不同模型下清脑宣窍方有效组分药代动力学研究

目的研究清脑宣窍方有效组分栀子苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1在正常、脑中风急性期和恢复期状态下大鼠体内的药代动力学变化。方法按双侧颈动脉结扎并喂养2周制备中风恢复期模型,采用MCAO法制备中风急性期模型。灌服给予清脑宣窍方有效组分,血浆样品用C18固相柱萃取,以亥茅酚苷为内标,选用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-水二元梯度洗脱,柱温为30℃;流速为1.0mL/min;检测波长为203nm。采用DAS1.0软件对各血浆药物浓度进行拟和分析。结果栀子苷、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1在大鼠体内药动学过程均属于二室模型,人参皂苷Rb1属于一室模型。各组分最高血药浓度(Cmax)、血药浓度时间曲线下面积(AUC)值均表现为急性模型组>恢复模型组>正常组。结论不同模型下动物对清脑宣窍方有效组分吸收不同,同等剂量下生物利用度顺序为急性模型组>恢复模型组>正常组。     

清脑宣窍方有效部位的化学成分研究(Ⅱ)

目的对清脑宣窍方有效部位化学成分进行系统研究。方法大孔树脂、聚酰胺、硅胶等色谱方法分离,波谱法鉴定结构。结果从清脑宣窍方有效部位中分离得到12个化合物,分别为20(S)-原人参三醇(Ⅰ),人参皂苷Rd(Ⅱ),三七皂苷R4(Ⅲ),2,α3,β19,α23-四羟基齐墩果-12-烯-28-酸(Ⅳ),6″-香豆酰龙胆双糖苷(Ⅴ),Galioside(Ⅵ),6α-Hydroxygeniposide(Ⅶ),槲皮素(Ⅷ),3,3',5,5'-四甲氧基-4,4'-二-β-D-葡萄糖双环氧木脂素(Ⅸ),藏红花酸(Ⅹ),豆甾醇(Ⅺ)和β-谷甾醇(Ⅻ)。结论均为首次从清脑宣窍方有效部位中分离得到的已知化合物。     

清脑宣窍方有效部位的两个新化合物研究

目的研究清脑宣窍方有效部位的化学成分。方法大孔树脂、硅胶、聚酰胺等色谱方法分离,波谱法鉴定结构。结果从清脑宣窍方有效部位中分离得到两个化合物,其化学结构分别鉴定为达玛-24(25)-烯-3β,12β,20(S)-三醇-6-O-(6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖)-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅰ)、2,6,11,15-四甲基-,4,6,8,10,12,14-十六烯单乙酯(Ⅱ)。结论两个化合物均为新化合物,分别命名为三七皂苷Rt(Ⅰ)和藏红花酸单乙酯(Ⅱ)。     

Influence of effective components of Qingnao Xuanqiao Fang on expression of BBB P-glycoprotein in rats with ischemia stroke

目的 比较正常及缺血损伤时大鼠血脑屏障上转运蛋白中P-糖蛋白(P-gp)时征表达及清脑宣窍方有效组分对其表达的影响.方法 线栓法制备缺血性脑中风大鼠模型,按照不同再灌注时间,模型组再分为0、0.5、1、2、6、12、24 h,采用免疫组织化学法观察正常组与模型组大鼠脑皮质及海马缺血区P-gp的表达.除假手术组外,缺血动物于术后1d,随机分为模型组、清脑宣窍方有效组分高、中、低剂量组、维拉帕米组,并于造模后1～5 d灌胃给予相应药物.末次给药后,处死动物,取材,检测大鼠脑皮质及海马区P-gp的表达.结果 免疫组织化学染色结果显示,正常组与模型组大鼠脑皮质及海马缺血区均可见P-gp阳性染色.免疫组化半定量分析表明,与正常组比较,不同再灌注时间模型组P-gp表达量均有显著性差异(P＜0.05),皮质及海马缺血区P-gp表达量均降低;与模型组比较,清脑宣窍方有效组分各剂量组及维拉帕米组对缺血性脑中风大鼠脑皮质及海马区P-gp表达量明显降低(P＜0.05).结论 在缺血性脑中风病理状态下,大鼠脑血脑屏障上转运蛋白P-gp存在一定的时征表达,而且从一定程度上反映了特定病理状态下由于蛋白表达的改变而引起的血脑屏障通透性的变化.清脑宣窍方有效组分对缺血性脑中风大鼠脑皮质及海马缺血区P-gp表达具有显著的抑制作用.     

