活性维生素D_3对大鼠肾小球系膜细胞增殖影响

目的探讨活性维生素D3(1,25(OH)2D3)对大鼠系膜细胞增殖的影响。方法体外培养大鼠系膜细胞,随机分为正常对照组、表皮生长因子(EGF)(10 ng/m L)组、1,25(OH)2D3(10-8mol/L)组、EGF联合1,25(OH)2D3组,采用MTT法检测各组干预48 h后对大鼠系膜细胞增殖的影响,流式细胞术检测各组干预48 h后大鼠系膜细胞周期分布情况,免疫荧光法检测各组干预48 h后,大鼠系膜细胞中增生性细胞核抗原(PCNA)的表达情况。结果与正常对照组比较,EGF组能明显促进大鼠系膜细胞增殖,G0/G1期细胞减少,S期及G2/M期细胞增加,且PCNA表达增加,1,25(OH)2D3组大鼠系膜细胞增殖受抑制,G0/G1期细胞增加,S期及G2/M期细胞减少,且PCNA表达降低;与EGF组比较,EGF联合1,25(OH)2D3干预组系膜细胞增殖受抑制,G0/G1期细胞增多,S期及G2/M期细胞减少,且PCNA表达降低。结论 1,25(OH)2D3可阻滞大鼠系膜细胞的细胞周期并抑制大鼠系膜细胞的增殖和EGF对大鼠系膜细胞的促增殖作用。     

来氟米特对转化生长因子β_1诱导的体培养的大鼠肾小球系膜细胞中Smad2表达的影响

目的观察来氟米特(leflunomide,LEF)在转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β_1刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)表达Smad2过程中发挥的作用。方法建立体外培养大鼠肾小球系膜细胞模型,经鉴定造模成功后第7代用于实验。按照对模型大鼠体外培养的肾小球系膜细胞的处理方式不同,将其分为TGF-β_1组(TGF-β_1 5 ng/mL),LEF-1组(LEF 5μg/mL+TGF-β_1 5 ng/mL),LEF-2组(LEF 50μg/mL+TGF-β_1 5 ng/mL)和对照组(无血清RPMI 1640培养液+20%胎牛血清)。分别于15 min,30 min,1 h,2 h和6 h收集标本,用间接免疫荧光法检测各组磷酸化Smad2(phosphorylation-Smad2,p-Smad2)蛋白表达变化;采用荧光半定量RT-PCR法检测各组Smad2mRNA表达变化。结果对照组磷酸化Smad2蛋白少量表达,阳性细胞率为(21.40±1.51)%。TGF-β_1组阳性细胞率为(70.00±3.23)%,30 min时表达开始升高,1 h及2 h时表达明显增高,6 h表达开始下降。各时间点LEF-1组和LEF-2组磷酸化Smad2蛋白表达下降,阳性细胞率分别为(23.60±2.80)%和(25.81±1.29)%,细胞荧光强度呈减弱趋势。与TGF-β_1组相比,LEF-1组和LEF-2组磷酸化Smad2蛋白表达下降,差异有显著意义(P0.05)。但LEF-1组和LEF-2组与对照组比较,差异无显著意义(P0.05)。肾小球系膜细胞中Smad2mRNA相对表达量,TGF-β_1组显著高于对照组,2 h时达高峰。LEF-1组和LEF-2组Smad2mRNA显著低于TGF-β_1组,差异有显著意义(P0.01);但LEF-1组和LEF-2组间比较,差异无显著意义(P0.05)。LEF-1组和LEF-2组Smad2mRNA相对表达量1h时较低,之后逐渐升高,说明随时间延长,来氟米特对体外培养的肾小球系膜细胞干预作用逐渐减弱。结论经转化生长因子-β_1刺激后,体外培养的大鼠肾小球系膜细胞磷酸化Smad2蛋白和Smad2mRNA相对表达量分别增加,来氟米特可降低Smad2蛋白和Smad2mRNA表达水平,为来氟米特的肾脏保护作用提供理论依据。     

