±0.07)%(P<0.05).透射电镜观察到p15转染组发生细胞凋亡.结论 体外p15基因转染可以抑制人胰腺癌细胞系BxPC3细胞增殖,并能诱导其凋亡.     

石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4第5／6、7、9、10外显子基因改变的检测

目的研究石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4第5／6、7、9、10外显子基因的改变。方法用聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)银染技术检测46例石蜡包埋胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织中DPC4基因的缺失和突变。结果 5例胰腺癌未扩增出DPC4条带,DPC4基因第75／6、7、9、10外显子的纯合性缺失率为10．9％(5／46)；1例胰腺癌可见异常泳动带,基因突变率为2．2％(1／46)。结合以前实验,DPC4基因所有外显子的纯合性缺失率为39．1％(18／46),基因突变率为23．9％(11／46),总改变率为58．7％(27／46)。27例有基因改变的胰腺癌除1例外均为中、低分化腺癌,中、低分化组与高分化组之间的差异有显著性(P<0．01)。结论 DPC4作为一种抑癌基因,其改变在胰腺癌的形成中可能起重要的作用。DPC4基因改变与胰腺癌细胞分化程度密切相关。     

Caveolin-1对胃癌细胞系MGC803细胞生长的影响

目的:研究Caveolin-1对胃癌细胞增殖、分化的影响,以探讨Caveolin-1作为基因治疗的候选基因的可能性．方法:运用基因重组技术,将人全长 Caveolin-1基因稳定转染胃癌细胞系MGC803．建立能稳定表达Caveolin-1的胃癌细胞系．同时建立空载体转染的MGC803细胞系作为空白对照,另用PD98059处理48 h作为阳性对照．以重组细胞系作为研究模型,通过免疫细胞化学及Western blot确认Caveolin-1蛋白在被转染细胞中的稳定表达．运用光学显微镜观察转染前后MGC803细胞形态的变化;另运用细胞计数检测了Caveolin-1对MGC803细胞生长的影响,流式细胞术分析了Caveolin-1对MGC803 细胞周期分布的影响．结果:Western blot结果显示,基因转染组及阳性对照组细胞中Vaveolin-1表达比未处理组细胞中明显增强(P<0．001,q值分别为23．067 与13.3376),且基因转染组中Caveolin-1表达比阳性对照组更强(P<0．00l,q=9．7294);基因转染后的MGC803细胞形态发生明显变化,由异形性明显、核大、胞质很少、核分裂明显变得形态较一致、胞质丰富、核／质比明显变小、核分裂相很少见;基因转染后细胞的群体倍增时间明显延长,由46．67 h延长至65．46 h,差异有统计学意义(P<0．05,q =4．8695):基因转染后细胞周期分布发生了明显变化,G0／G1期细胞数明显增多(P<0．01, q=9．1824),S期细胞数明显减少(P<0．01,q= 7．827),G2／M期细胞数无明显变化(P>0．05), Caveolin-1基因转染组与阳性对照组间细胞周期分布的变化也有明显差异性(其中G0／G1期 P<0．01,q=4．9323;S期P<0．05,q=3．3295)．结论:Caveolin-1既能诱导MGC803细胞分化又能将其阻滞于G0/G1期,通过延长细胞群体倍增时间而抑制胃癌细胞的体外增殖．     

石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4第5/6、7、9、10外显子基因改变的检测

目的研究石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4第5/6、7、9、10外显子基因的改变.方法用聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)银染技术检测46例石蜡包埋胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织中DPC4基因的缺失和突变.结果 5例胰腺癌未扩增出DPC4条带,DPC4基因第5/6、7、9、10外显子的纯合性缺失率为10.9%(5/46);1例胰腺癌可见异常泳动带,基因突变率为2.2%(1/46).结合以前实验,DPC4基因所有外显子的纯合性缺失率为39.1%(18/46),基因突变率为23.9%(11/46),总改变率为58.7%(27/46).27例有基因改变的胰腺癌除1例外均为中、低分化腺癌,中、低分化组与高分化组之间的差异有显著性(P<0.01).结论 DPC4作为一种抑癌基因,其改变在胰腺癌的形成中可能起重要的作用.DPC4基因改变与胰腺癌细胞分化程度密切相关.     