清脑宣窍方有效部位的化学成分研究(Ⅰ)

目的对清脑宣窍方中有效部位化学成分进行系统研究.方法大孔树脂、聚酰胺、硅胶等层析方法分离,波谱法鉴定结构.结果从清脑宣窍方有效部位中分离得到9个化合物,分别为:①熊果酸,②人参皂苷Rg1,③人参皂苷Rh1(R),④人参皂苷Rh1(S),⑤人参皂苷Re,⑥人参皂苷Rb1,⑦栀子苷,⑧三七皂苷R1,⑨Genipin-1-O-β-gentiobioside.结论以上9个化合物均为首次从复方清脑宣窍方中分离得到的已知化合物.     

血脑屏障上的P-糖蛋白及其转运功能研究进展

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一个由分子量170-180KD组成的糖蛋白,其主动的药物外排作用是造成肿瘤细胞产生多药耐药性(Multidrug resistance,MDR)的重要原因。近年来研究发现,P-糖蛋白在机体正常组织如血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)也呈高度表达。本文归纳了P-糖蛋白的逆转剂及其底物的特征,系统介绍了血脑屏障上P-糖蛋白的转运功能及其研究方法,期望为P-糖蛋白逆转剂的应用以及中枢神经系统疾病的治疗提供帮助。     

RP-HPLC法测定清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1及Rb1含量

目的建立清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1、Rb1 HPLC 含量测定方法.方法采用YWG-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,10 μm),检测波长:203 nm.人参皂苷Rg1的流动相为乙腈-0.05 %磷酸水(21:79),流速:1.2 mL/min,人参皂苷Rb1的流动相为乙腈-0.05 %磷酸水(31:69),流速:0.9 mL/min.结果该法人参皂苷Rg1平均回收率为100.71 %,RSD=1.16 %(n=5).人参皂苷Rb1的平均回收率为99.32 %,RSD=2.52 %(n=5).结论本法操作简便、准确,可作为清脑宣窍方有效部位的质量控制方法之一.     

RP-HPLC法测定清脑宣窍方有效部位中藏红花酸含量

目的建立清脑宣窍方有效部位中藏红花酸的含量测定方法.方法采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定藏红花酸含量,运用YWG-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,10 μm),流动相为甲醇-水-冰乙酸,流速:1 mL/min,检测波长:423 nm.结果藏红花酸在0.022～0.110 μg范围内与其色谱峰面积呈良好的线性关系,r=0.9991,平均回收率为99.4%,RSD=1.90%(n=5).结论本法操作简便、准确,可作为清脑宣窍方有效部位的质量控制方法之一.     

洛美利嗪对大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响

目的：研究洛美利嗪对大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响。方法：使用荧光分光光度计和流式细胞术分析大鼠脑微血管内皮细胞内P-糖蛋白底物-罗丹明123的荧光强度。结果：环孢素A和洛美利嗪与大鼠脑微血管内皮细胞孵育后能明显提高胞内罗丹明123的荧光强度。人脐静脉内皮细胞内荧光强度则不受环孢素A和洛美利嗪的影响。结论：洛美利嗪能显著地抑制大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白的活性,提高P-糖蛋白底物的胞内浓度。     

