p14ARF基因对胰腺癌细胞侵袭力的影响

目的探讨外源性p14ARF基因导入人胰腺癌PC-3细胞株后,细胞侵袭力的变化。方法用脂质体介导法将外源性p14ARF基因导入人胰腺癌PC-3细胞株后,用细胞穿透Matrigel 胶法比较转染前后细胞侵袭力的改变,并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测与侵袭转移相关基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP9表达。结果转染p14ARF基因后的PC-3细胞穿过Ma- trigel胶的能力减弱,48 h后平均穿膜细胞数从(92±12)个减少到(28±5)个,而且MMP9 mRNA 表达下降。结论 p14ARF基因能抑制胰腺癌PC-3细胞的侵袭能力。     

p14ARF基因转染治疗胰腺癌的研究

目的 探讨p14ARF抑癌基因转染对胰腺癌（PC－3细胞）生长抑制的影响。方法 用脂质介导方法将p14ARF基因转导到人胰腺癌细胞株PC－3,应用逆转录酶链反应（RT－PCR）检测p14ARFmRNA 表达;应用免疫印迹方法分析p14ARF转基因蛋白表达,并观察p14ARF基因转染的胰腺癌细胞生长情况。结果 p14ARFmRNA基因转染的PC－3细胞能够表达p14ARF,并通过免疫组化和免疫印迹证实外源性p14ARF基因已转入细胞并结合于细胞基因组中。结论 p14ARF基因转染后的PC－3细胞明显受到抑制,提示p14ARF基因转染治疗胰腺癌具有潜在的临床应用价值。     

胰腺癌PC-3细胞株外源性p14ARF抑癌基因表达与内源性p53表达水平的关系

目的　探讨外源性 p1 4ARF基因表达于胰腺癌PC 3细胞后与另一重要细胞周期调控蛋白 p53表达水平的相互关系。 方法　将含人 p1 4ARFcDNA的重组质粒通过脂质体介导转染入胰腺癌PC 3细胞中 ,并筛选出阳性克隆 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblot法检测PC 3细胞转染前后p1 4ARF的mRNA及蛋白的表达 ,同时用Westernblot分析其内源性 p53蛋白表达水平的变化。噻唑蓝 (MTT)比色法测定PC 3细胞在转染前、后的生长曲线变化。结果　胰腺癌PC 3细胞中p1 4ARF基因缺失。外源性 p1 4ARF基因成功转染入PC 3细胞并获得 1 4× 1 0 3大小的p1 4蛋白表达 ,且内源性 p53蛋白表达水平在转染后明显增高。PC 3细胞在导入 p1 4ARF基因后第 1天及第 5天的生长抑制率分别为 2 2 %及 2 6 % ,两者差异有显著性 (P <0 .0 5)。结论　p1 4ARF基因可上调胰腺癌PC 3细胞的内源性p53蛋白表达水平 ,从而发挥其细胞周期阻滞功能。     

VEGF_(121)反义核酸抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成

目的:探讨VEGF121反义核酸对裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成的影响,探索通过VEGF反义核酸抑制肿瘤生长.方法:将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系Bx-PC-3接种于裸鼠背部皮下.将实验鼠分为实验组、对照组和空白组.定期测定裸鼠移植瘤体积,免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤VEGF、Flk-1表达水平.测定裸鼠移植瘤微血管密度.结果:VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,裸鼠胰腺癌移植瘤生长明显减缓.移植瘤VEGF表达明显受到抑制,Flk-1表达水平上调.裸鼠胰腺癌移植瘤微血管密度明显降低.结论:人反义核酸VEGF121能显著抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖,并能抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的血管生成.     

