不同方式的低能量激光照射对MG-63细胞周期和细胞凋亡的影响

目的 探讨不同方式的低能量激光照射(LLLI)对MG-63细胞周期和细胞凋亡的影响.方法 将对数生长期的人成骨样细胞MG-63随机设为3组,采用Ga-Al-As半导体激光器(808 nm,66 mW)进行照射.照射Ⅰ组照射3 d,每天照射剂量1.25 J/cm~2;照射Ⅱ组照射1 d,照射剂量3.75 J/cm~2;两组的照射总剂量均为3.75 J/cm~2;对照组不进行激光照射.照射后72 h,采用流式细胞术分别检测各组的细胞周期和细胞凋亡率.结果 与对照组相比,照射Ⅰ组和照射Ⅱ组的S期细胞数增加,G_1期细胞数减少,细胞增殖指数增加(P＜0.05),且两个照射组之间无明显差异(P＞0.05).与对照组相比,照射Ⅰ组和照射Ⅱ组的细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),且两个照射组之间无明显差异(P＞0.05) .结论 总剂量为3.75 J/cm~2的LLLI可以通过改变细胞周期时相促进细胞增殖,并能抑制细胞凋亡.在相同的照射剂量下,多次照射和单次照射无明显差别.     

光动力效应与硬化剂对静脉血管内皮细胞的影响

目的 观察静脉血管内皮细胞在光动力和硬化剂作用后的改变,以探讨光动力疗法在 食管静脉曲张治疗中的应用价值。方法 ECV304人脐静脉血管内皮细胞系进行培养,加入含2.5、 5、10、20 mg／L血啉甲醚的培养液,以激光进行照射,功率密度为15 mW／cm2,时间为5、10 min,采用 MTT比色法测定细胞存活率;绘制细胞生长曲线;观察光动力和硬化剂作用导致的静脉血管内皮细 胞形态学改变。结果 随血啉甲醚剂量或激光照射量的增加,细胞存活率逐渐降低。在血啉甲醚为 110 mg／L、激光照射时间为10 min,或血啉甲醚为20 mg／L、激光照射时间为5 min时,细胞存活率低于 50％。正常血管内皮细胞在培养2 d后进入指数生长期,表现为S型曲线;光动力作用后细胞生长缓 慢,2 d后细胞开始减少,无指数生长期,表现为低平生长曲线,第2、3、4、5、6d光动力作用组细胞数 明显低于正常对照组(P均<0.01)。正常培养内皮细胞呈梭形或多角形,时可见分裂相;光动力作用 组细胞变小、变圆,结构不清,分裂相少,细胞密度降低;硬化剂作用组因大部分细胞死亡细胞密度明 显降低,可见较多细胞碎片。结论 光动力效应能够有效地杀伤血管内皮细胞,并对其生长有持续的 抑制作用,且比硬化刺作用温和。     

年龄相关性冠心病患者骨髓间充质干细胞体外增殖能力的研究

目的:比较中老年冠心病患者骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖能力差异,应用低能量激光照射对细胞培养过程进行干预,了解其对细胞增殖能力的影响.方法:冠心病行冠状动脉旁路移植术患者49例,其中中年组23例,年龄45～59(53.2±5)岁、老年组26例,年龄60～72(65.4±4)岁.分离、培养骨髓MSCs,记录原传时间、首次传代时间、平均传代时间.用四唑盐法绘制细胞增殖曲线.老年组6例骨髓MSCs P2代细胞,应用低能量激光(0.5 J/cm2照射组、2.0 J/cm2照射组)对细胞进行照射,并与对照组比较,四唑盐法测定细胞增殖曲线.结果:与中年组比较老年组原传时间、传P1代时间、第1～6代平均传代时间均延长(P<0.05),差异均有统计学意义.与中年组相比,老年组的骨髓MSCs增殖较中年组减慢,第12、14天差异均有统计学意义(P<0.05～0.01).接受低能量激光照射后,骨髓MSCs增殖曲线显示,第4、6、8、10天0.5 J/cm2及2.0 J/cm2照射组细胞增殖均显著快于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05).但0.5 J/cm2照射组及2.0 J/cm2照射组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论:本研究证实骨髓MSCs的增殖能力随年龄及传代次数的增加而逐渐降低.低能量激光照射能促进老年组患者MSCs增殖,增加细胞数量,缩短细胞培养时间.     