抗癫癎药物诱导对血脑屏障上P-糖蛋白功能与表达的影响

目的研究长期使用抗癫疒间药物（AEDs）对大鼠脑中P-糖蛋白（P-gp）功能活性和表达水平的影响。方法选择苯巴比妥、苯妥英钠和卡马西平三个典型AEDs,在大鼠体内连续给药21天,然后观察脑组织中皮质和海马P-gp的改变。结果底物罗丹明123转运实验表明P-gp功能增强,进一步通过Western Blot分析表明P-gp表达增强,并用免疫组化染色显示其细胞定位在血脑屏障上。结论长期AEDs诱导可以同时导致大鼠血脑屏障上P-gp功能活性和表达水平的升高。     

P-糖蛋白在大鼠脑缺血再灌注后的表达变化

目的 观察大鼠局灶性脑缺血90 min再灌注后p-糖蛋白(P-gp)在脑组织中的表达及其变化规律.方法 采用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型,选取26只成年健康SD雄性大鼠,其中1只用于2,3,5--三苯基氯化四氮唑(TTC)染色,其余25只随机分为对照组(n=5)、假手术组(n=5)、脑缺血再灌注1、3、7d组(n=5).用免疫组织化学DAB单标,观察P-gp在正常脑组织和缺血脑组织中的分布变化;用Mdr-1抗体分别和神经元标记物(Neun)、星形胶质细胞标记物(GFAP)、微血管内皮细胞标记物(CD31)进行免疫荧光双标,观察P-gp在缺血再灌注后脑组织的表达;用实时定量PCR技术检测脑缺血再灌注后大脑皮质及纹状体微血管P-gp mRNA的表达变化.结果 对照组仅在脑组织微血管内皮细胞表达P-gp,缺血再灌注组除微血管内皮细胞表达P-gp外,在部分神经元及星形胶质细胞的突起也有表达.脑缺血再灌注后1d皮质P-gp mRNA表达降低,但3d表达明显增高,7d又下降,其升高和降低水平与对照组及假手术组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).脑缺血再灌注后1、3、7d纹状体P-gp mRNA表达均增多,其中以1、3d增多明显,与对照组和假手术组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脑缺血再灌注后P-gp在大脑皮层及纹状体微血管P-gp的表达呈现不同的趋势,这可能是脑组织的自我保护机制之一.     

益气活血方对心肌缺血大鼠Akt/mTOR信号通路的影响

目的依托大鼠心肌缺血模型,探讨蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(Akt/m TOR)信号通路在心肌中的表达及益气活血方对其的作用机制。方法 SPF级雄性SD大鼠随机分为模型组、培哚普利组、芪参益气滴丸组、益气活血方组和假手术组,结扎左冠状动脉前降支构建心肌梗死模型,术后第2天灌胃给药。以第7、28天为观测时间点。超声检测各组大鼠心脏功能和结构的变化,HE染色观察心肌病理形态改变,Western blot、RT-PCR法和免疫组化法检测大鼠心肌梗死区边缘Akt、m TOR及磷酸化表达水平。结果第7、28天,与假手术组相比,模型组大鼠心脏左室射血分数(LVEF)、左室短轴率(LVFS)显著降低(P0.01),第7天模型组大鼠左室收缩末期容积(LVESV)显著升高(P0.01),第28天模型组大鼠LVESV和左室舒张末期容积(LVEDV)显著增大(P0.01);与模型组相比,各给药组第28天LVEF、LVFS升高,LVEDV和LVESV显著降低(P0.01)。模型组梗死区边缘室壁变薄,心肌细胞数量减少,心肌细胞排列紊乱,炎性细胞浸润;各给药组梗死区边缘心肌细胞排列紊乱,心肌细胞数量减少。模型组磷酸化Akt(p-Akt)/Akt、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-m TOR)/m TOR值增高(P0.05),Akt、m TOR mRNA表达显著增高(P0.01),p-Akt、p-m TOR阳性细胞率明显增高(P0.01);各给药组p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR比值增高(P0.05),Akt、m TOR m-RNA表达增强(P0.05或P0.01),各给药组均可明显提高pAkt、p-m TOR阳性细胞率水平(P0.05)。结论益气活血方能够改善心肌缺血大鼠心脏功能,可能通过激活心脏自我保护机制Akt/m TOR信号通路产生保护心肌细胞的作用。     