黄曲霉毒素G_1对原代培养人食管鳞状上皮细胞HLA-Ⅰ分子表达影响的研究

目的探讨黄曲霉毒素G1(AFG1)对体外培养的人食管鳞状上皮细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的影响。方法采用原代培养、免疫印迹(Western blot)和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析方法研究不同浓度AFG1(50、100、1000和2000μg/L)处理后人食管鳞状上皮细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的变化。结果免疫印迹结果表明,经不同浓度AFG1(50、100、1000、2000μg/L)处理细胞24h后,100、1000、2000μg/L AFG1处理组HLA-ABC的蛋白表达均明显低于溶剂对照组(P<0.05),而且在100～2000μg/L浓度范围内,人食管鳞状上皮细胞表面HLA-Ⅰ分子的表达逐渐降低,两者呈明显的负相关关系(r=-0.921,n=3,P<0.01)。RT-PCR检测在mRNA水平进一步证实了AFG1对HLA-ABC表达的影响。其中100、1000、2000μg/L AFG1处理细胞后,HLA-A mRNA的表达明显低于溶剂对照组(P<0.05);2000μg/L处理组HLA-B mRNA的表达较溶剂对照组降低(P<0.05);而各AFG1处理组HLA-C mRNA的表达没有明显影响。结论 AFG1处理可以抑制人食管鳞状上皮细胞表面HLA-Ⅰ分子的表达。     

Gal-1通过MMP-9促胃癌侵袭转移的机制研究

目的探讨Gal-1蛋白促胃癌细胞侵袭转移的可能机制。方法采用0、1和5μg/m L的Gal-1蛋白体外刺激胃癌细胞,利用肿瘤细胞侵袭模型分析Gal-1蛋白对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响;利用WB实验和明胶酶谱法,分别检测Gal-1蛋白刺激前后胃癌细胞中MMP-9的表达及活性变化,分析Gal-1促胃癌转移的可能分子机制。结果细胞迁移实验显示,胃癌细胞BGC-823经1和5μg/m L的Gal-1蛋白刺激后穿膜细胞数分别为(117±8.19)和(167±7.55)个,明显高于0μg/m L组的(67±4.58)个(P0.05);胃癌7 901细胞经1和5μg/m L的Gal-1蛋白刺激后穿膜细胞数分别为(151±5.13)和(190.3±6.8)个,高于0μg/m L组的(87±6.56)个(P0.05)。细胞侵袭实验显示,BGC-823经1和5μg/m L的Gal-1蛋白刺激后穿膜细胞数分别为(51±3.6)和(76.7±9.07)个,明显高于0μg/m L组的(22.7±4.16)个(P0.05);胃癌7 901细胞经1和5μg/m L的Gal-1蛋白刺激后穿膜细胞数分别为(74.0±7.21)和(105.3±11.37)个,高于0μg/m L组的(42.3±6.66)个(P0.05)。WB实验显示,经Gal-1蛋白刺激后,胃癌细胞中MMP-9的表达增高。明胶酶谱实验显示,Gal-1蛋白刺激后,MMP-9酶活性增强。结论 Gal-1蛋白能促进胃癌细胞的侵袭迁移能力,可能与其能增强胃癌细胞中的MMP-9表达和活性有关。     

三氯乙酸对L-02细胞DNA甲基化转移酶1蛋白及mRNA表达的影响

目的探讨三氯乙酸(TCA)染毒对L-02细胞DNA甲基化转移酶1(DNMT1)蛋白及mRNA表达的影响。方法取处于对数生长期的正常肝细胞(L-02细胞),分别加入含0(对照)、0.1、0.3、0.9 mmo/L TCA的培养液继续培养24、48、72 h,同时,设DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-d C,5μmol/L)处理组,TCA-re组(0.9 mmol/L TCA处理后换正常培养基继续培养24 h)和人肝癌(HepG2)细胞组作为对照。检测细胞DNMT1蛋白和mRNA的表达水平。结果与对照组比较,各浓度TCA染毒组及5-aza-d C处理组、TCA-re组L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均较低,而HepG2细胞组DNMT1 mRNA的表达水平较高,差异均有统计学意义(P0.05)。与相同剂量TCA染毒24 h比较,各浓度TCA染毒48、72 h后L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均较低,除0.1、0.9 mmol/L TCA染毒48 h外,差异均有统计学意义(P0.05)。且随着TCA染毒浓度的升高和染毒时间的延长,L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均呈下降趋势。与0.9 mmol/L TCA染毒组比较,TCA-re组L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平较高,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,各浓度TCA染毒组及5-aza-d C处理组L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均较低,除0.1 mmol/L TCA染毒24、48 h及0.3mmol/L TCA染毒24 h外,差异均有统计学意义(P0.05);而TCA-re组L-02细胞和HepG2细胞组DNMT1蛋白的表达水平均无明显变化。与相同剂量TCA染毒24 h比较,各浓度TCA染毒48、72 h后L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P0.05)。除TCA染毒24 h时L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平随染毒浓度的升高而呈先升高后下降的趋势外,随着TCA染毒浓度的升高和染毒时间的延长,L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均呈下降趋势。与0.9 mmol/L TCA染毒组比较,TCA-re组L-02细胞DNMT1蛋白表达水平较高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 TCA体外染毒可能通过抑制DNMT1的表达维持或者促进细胞的DNA低甲基化状态。     