胚胎干细胞标志物Oct-4在胰腺癌的表达

目的 分析胚胎干细胞标志物Oct-4在胰腺癌组织和胰腺癌细胞株中的表达状况.方法 应用RT-PCR检测Oct-4 mRNA在25例胰腺癌组织以及胰腺癌细胞株SW1990、PC3、JF305和BxPC3中的表达;应用Western blot法检测胰腺癌组织及胰腺癌细胞株中Oct-4蛋白表达;应用异硫氰荧光素 (FITC)标记的流式细胞仪分选法检测Oct-4在胰腺癌细胞株中的表达率.结果 4株胰腺癌细胞株均表达Oct-4 mRNA和Oct-4 蛋白.88%(22/25)胰腺癌组织高表达Oct-4 mRNA和Oct-4 蛋白,其表达率与胰腺癌的分化程度无关.Oct-4在SW1990的表达率为50.21%、BxPC3为68.53%、PC3为66.27%、JF305为67.61%.结论 Oct-4异常表达可能与胰腺癌始发有关,胰腺癌可能来源于胰腺干细胞.     

胚胎干细胞标志物Oct-4在胰腺癌的表达

目的分析胚胎干细胞标志物Oct-4在胰腺癌组织和胰腺癌细胞株中的表达状况。方法应用RT-PCR检测Oct-4mRNA在25例胰腺癌组织以及胰腺癌细胞株SW1990、PC3、JF305和BxPC3中的表达;应用Westernblot法检测胰腺癌组织及胰腺癌细胞株中Oct-4蛋白表达;应用异硫氰荧光素(FITC)标记的流式细胞仪分选法检测Oct-4在胰腺癌细胞株中的表达率。结果4株胰腺癌细胞株均表达Oct-4mRNA和Oct-4蛋白。88%(22/25)胰腺癌组织高表达Oct-4mRNA和Oct-4蛋白,其表达率与胰腺癌的分化程度无关。Oct-4在SW1990的表达率为50.21%、BxPC3为68.53%、PC3为66.27%、JF305为67.61%。结论Oct-4异常表达可能与胰腺癌始发有关,胰腺癌可能来源于胰腺干细胞。     

反义肝素酶基因对胰腺癌细胞体外增殖和侵袭的抑制作用

目的:研究反义肝素酶基因对人胰腺癌SW1990细胞体外增殖和侵袭能力的抑制作用．方法:反义肝素酶基因转染胰腺癌sW1990细胞,并设空载体对照组和空白对照组,以流式细胞仪检测细胞周期;免疫组化、Western blot及RT-PCR检测肝素酶蛋白和mRNA表达;平板克隆形成实验检测细胞增殖活性,Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力．结果:与空白组和空载组比较,反义组细胞周期中S期比例明显减少(18.8％±2．5％vs 36．3％±2．2％,33．2％±2．1％,P<0．01),G1期细胞比例明显升高(66．0％±2．7％vs30．7％±3．2％,39．8％±4．9％,P<0．01);肝素酶蛋白及mRNA表达分别降低34．3％和37．8％:细胞克隆形成数目减少(12．2±2．8 vs 30．8±4．4,28．3±2．7,P<0．01);Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数减少(13．0±3．5 vs 34．8±5．8,29．4±5．6．P<0．01)．结论:反义肝素酶基因抑制人胰腺癌SW1990细胞体外增殖及侵袭能力．     

体外转染PTEN对胰腺癌细胞增殖能力的影响

目的选择PTEN低表达胰腺癌细胞系,探讨体外转染PTEN对该细胞系的影响。方法将PTEN转染到PTEN低表达胰腺癌细胞系,应用RTPCR、免疫组化、克隆形成率及观察裸鼠移植瘤生长等方法检测PTEN对胰腺癌细胞系的影响。结果PTEN在ASPC1细胞呈低表达,ASPC1、ApE、ApEP细胞PTENmRNA表达量和克隆形成率分别为203%、150%、568%和333%、317%、240%;ASPC1细胞转染后PTEN蛋白表达水平升高,血管内皮生长因子蛋白下降,表皮生长因子受体蛋白无明显变化;5周时转染前后荷瘤裸鼠瘤结节体积分别为2027mm3和1424mm3,差异有统计学意义(P<001)。结论PTEN低表达ASPC1细胞系经转染PTEN后细胞增殖活性及裸鼠致瘤能力明显降低。     

Effect of deleted pancreatic cancer locus 4 gene transfection on biological behaviors of human colorectal carcinoma cells