大鼠脑缺血模型血脑屏障结构和功能状态的研究

目的 探讨脑缺血再灌注后血脑屏障结构和功能改变的规律性,为相关血管源性脑水肿的防治提供形态学和功能学基础.方法 采用改良的Longa线拴法,制备大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血不同时程再灌注模型,硝酸镧心脏灌注,额顶叶取材,电镜下观察血脑屏障超微结构的变化;伊文思蓝颈总动脉注射,脑组织匀浆制备,分光光度仪伊文思蓝通透性定量分析,评价血脑屏障功能改变.结果 对照组各时间点血脑屏障无开放.脑缺血再灌注3h组,血脑屏障开放,伊文思蓝少量通透血脑屏障;6、12h组开放程度和伊文思蓝通透量逐渐增加,24h组达高峰,72h组有所减弱.结论 大鼠大脑中动脉阻塞再灌注后,血脑屏障的结构和功能呈现时程性改变,掌握改变的时程性,有助于对血管源性脑水肿发生机理的理解和早期防治.     

电针对高血脂合并脑缺血大鼠NSE影响的实验研究

目的建立高血脂合并脑缺血模型并探讨电针的治疗作用。方法实验分正常对照组,模型组,治疗Ⅰ、Ⅱ组。模型组和治疗组给大鼠喂养高脂饲料造成高血脂模型,治疗Ⅰ组电针三阴交、丰隆10d后,两组同时用FeCl3化学诱导大脑中动脉血栓闭塞制造高血脂合并脑缺血模型,然后同时电针三阴交、丰隆,针刺百会、人中,7d后检测血脂4项、HE染色和脑组织中神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量。结果造模6周,高脂饲料喂养的各组大鼠总胆固醇(CHO)和低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)与正常对照组大鼠比较,升高有显著性差异(P<0.01)。针刺治疗后,治疗Ⅰ组、Ⅱ组CHO降低有极显著性差异(P<0.01),治疗Ⅰ组TG、LDL-C降低有极显著性差异(P<0.01)。HE染色脑缺血造模后,缺血灶出现部位恒定,缺血灶内大量神经元变性坏死,出现脑水肿表现。NSE结果显示:模型组和治疗组NSE上升有极显著差异(P<0.01);与模型组比较,治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组下降有显著差异(P<0.01,P<0.05);与治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组升高有显著差异(P<0.05)。结论高血脂合并脑缺血模型制造成功;电针可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、LDL-C、TG,可改善脑缺血状态,降低NSE浓度,从而可减轻脑损害程度。     

二氮嗪对深低温脑缺血再灌注大鼠脑组织NR1表达的影响

目的 探讨二氮嗪对深低温缺血再灌注大鼠的脑保护作用及其机制。方法 采用双侧颈总动脉阻断法制作深低温缺血再灌注大鼠模型,将306只SD大鼠随机分成3组：假手术组、二氮嗪组和模型组。分别在缺血1 h后再灌注2、6、12 h及1、2、3、7 d断头取脑,对脑组织行含水量检测,并采用免疫组织化学技术检测脑组织NR1表达情况。结果 假手术组脑组织含水量明显低于二氮嗪组和模型组,二氮嗪组低于模型组,模型组和二氮嗪组脑组织含水量在12 h开始升高、1d达高峰、3 d基本恢复正常,模型组和二氮嗪组NR1均在2 h开始升高、1 d达到高峰、7 d后基本达到正常水平,但二氮嗪组NR1表达水平在2、6、12 h及1、2 d明显低于模型组,且两组NR1表达水平均高于假手术组。结论 二氮嗪预处理对深低温缺血再灌注大鼠具有脑保护作用,其作用机制可能是通过下调脑组织NR1的表达来实现。     