人反义VEGF121真核表达质粒的构建及其对胰腺癌细胞VEGF表达的影响

血管内皮生长因子(VEGF)能特异性地刺激血管内皮细胞增殖，在肿瘤的血管生成中发挥着关键作用。胰腺癌作为实体瘤其发生、发展与肿瘤血管生成有着密切的联系。本研究采用分子生物学方法构建人反义VEGF121真核表达质粒，并转染人胰腺癌细胞系BxPC-3，为通过抑制VEGF引起的血管生成来抑制胰腺癌的增殖提供了实验基础。     

人VEGF165基因在狗骨髓基质细胞中的表达

目的 :检测转染 pcDNA3 hVEGF165狗骨髓基质细胞的VEGF165mRNA表达。方法 :用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞 ,用免疫组化及RT PCR检测VEGFmRNA的表达。结果 :重组质粒 pcDNA3 hVEGF165转染骨髓基质细胞后 ,免疫组化及RT PCR检测有VEGFmRNA的表达。结论 :采用脂质体介导的方法可将hVEGF165基因转染至狗骨髓基质细胞并表达外源性基因     

单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的 构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53，并研究其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。方法 利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA（0．5kb）亚克隆至pIRES载体中，通过聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中，并筛选出阳性克隆，流式细胞仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期；逆转录（RT）-PCR和Western bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。噻唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。转染后瘤细胞形态由转染前密集排列的多角形、星形转变为排列稀疏的长梭形细胞，瘤细胞生长速度较前缓慢，群体倍增时间比转染前增加了2．3倍，且易出现脱壁并见散在瘤细胞凋亡；流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期；RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达，转染MG-63后24、48、72、96h瘤细胞生长抑制率分别为：33．43％、69．37％、66，19％、75．26％，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 野生型p53和p14ARF协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡，为进一步研究p14ARF与p53在骨肉瘤基因治疗的体内实验奠定了基础。     

罗格列酮对前列腺癌细胞血管生成拟态的影响秦亮,陈安民,郭风劲,杨卿,任晔,徐飞,廖晖

【】 目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)配体罗格列酮(Rosiglitazone,RSG)对前列腺癌PC-3细胞血管生成拟态的影响。方法 体外培养人前列腺癌PC-3细胞,应用CCK-8法观察罗格列酮不同浓度和不同作用时间对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响;体外建立matrigel三维培养系统,观察罗格列酮对PC-3细胞血管生成拟态( vasculogenic mimicry,VM) 形成的影响;应用RT-qPCR和elisa的方法检测VE-cadherin、ephA2、VEGF mRNA和 VEGF蛋白的表达。结果 罗格列酮在48h后明显抑制前列腺癌PC-3细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性。前列腺癌PC-3细胞在体外三维培养条件下能够形成形成环状和网络样结构。罗格列酮能够抑制PC-3细胞VEGF、VE-cadherin、ephA2 mRNA及VEGF蛋白的表达,并使其形成血管生成拟态的能力明显降低。结论 罗格列酮可能通过下调前列腺癌细胞VEGF、VE-cadherin、ephA2的表达抑制血管生成拟态形成。     

p14ARF上调p53基因可增强5-FU对胰腺癌的治疗作用

我们的研究将p14ARF导入p53缺失的PC-3细胞后，探讨转染后的PC-3细胞对5-FU敏感性的增强作用。     

DPC4/Smad4基因转染对胰腺癌细胞体外生长的抑制作用

目的 观察抑癌基因DPC4/Smad4对胰腺癌细胞生长的抑制作用。方法 将人全长DPC4/Smad4 cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN 中，分别导入包装细胞GP+E86和PA317，经G418筛选获取阳性抗性克隆。收集病毒上清液，转染至胰腺癌BxPC-3细胞；获稳定表达后，观察其对BxPC-3体外生长的抑制作用。结果 聚合酶链反应扩增证实GP+E86、PA317/ pLXSN DPC4+细胞中有外源性DPC4/Smad4 基因整合；DPC4基因转染BxPC-3细胞后，可获得稳定表达，并可显著抑制胰腺癌细胞的生长和集落形成，下调癌细胞内VEGF基因的表达。结论 将DPC4/Smad4逆转录病毒载体转染到人源性胰腺癌细胞后，可显著抑制癌细胞的生长及血管形成能力。     

姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3及血管内皮生长因子的影响

目的:研究姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3细胞体外作用及其对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其抗肿瘤的作用机制。方法:分别用0、6.25、12.5、25、50μmol/L浓度的姜黄素作用于PC-3细胞,12、24、36、48、72、96h后台盼蓝拒染法、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长活性;24h后流式细胞仪测定细胞周期及凋亡的变化,透射电镜观察细胞超微结构变化;半定量RT-PCR法检测PC-3细胞内VEGFmRNA的表达;ELISA检测细胞上清液中VEGF浓度。结果:姜黄素能显著抑制PC-3细胞的增殖,呈剂量与时间依赖性,不同浓度姜黄素组之间及不同时间组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。不同浓度姜黄素诱导PC-3细胞出现剂量依赖性G2/M期阻滞(P<0.01),且各浓度组凋亡细胞比例均显著高于空白对照组(P<0.01),差异有统计学意义;姜黄素作用24h后PC-3细胞出现凋亡的形态学改变;PC-3细胞内VEGF mRNA的表达和细胞上清液中VEGF呈剂量依赖性降低。结论:姜黄素能显著抑制体外PC-3细胞的生长,并促进其G2/M期阻滞和凋亡,VEGFmRNA及蛋白的表达也明显降低,可能是其抑制肿瘤和血管生长的机制之一。     

米非司酮诱导雄激素非依赖性前列腺癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨米非司酮在体外诱导雄激素非依赖性前列腺癌DU-145、PC-3细胞凋亡的作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝法检测1,10,50和100μmol／L米非司酮作用于前列腺癌DU-145、PC-3细胞24～120h的吸光度（A）值,用流式细胞仪检测10μmol／L米非司酮作用24和48h后DU．145、PC-3细胞凋亡率的变化;采用免疫组化法检测米非司酮作用DU-145、PC．3细胞后bax、bcl-2、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的变化。结果1μmol／L米非司酮组的A值与对照组相比,差异无统计学意义（P〉0．05）;10,50和100μmol／L米非司酮组的A值与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）;米非司酮对前列腺癌DU-145、PC-3细胞的抑制作用呈时间-剂量依赖性。10μmol／L米非司酮作用前列腺癌DU-145细胞24和48h的凋亡率分别为15．3％和30．4％,PC-3细胞的凋亡率分别为22．2％和32．0％。经10μmol／L米非司酮作用后,DU-145、PC-3细胞中VEGF和bcl-2蛋白的表达明显减少,而bax的表达显著增加（P〈0．05）。结论米非司酮以时间．剂量依赖性方式抑制激素非依赖性前列腺癌DU-145和Pc-3细胞的增殖,其作用可能是通过降低VEGF蛋白的表达。从而下调bcl-2、激活bax蛋白的表达来实现。     

p27kip1高表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和侵袭转移的影响

目的　探讨外源性人p2 7kip1的高表达对前列腺癌PC 3细胞增殖和侵袭能力的影响。方法　利用携带人p2 7kip1基因的腺病毒 (Ad p2 7kip1)体外转染人前列腺癌PC 3细胞 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Western印迹法分别检测目的基因不同水平的表达 ,通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术以及Boyden小室法检测PC 3转染前后细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞体外侵袭力的变化。以Ad X gal病毒作为对照。 结果　RT PCR、Western印迹法检测转染Ad p2 7kip1后PC 3细胞的p2 7kip1 mRNA(3 2 0bp)、p2 7蛋白 (2 7× 10 3 )表达阳性 ,转染后对PC 3细胞的生长有抑制作用 ,出现明显的G0 G1期阻滞 ,早期细胞凋亡率有所增加 ,与对照组比较差异有显著性 ,Boyden小室法检测转染后体外侵袭力受到明显抑制。结论　重组腺病毒介导的人 p2 7kip1基因在体外对前列腺癌细胞系PC 3的细胞增殖和侵袭力有明显抑制作用 ,可望作为前列腺癌基因治疗的有效工具。     

COX-2特异性抑制剂NS-398对胰腺癌生长及肿瘤血管 生成影响

目的:探讨COX-2特异性抑制剂NS-398对胰腺癌生长的影响及其机制。方法:分别用q RT-PCR与Western blot检测不同人胰腺癌细胞株(Bx PC-3、SWl990、Capan-2、Aspc-1、PANC-1)中COX-2及VEGF表达,并用MTT法检测NS-398在体外对人胰腺癌细胞增殖抑制作用;用体外实验最敏感细胞株建立裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型,并随机将荷瘤鼠分为实验组和对照组,分别用NS-398与生理盐水处理,比较两组移植瘤的生长情况,并检测肿瘤组织中COX-2、VEGF蛋白表达及肿瘤微血管密度(MVD)。结果:各胰腺癌细胞中均有COX-2及VEGF表达,NS-398呈时间与浓度依赖性抑制各胰腺癌细胞的体外增殖,其中Bxpc-3细胞COX-2与VEGF表达量最高,且对NS-398最敏感。用Bxpc-3细胞建立原位移植瘤的实验组与对照组裸鼠比较,平均肿瘤体积明显减小(20.215 2 mm~3 vs.204.444 4 mm~3),瘤组织中COX-2与VEGF表达及MVD均明显降低(均P0.05)。结论:NS-398对胰腺癌的生长有抑制作用,其机制可能是通过COX-2途径降低VEGF基因表达从而抑制肿瘤血管生成有关。     