血卟啉衍生物光动力治疗人胰腺癌细胞的实验研究

目的 研究血卟啉衍生物光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)对体外培养的人胰腺癌细胞株PANC1的杀伤效应及其规律.方法 以Biolitec PDT 630半导体激光治疗仪为光源,用不同浓度的血卟啉衍生物Photosan(0.5、1、2、4 mg/L)作为光敏剂孵育PANC1细胞8 h后,分别给予不同剂量(1、5、10 J/cm~2)630nm激光照射,用MTT法测定PDT后各组的A_(492)值,以流式细胞仪测定10 J/cm2光照后细胞凋亡情况.结果 不加光敏剂Photosan或不进行光照,对细胞均无杀伤效应;添加1 mg/LPhotosan时,10 J/cm~2 的光照对细胞产生杀伤效应(0.140±0.013对0.213±0.008,P＜0.05);添加2 mg/L Photosan时,5 J/cm~2 和10 J/cm~2 的光照对细胞产生杀伤效应(0.081±0.024和0.049±0.013对0.211±0.031,P＜0.05和P＜0.01);添加4 mg/L Photosan时,所有光照剂量均对细胞产生明显的杀伤效应.但5 J/cm~2与10 J/cm~2光照对细胞的杀伤效应无显著差异.用10J/cm~2光照,0、2、4mg/LPhotosan时的细胞凋亡率分别为(13.8±1.8)%、(40.9±1.6)%、(62.5±2.0)%,差别具有统计学意义(P＜0.05).结论 单纯给予光敏剂或光照对PANC1均不产生PDT效应.光敏剂达到一定浓度,光照达到一定剂量后,PDT效应随其增加而增强.     

低能量激光照射对受张力刺激的成骨细胞周期和细胞凋亡的影响

目的 探讨低能量激光照射(Low-lever laser irradiation,LLLI)对受到周期性张力刺激的人成骨样细胞的周期和细胞凋亡有何影响.方法 将对数生长期的人成骨样细胞MG-63随机设为三组,采用Forcel四点弯曲体外细胞力学加载装置对细胞施加张力,采用Ga-Al-As半导体激光器(808 nm,500 mW)进行照射.组Ⅰ(对照组):不加力,不进行激光照射.组Ⅱ(张力组):细胞加载装置对细胞加力,加力板变形量为3000 ustrain,加力时间1 h.组Ⅲ(张力激光组):细胞加力(加力方式同组Ⅱ)1 h后,激光照射,激光照射剂量3.75 J/cm2,1次.加力或照射后12 h,采用流式细胞术分别检测各组的细胞周期和细胞凋亡率.结果 与对照组相比,其余两组的S期细胞数增加,G1期细胞数减少,细胞增殖指数增加(P<0.05),组Ⅲ比组Ⅱ的G2期细胞数增加,G1期细胞数减少,细胞增殖指数增加(P<0.05).与对照组相比,其余两组细胞凋亡率明显降低(P<0.05),与组Ⅱ相比组Ⅲ凋亡率明显降低(P<0.05).结论 LLLI可以通过改变受张力MG-63细胞的周期时相促进细胞增殖,并能抑制细胞凋亡,张力使更多的细胞通过G1/S调控点,进入S期,LLLI使更多细胞进入S期的同时,又使更多的细胞暂时停留在G2/M期, DNA合成增加,促进成骨细胞增殖.     

人参皂苷预处理对电离辐射下人造血干细胞的保护作用及其机制探讨

目的观察人参总皂苷预处理对电离辐射下人造血干细胞(HPCs)的保护作用,并探讨其作用机制。方法将HPCs随机分为对照组和观察组,对照组不处理,观察组予以人参皂苷5.0μmol/L培养24 h,分别用剂量为0、1、2、5 Gy的X线对两组细胞进行照射。MTT法测算细胞存活率,流式细胞仪测定辐射后24 h细胞内的活性氧(ROS),Western blot法测定细胞内的Caspase-3和Nrf-2。结果随着辐射剂量的增加,两组细胞存活率均逐渐下降(P均<0.05),细胞内ROS活性增强、Caspase-3表达增加、Nrf-2表达减少(P均<0.05);与相同照射剂量对照组比较,观察组细胞存活率增加(P均<0.05),细胞内ROS活性减弱、Caspase-3表达减少、Nrf-2表达增加(P均<0.05)。结论人参皂苷对电离辐射下的HPCs具有保护作用,该作用与其抗凋亡和抑制氧化应激有关。     

食管鳞癌细胞分化状态对内源性光敏剂PpIX产量的影响及对PDT的应答

目的:研究食管癌细胞的分化状态对ALA产生的内源性光敏剂PpIX累积水平的影响,及对PDT的应答敏感程度.方法:以高分化食管鳞癌细胞KYSE-450和低分化食管鳞癌细胞KYSE-70为研究对象,利用荧光分光光度法测定不同浓度ALA处理后细胞内PpIX的浓度;分别使用不同剂量的红光和蓝光对细胞进行照射处理,MTS法测定PDT对细胞的光毒毒性;TdT-流式细胞法测定PDT诱导的凋亡水平,并观察凋亡细胞的胞核形态.结果:高分化KYSE-450细胞比低分化KYSE-70细胞具有更强的PpIX合成或累积水平,两者PpIX绝对浓度值在高于0.5mmol/LALA时差异显著(315.2±88.3vs156.9±79.2,P<0.05);虽然高分化细胞PpIX产量高于低分化细胞,但无论是红光PDT还是蓝光PDT,其敏感性均明显差于低分化细胞,光剂量为3.6J/cm2(红光)和0.16J/cm2(蓝光)时,两者细胞存活率有极显著差异(88.0±7.4vs25.2±4.9,红光;97.4±7.3vs40.8±4.2,蓝光;P<0.01);KYSE-450凋亡率(12.5%)亦低于KYSE-70(23.2%),细胞主要以坏死方式为主.结论:食管鳞癌细胞的分化影响了内源性光敏剂PpIX的细胞内水平;PDT效应并不单纯依赖于细胞内的光敏剂含量,细胞的生物学特征如分化状态也影响了PDT的效果;高分化细胞部分通过抑制凋亡抵制了PDT作用.     