AIM: To investigate the effect of deleted pancreatic cancer locus 4 (DPC4) gene transfection on biological behaviors of human colorectal carcinoma cells and the role of DPC4 gene in colorectal carcinogenesis. METHODS: PcDNA3.1-DPC4 plasmid was re-constructed by gene-recombination technology. SW620 cells, a human colorectal carcinoma cell line, were transfected with PcDNA3.1-DPC4 plasmid using lipofectamine transfecting technique. Transfected cells were selected with G418. Expression of Smad4 protein was detected in cells transfected with DPC4 gene by immunohistochemistry and Western blot. Biological characterristics of transfected cells were evaluated by population-doubling time and cloning efficiency. Alterations of percentage of S phage cells (S%) and apoptosis rate were determined by flow-cytometry. RESULTS: PcDNA3.1-DPC4 plasmid was constructed successfully. SW620 cells transfected with PcDNA3.1-DPC4 plasmid (DPC4+-SW620 cells) showed a strong intracellular expression of Smad4 protein, and the positive signal was localized in cytoplasm and nuclei, mainly in cytoplasm, where the expressions of Smad4 protein in SW620 cells transfected with PcDNA3.1 plasmid (PcDNA3.1-SW620 cells) and non-transfected SW620 cells (SW620 cells) were weaker than those in DPC4+-SW620 cells. The population-doubling time in DPC4+-SW620 cells (116 h) was significantly longer than that in SW620 cells (31 h) and PcDNA3.1-Sw620 cells (29 h) (P<0.01). The cloning efficiencies of DPC4+-SW620 cells (12%) were markedly lower than those of SW620 cells (69%) and PcDNA3.1-Sw620 cells (67%) (P<0.01). Compared with SW620 cells and PcDNA3.1-Sw620 cells, the Go-G1% of DPC4+-SW620 cells was obviously higher and the S% was markedly lower (P<0.05). Apoptosis rate of DPC4+-SW620 cells was significantly higher than that of SW620 cells and PcDNA3.1-SW620 cells. CONCLUSION: PcDNA3.1-DPC4 plasmid can be successfully re-constructed and stably transfected into human SW620cells, thereby the cells can steadily express Smad4. DPC4 protein may regulate proliferation of colorectal carcinoma cells by inhibiting cell growth and inducing cell apoptosis.     

Construction of targeted plasmid vector pcDNA3.1-Egr.1p-p16 and its expression in pancreatic cancer JF305 cells induced by radiation in vitro

To construct pcDNA3.1-Egr.1p-p16 recombinant plasmid and investigate the expression of p16 in pancreatic cancer JF305 cells induced by radiation and the feasibility of gene radiotherapy for pancreatic carcinoma.     

APO-1基因转染及其抑制大肠癌细胞生长的实验研究

目的 建立表达外源性APO-1基因的大肠癌细胞株,观察APO-1表达细胞株在APO-1抗体作用下对体外培养的大肠癌细胞的抑制效应。方法 采用分子克隆技术将APO-1基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间。以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞HT-29,用G418筛选克隆细胞。以Northern blot检测转导细胞APO．1mRNA的表达。MTT法和直接记数法以及软琼脂集落形成实验检测转导株在APO-1抗体作用下的细胞增殖水平、生长曲线及细胞克隆形成率。结果 成功地构建了真核表达载体pBK-CMV／APO-1cDNA。转导细胞并经筛选后,获得了2株稳定的抗性细胞,从而建立了APO-1基因表达株(HT-29APO．1cells)。杂交结果表明,转导株APO-1mRNA水平的表达明显高于非转导株。转导细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比非转导株更为缓慢和处于抑制状态,集落形成能力低下,但差异无显性意义,而在APO-1抗体作用下效果更为显,差异有非常显性意义。结论 APO-1基因在大肠癌细胞中处于低表达状态;通过真核表达载体的介导,APO-1基因导人大肠癌细胞后,能有效地表达APO-1 mRNA。APO-1表达细胞株在APO-1抗体的作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖,其作用机制与APO-1诱导细胞凋亡有关。     