奥曲肽对前列腺癌细胞株PC-3的抑制作用及对VEGF表达的影响

目的：探讨奥曲肽（生长抑素类似物）对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3的抑制作用及对其血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响.方法：分别用浓度为0.1、0.3、1.0、3.0 mg/L奥曲肽对体外培养的人前列腺癌PC-3细胞进行处理,24 h、48 h、72 h后采用MTT法检测细胞生长活性,行Hoechst33258染色,用荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学改变;用RT-PCR法测定细胞半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）及VEGF的表达.结果：奥曲肽能以剂量与时间依赖性的方式抑制PC-3细胞的生长,促进其凋亡;0.1、0.3、1.0、3.0 mg/L奥曲肽作用PC-3细胞24 h后的存活率分别为（0.971±0.016）%、（0.853±0.015）%、（0.717±0.031）%、（0.743±0.029）%,作用48 h后的存活率分别为（0.918±0.015）%、（0.835±0.015）%、（0.682±0.018）%、（0.727±0.014）%,作用72 h后的存活率分别为（0.922±0.017）%、（0.841±0.013）%、（0.717±0.017）%、（0.739±0.003）%,差别有统计学意义（P〈0.01）;Caspase-3表达较对照组明显升高;而VEGF则明显降低.结论：奥曲肽能显著抑制PC-3细胞的体外生长,促进其凋亡;VEGF可能是其中的一条途径.     

NDRG2基因对前列腺癌细胞株PC-3M侵袭转移能力的影响

目的 观察NDRG2基因对人前列腺癌细胞株PC-3M侵袭转移能力的影响.方法 以携带人NDRG2基因的腺病毒感染体外培养的PC-3M细胞株,采用Western blot及明胶酶谱实验检测NDRG2、MMP-2、MMP-9蛋白表达情况及相关酶活性的变化.平板克隆实验、细胞生长实验检测NDRG2对PC-3M增殖能力的影响.Transwell实验检测NDRG2对PC-3M细胞体外侵袭能力的影响.结果 Ad-NDRG2感染后,PC-3M细胞中NDRG2表达明显增加,而MMP-2和MMP-9表达水平及活性均降低.噻唑蓝(MTT)比色法(抑制率24 h为16.2%、48 h为24.4%、72 h为43.7%)及平板克隆实验(3组分别为56.3%、55.2%和36.7%)显示NDRG2对PC-3M细胞的生长有明显抑制作用.Transwell显示对照组及Ad-LacZ组穿入下室面的细胞数明显多于Ad-NDRG2组(3组分别为93.0、94.8和50.4).结论 NDRG2对人前列腺癌PC-3M细胞株侵袭能力有明显抑制作用,提示NDRG2可能在前列腺癌的侵袭及转移中发挥重要作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of NDRG2 gene expression on the cell migration and invasion of human prostate cancer cell line PC-3M.Methods Recombinant adenovirus vectors carrying human NDRG2 gene (Ad-NDRG2) were infected into prostate cancer cell line PC-3M.The protein expression and enzymatic activities of NDRG2,MMP-2 and MMP-9 were determined by Western blotting and gelatin zymography respectively.Methylthiazol tetrazolium (MTT) assay and plate colony formation were used to determine the effect of proliferation of PC-3M cells.Invasion of PC-3M cells was measured by Transwell chamber assay.Results After infection by Ad-NDRG2,it had been verified that the protein expression of NDRG2 in PC-3M cells was obviously increased,and the expression and enzymatic activities of MMP-2 and MMP-9 were reduced.The MTT assay (inhibition ratio: 24 h,16.2%,48 h,24.4%,and 72 h,43.7% respectively) and plate colony formation (56.3%,55.2% and 36.7% in control group,Ad-LacZ group and Ad-NDGR2 group respectively) revealed that NDRG2 could significantly inhibit the growth and proliferation of PC-3M cells.The number of PC-3M cells that invaded the lower chamber in the Ad-NDRG2 group was significantly decreased as compared with the control group and the Ad-LacZ group (93.0,94.8 and 50.4 respectively).Conclusion NDRG2 gene can significantly inhibit invasion of the PC-3M cells,which may paly an important role in metastasis of prostate cancer.     