Ox-LDL通过LOX-1促进NRK52E细胞摄取脂质的实验研究

目的 探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）在氧化低密度脂蛋白（oxLDL）刺激肾小管上皮细胞摄取脂质中的作用.方法 体外培养NRK52E,加入不同浓度（0,25,50,100μg/ml）的ox-LDL及预先与LOX-1阻滞剂多聚肌苷酸（polyinosonic acid,poly I）和爱兰苔胶（carrageenan）作用2 h,再加入50μg/ml的ox-LDL,24 h后用Realtime-PCR测定LOX-1 mRNA的表达水平,Western blot测定LOX-1蛋白表达,用油红O法测定细胞内脂质聚集情况.结果 在25～100μ/ml范围内随着ox-LDL浓度的增加,LOX-1 mRNA和蛋白的表达增加,分别为0 μg/ml的2.13、10.14、20.81倍和2.53、12.18、21.45倍,各组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05）;而随着LOX-1 mRNA和蛋白的表达增加细胞内脂质聚集也增加,分别为0μg/ml的3.2,6.4和12.5倍（P〈0.05）;polyI或carrageenan使50μg/ml的ox-LDL诱导的LOX-1 mRNA和蛋白的表达分别下降（48%,47%）和（72%,65%）,同时细胞内脂质聚集减少41%和49%,LOX-1与细胞内脂质呈正相关（r=0.97,P〈0.05）.结论 ox-LDL诱导NRK52E细胞表达LOX-1,又通过LOX-1促进脂质在细胞内聚集从而损伤细胞,这种诱导作用可被LOX-1的阻断剂部分阻断.     

1-脱氧野尻霉素对高糖培养小鼠系膜细胞增殖及细胞外基质合成作用研究

目的 观察1-脱氧野尻霉素(DNJ)对高糖培养小鼠系膜细胞增殖、合成细胞外基质(ECM)的影响。方法 体外培养小鼠系膜细胞,用MTT法检测细胞增殖,用ELISA法测定细胞上清液中Ⅳ型胶原、小鼠纤维连接蛋白(FN)含量,用半定量RT-PCR法检测TGF-β1mRNA、PPARγmRNA表达。结果 (1)高糖组(HG)48 h促细胞增殖(P<0.05);HG 72 h、96 h均抑制细胞增殖(P<0.05)。甘露醇组(MG)与正常糖组(NG)比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)DNJ抑制高糖培养细胞增殖作用呈剂量和时间依赖性。选定HG+5 mmol/L DNJ作用48 h进一步实验。(3)高糖组Ⅳ型胶原、FN合成、TGF-β1mRNA、PPARr mRNA表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)。NG与MG相比差异无统计学意义(P>0.05)。(4)HG+DNJ 5 mmol/L组显著抑制高糖组Ⅳ型胶原、FN合成、TGF-β1mRNA表达升高(P<0.05),对PPARγ mRNA表达升高无影响。结论 DNJ可抑制高糖培养系膜细胞增殖及ECM合成增多,其机制与DNJ降低高糖培养系膜细胞TGFβ₁mRNA表达升高有关。     