上调Periostin基因表达对人胃癌细胞增殖的影响

背景：有文献报道,在内源性periostin低表达的人肿瘤细胞株中,过表达periostin基因可抑制细胞的非贴壁依赖性生长,提示该基因具有肿瘤抑制功能。但亦有较多研究发现periostin在一些肿瘤细胞中呈高表达,并可促进其生长、侵袭和转移。目的：探讨上调periostin基因表达对人胃癌细胞增殖的影响。方法：构建、鉴定pcDNA3.1-periostin重组质粒并稳定转染人胃癌细胞株SGC7901和MGC-803,同时设置空载体稳定转染组和不予转染的对照组。蛋白质印迹法检测各组细胞periostin蛋白表达,MTT实验检测细胞活力。结果：pcDNA3.1-periostin重组质粒构建成功。periostin稳定转染组SGC7901和MGC-803细胞periostin蛋白相对表达量明显增高,分别约为相应空载体稳定转染组的2.5倍和4倍（P〈0.05）;MTT实验显示两组细胞在5 d培养过程中的细胞活力均与相应对照组相似,两组间差异亦无统计学意义。结论：稳定转染pcDNA3.1-periostin重组质粒能使人胃癌细胞过表达periostin基因,但periostin基因过表达对人胃癌细胞,至少是本研究检测的两株胃癌细胞的增殖能力无明显影响。     

EEF1A2基因对胰腺癌细胞生长和增殖的影响

目的 探讨EEF1 A2转基因对胰腺癌细胞SW1990生长和增殖的作用.方法 应用腺病毒载体将EEF1A2基因转染人胰腺癌细胞SW1990,采用MTT法检测细胞的增殖,软琼脂克隆形成试验检测细胞的生长,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果 带EEF1 A2的腺病毒感染SW1990细胞后,EEF1 A2 mRNA表达增加,72 h的A750值为1.2996±0.2091,培养6 d的细胞数为81250±1767,14 d的克隆形成率为82%,均较空载体腺病毒组和PBS组显著增加(P<0.05);G1期细胞比例为28.5%,S期细胞比例为60.9%,前者较空载体腺病毒组和PBS组显著减少,后者较空载体腺病毒组和PBS组显著增加(P<0.05).结论 EEF1 A2基因可以显著促进人胰腺癌细胞SW1990的生长和增殖.     

miR-101在胰腺癌组织中的表达以及对胰腺癌细胞ASPC-1增殖的影响

目的 观察miR-101在胰腺癌组织中的表达,探讨其对胰腺癌细胞增殖的影响.方法 采用实时定量PCR方法 检测miR-101在胰腺癌组织、癌旁组织和胰腺癌细胞株ASPC-1中的表达.通过基因重组技术构建miR-101的表达载体peGFPc1-miR-101,应用脂质体将其转染到ASPC-1细胞,荧光显微镜检测转染效率;实时定量PCR检测转染细胞miR-101的表达水平,以癌旁正常胰腺组织为1,折算成相对倍数;MTT法检测转染细胞的增殖率.利用在线软件targetScan预测miRNA可能的靶基因.结果 miR-101在胰腺癌组织和胰腺癌细胞株ASPC-1中相对表达量分别为55%和39%,较癌旁正常胰腺组织显著降低(P＜0.01).peGFPc1-miR-101转染ASPC-1细胞后,miR-101表达增加,为对照组的19.8倍(P＜0.01),癌细胞增殖率明显降低,最低仅为原代细胞的26%(P＜0.01).EZH2基因是miR-101影响胰腺癌细胞增殖活力的可能靶基因.结论胰腺癌组织miR-101低表达,它可能通过抑制EZH2的表达调控细胞的增殖.     

垂体腺苷酸环化酶激活多肽对胰腺癌细胞的生长调控

目的 观察垂体腺苷酸环化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)对人胰腺癌细胞株的生长调控作用;并确定神经鞘磷脂是否作为第二信使参与受体后信息传导。方法 人胰腺癌细胞株JF305,HS766T,ASPC－1进行细胞培养,传代。分别加入不同浓度的PACAP1－38（10^-6-10^-12mol/L)于三种癌细胞中。应用MTT法观察细胞增程度。薄层层析法测定细胞神经鞘磷脂。放射免疫法测定细胞内cAMP含量。Fura-2/AM测定细胞内游离Ca^2 浓度。结果 PACAP1－38促进JF305,HS766T,ASPC－1细胞的生长;PACAP1－38增加细胞内神经鞘磷脂、cAMP、Ca^2 的生长;生长抑素可明显抑制PACAP1－38诱导的JF305细胞的生长等作用。结论 PACAP1－38促进人胰腺癌细胞株的增殖。PACAP受体后信息传递途径;（1）腺苷 酸环化酶途径;（2）钙－钙调素途径。神经鞘磷脂作为第二信使也参与此过程。