白花丹素体外诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡的研究

目的 探讨白花丹素对前列腺癌PC-3细胞增殖、凋亡的作用及其和RelA(p65)表达的关系.方法 应用不同浓度梯度的白花丹素(1、5、1O、15、20 μmol/L)共同培养PC-3细胞24、48 h,噻唑蓝(MTT)比色法检测PC-3细胞增殖活力,双染流式细胞仪检测凋亡细胞,透射电镜观察超微病理变化,计算药物半数抑制浓度(IC50).逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增检测RelA(p65).结果 24 h组在10～20 μmol/L,48 h组在5～20 μmol/L时均出现生长抑制,IC50分别为12.88、3.71 μmol/L.双染流式细胞仪检测显示PC-3随作用浓度的上升凋亡率增加并呈现浓度依赖关系.透射电镜观察作用后PC-3呈现典型凋亡表现.RT-PCR结果提示其细胞凋亡率同Rel A(p65)表达呈负相关.结论 白花丹素体外实验可能通过抑制Rel A(p65)表达诱导PC-3的凋亡.     

双氢青蒿素对前列腺癌细胞PC-3M生长的影响及其机制探讨

目的:观察双氢青蒿素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M细胞凋亡和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:不同浓度(0、25、50、100μmol/L)的双氢青蒿素分别作用于PC-3M细胞48 h,MTT法检测细胞生长活性;流式细胞仪测定细胞凋亡率;分光光度法检测细胞凋亡过程中caspase-3、caspase-8活性变化;半定量RT-PCR法检测PC-3M细胞内VEGF mRNA的表达;Western印迹法检测细胞VEGF蛋白表达。结果:双氢青蒿素能显著抑制PC-3M细胞的增殖,与对照组(0μmol/L)的细胞凋亡率(2.92±0.45)%相比,各剂量组(25、50、100μmol/L)的细胞凋亡率[(8.85±0.74)%,(12.83±0.84)%,(18.65±1.24)%]显著增加,caspase-8[(0.47±0.05)U/μg vs(1.22±0.15)U/μg,(1.76±0.07)U/μg,(2.91±0.24)U/μg]、caspase-3[(0.44±0.07)U/μg vs(0.95±0.08)U/μg,(1.48±0.14)U/μg,(2.92±0.45)U/μg]活性显著增加,呈剂量依赖性(P<0.01)。PC-3M细胞内VEGF mRNA的表达和蛋白表达呈剂量依赖性降低。结论:双氢青蒿素能显著抑制体外PC-3M细胞的生长,并促进其凋亡,机制可能与增加凋亡蛋白酶和抑制VEGF表达有关。     

胸苷激酶基因系统杀伤前列腺癌细胞的流式细胞术分析

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶／更昔洛韦（HSV－TK／GCV）自杀基因系统诱导人前列腺癌细胞死亡的机制。方法：利用脂质介导的基因转染技术将携带HSV－TK基因的EB病毒表达载体导入激素非依赖性人前列腺癌（HRPC）细胞系PC-3m并给予GCV，采用流式细胞术（FCM）观察PC－3m细胞周期变化以及细胞坏死和凋亡情况。结果：HSV－TK／GCV系统可使PC－3m细胞周期S期比例升高，高浓度GCV组尤其明显，S期细胞比例由16．73％升至33．60％；10和100μmol/L GCV作用72h后，PC-3m细胞可出现较为明显的细胞坏死和凋亡，比例分别为13．54％、12．45％、34．70％和10．11％。结论：细胞坏死和凋亡均参与了HSV－TK／GCV系统诱导的PCa细胞死亡，以细胞坏死比例稍高；TK自杀基因系统杀伤前列腺癌细胞时可能不依赖于其p53表达背景，因而具有更广阔的应用前景。