3-硝基丙酸预处理对大鼠局灶性缺血-再灌注脑损伤的影响

目的探讨线粒体毒素3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NPA)预处理对大鼠缺血-再灌注脑损伤的保护作用.方法大鼠腹腔注射3-NPA(20 mg·kg-1)3 d后制作大脑中动脉缺血-再灌注模型,采用红四氮唑(TTC)染色、荧光法和干湿重法观察3-NPA预处理对缺血2 h再灌注24h和48 h脑梗死体积、血脑屏障通透性和脑组织含水量的影响.结果缺血2 h再灌注24 h和48 h,3-NPA预处理组脑梗死体积变小,血脑屏障通透性降低,脑组织含水量减少,与对照组比较有显著性差异(均P＜0.05).结论3-NPA预处理可以诱导脑缺血耐受,降低血脑屏障通透性、减轻脑水肿可能是其机制之一.     

益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠心肌微小基因miR-133a表达水平的影响

目的探讨益气养阴活血方对糖尿病大鼠的心肌保护作用。方法 12周龄Wistar雄性大鼠60只,随机选取空白组10只,造模组50只。采用高脂饮食加小剂量链尿佐菌素(STZ)诱导形成2型糖尿病大鼠模型,造模成功后,50只糖尿病大鼠随机分为5组,分别予生理盐水,复方丹参滴丸(70 mg/kg),益气养阴活血方高、中、低剂量(55.00、27.50、13.75 g/kg)灌胃,每日1次,干预4周,常规取血测定血糖、血脂等生化指标,并取大鼠左室前壁心肌组织,一部分制成切片HE染色后光学显微镜观察心肌细胞形态学改变,另一部分用Western blot法测定活化T细胞核因子4(NFAT-4)含量,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测微小基因miR-133a的表达水平。结果模型组与空白组比较大鼠的血糖、糖化血清蛋白、血脂水平均明显升高(P0.05);与模型组比较,各治疗组大鼠血糖、糖化血清蛋白、血脂水平均明显降低(P0.05)。与空白组比较,模型组NFAT-4的蛋白含量明显升高(P0.05),而miR-133a表达水平明显降低(P0.05);与模型组比较,各治疗组miR-133a表达水平明显明显升高(P0.05或P0.01),而NFAT-4的蛋白含量明显降低(P0.05或P0.01)。益气养阴活血方及复方丹参滴丸均可改善心肌细胞光镜下病理形态。结论益气养阴活血方可显著改善糖尿病大鼠糖脂代谢,抑制心肌肥大,其对心肌细胞的保护作用,可能与调控miR-133a的表达、从而抑制心肌肥大相关蛋白NFAT-4的表达有关。     

铁离子致大鼠实验性脑室出血后急性脑损伤的初步研究

目的观察大鼠脑室内注入铁离子后早期脑损伤的基本病理特点,探讨铁离子在大鼠脑室出血后急性期脑损伤中的作用。方法通过立体定向侧脑室注射法建立脑室出血后铁损伤模型,侧脑室注射二氯化铁或生理盐水,采用干湿质量法测定损伤后24 h脑组织含水量变化,伊文思蓝染色法观察血脑屏障损伤,Fluoro-Jade C(FJC)、TUNEL染色及透射电镜观察海马神经元变性、凋亡情况,采用透射电镜观察脑室壁纤毛损伤,并于损伤后7 d采用整体脑室剥离法观察大体标本脑室壁含铁血黄素沉积。结果铁损伤组在24 h时大脑半球含水量较对照组明显升高(P<0.05)、血脑屏障破坏、海马神经元大量变性、凋亡,脑室室管膜纤毛及微绒毛大量脱落;7 d时侧脑室壁大量含铁血黄素沉积。结论铁离子脑室内沉积可导致脑水肿、血脑屏障损伤、脑室壁损伤等急性脑损伤效应,可能在脑室出血后急性期脑损伤中起重要作用。