光动力学疗法诱导卵巢癌细胞系Skov3和宫颈癌细胞系Hela凋亡的体外研究

目的 研究光动力疗法对人宫颈癌细胞系Hela及卵巢癌细胞系Skov3的体外增殖及凋亡的影响,探讨光动力学在老年女性妇科肿瘤治疗的优势。 方法 采用不同能量激光对不同浓度光敏剂（5-ALA）处理过的宫颈癌细胞系(Hela)及卵巢癌细胞系(Skov3)进行照射,48 h后应用光镜、电镜进行形态学观察,并采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测光动力学治疗对肿瘤细胞体外生长的抑制作用,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果 实验组细胞经光动力学处理后体积缩小,细胞变形、皱缩,细胞核浓缩、深染,染色质密集成斑块状,细胞间失去彼此连接,透射电镜下可见致密的染色质沿核膜下聚集,有凋亡小体形成。0.1、0.5、1.0、2.5 mmol/L的5-ALA处理过的肿瘤细胞经不同能量0.1、0.5、2.5、12.5 J/cm2激光照射后细胞系Skov3和Hela的抑制率分别为12.9％～90.7％和3.9％～70.0％;光敏剂浓度、光照强度对卵巢癌细胞系Skov3与宫颈癌细胞系Hela吸光度值(A)均有影响(P＜0.01),光敏剂与光照间交互作用显著(P＜0.01)。随光敏剂浓度与光照强度的增加两细胞系A值呈降低趋势,呈光敏剂浓度与光照时间的依赖性(P＜0.01)。 结论光动力学治疗对体外生长的卵巢癌细胞系Skov3及宫颈癌细胞系Hela有抑制作用。     

食管鳞癌细胞KYSE-70的分化诱导对光动力学应答敏感性的抑制

目的:研究全反式维甲酸(ATRA)对低分化食管鳞癌细胞系KYSE-70的分化诱导作用及对光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)的应答敏感程度.方法:以高分化食管鳞癌细胞KYSE-450和低分化食管鳞癌细胞KYSE-70为研究对象,用1μmol/LATRA为诱导剂,诱导KYSE-70细胞从低分化状态向高分化状态分化,通过细胞形态学、增殖实验来验证;细胞以1mmol/LALA处理,不同剂量的450nm蓝光照射,MTT法测定PDT对细胞的光毒毒性;流式细胞法测定PDT诱导的凋亡水平,Hoechst33342染色后观察凋亡细胞的胞核形态.结果:经ATRA处理后,诱导组与对照组相比,细胞变扁平、体积增大、胞质密度减低、核变大、核密度亦减低、细胞生长缓慢.高分化KYSE-450、分化诱导后的KYSE-70细胞和未诱导KYSE-70细胞用ALA处理后进行蓝光PDT,MTT结果显示高分化KYSE-450和分化诱导后KYSE-70的细胞存活率明显高于未诱导细胞,而高分化KYSE-450细胞敏感性略微低于分化诱导后的KYSE-70细胞.当光剂量为225mJ/cm2时,诱导前后细胞存活率分别为36.23%...     

一种新型β_1肾上腺素受体单克隆抗体的制备及其临床应用

目的:采用杂交瘤细胞融合技术构建特异性针对β_1肾上腺素受体(β_1-AR)细胞外第二环的单克隆抗体(β_1-AAmAb)。方法:设计合成两条肽段,偶联后作为免疫原混合免疫小鼠,挑选免疫反应强的小鼠进行细胞融合。筛选杂交瘤细胞、扩大培养,并于接种小鼠,14d后收集腹水,用Protein G对腹水进行纯化以获得单克隆抗体。结果:ELISA结果显示,杂交瘤细胞上清液中β_1-AA的滴度明显高于对照组(2.9896±0.1873)vs.(0.0635±0.0386),差异有统计学意义(P0.001)。Western bolt分析发现,β_1-AAmAb与商业化抗β_1-AR多克隆抗体阳性对照具有相同分子量的条带。激光共聚焦结果表明,β_1-AAmAb可与天然存在的β_1-AR相结合。Annexin V/PI流式分析发现,β_1-AAmAb可以诱导心肌细胞发生早期凋亡。乳鼠心肌细胞跳动频率实验证实,β_1-AAmAb与心力衰竭患者血清中的β_1-AA均可增加乳鼠心肌细胞跳动频率。结论:本研究成功构建了与心力衰竭患者血清中存在的β_1-AA具有相同生物学效应的单克隆抗体,使用该单克隆抗体进行后续的研究可以使我们对β_1-AA的致病机制有更好的认识。