氟化钠对大鼠成骨肉瘤细胞UMR-106成骨活性标志物的影响

目的研究氟化钠(Na F)对大鼠成骨肉瘤细胞UMR-106成骨活性标志物的影响。方法体外培养的UMR-106细胞,分别以0,500,1 000,2 000μmol/L Na F处理24h、48h、72h。应用实时荧光定量PCR法检测各组碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、I型胶原蛋白(Col I)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)mRNA的表达;采用磷酸苯二钠法及蛋白免疫印迹法检测各组ALP活性和Col I、Runx2蛋白表达。结果 Na F处理UMR-106细胞24h后,各浓度Na F均能刺激BGP基因表达;与对照组比较,Na F浓度高于1 000μmol/L时,ALP、Runx2、BMP-2基因表达减弱;Na F处理72h后,500μmol/L组ALP、Runx2、BGP基因表达上调;Na F处理48h、72h后,当Na F浓度高于1000μmol/L时,ALP、Runx2、BMP-2表达及Ⅰ型胶原的合成随着Na F浓度的增高,抑制作用逐渐增强。UMR-106细胞及细胞培养液中ALP活性在24h 2 000μmol/L组及48h,72h 1 000μmol/L组明显升高,随着Na F浓度的升高,UMR-106细胞Col I蛋白的表达呈下降趋势。Runx2蛋白在2 000μmol/L组降低,差异有统计学意义。结论氟化钠对成骨肉瘤UMR-106细胞成骨活性具有双向作用,与氟化钠剂量及细胞因子间联合作用有关。     

福辛普利对大鼠肾小球系膜细胞增殖及转化生长因子β1表达的影响

目的观察新型血管紧张素转化酶抑制剂（angiotension—converting enzyme inhibitor，ACED——福辛普利（fosinopril，FOS）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell，GMC）增殖及转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1表达的影响。方法建立体外培养大鼠肾小球系膜细胞，鉴定后3～10代用于实验。实验分为5组：对照组（Ctrl组）、脂多糖刺激组（LPS组）、福辛普利高、中、低剂量组（分别为FOS1组、FOS2组和FOS3组），分别于24h和48h两个时间点甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法测定各组细胞增殖情况；于6h，12h，24h后酶联免疫测定（enzyme—linked immunosorbent—assay，ELISA）法测定细胞培养上清液中转化生长因子β1蛋白的表达量，荧光半定量RT～PCR法检测转化生长因子β1mRNA表达的变化。结果脂多糖可诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖，福辛普利可抑制脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖；正常培养的大鼠肾小球系膜细胞均有一定量的转化生长因子β1蛋白分泌和mRNA表达；LPS组在各时间点转化生长因子β1蛋白分泌和mRNA表达均高于Ctrl组（P〈0．01），而FOS1组、FOS2组、FOS3组转化生长因子β1蛋白分泌和mRNA表达均低于LPS组（P〈0．01）。结论脂多糖可诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖。福辛普利可抑制脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖。福辛普利能够从蛋白水平和mRNA水平抑制脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞转化生长因子β1的表达，为福辛普利的肾脏保护作用提供理论依据。     

1α,25(OH)_2D_3对大鼠成骨细胞КB受体活化因子配体及骨保护素蛋白表达的影响

目的研究1α,25-二羟维生素D3(1α,25(OH)2D3)对体外培养3～4d的SD大鼠成骨细胞(OB)核因子κB受体活化因子配体(RANKL)及骨保护素(OPG)蛋白和mRNA表达的影响。方法1α,25(OH)2D3作用24、48、72h,分别采用ELISA及FQ-PCR法测定。结果10、100nmol/L1α,25(OH)2D3较对照及1nmol/L显著或极显著促进RANKL蛋白及mRNA表达;1、10nmol/L1α,25(OH)2D3较对照显著或极显著促进OPG蛋白及mRNA表达,而100nmol/L则极显著抑制OPGmRNA表达;RANKLmRNA/OPGmRNA及RANKL/OPG显示,1nmol/L组与对照组差异不显著,10、100nmol/L组RANKLmRNA/OPGmRNA及RANKL/OPG极显著高于对照组和1nmol/L组。结论低浓度1α,25(OH)2D3(1nmol/L)对骨更新作用不明显,而中、高浓度1α,25(OH)2D(310、100nmol/L)能通过上调RANKLmRNA/OPGmRNA及RANKL/OPG比例,促进OC的生成及骨吸收功能,增强骨更新。     

高糖培养对大鼠肾小球系膜细胞内胆固醇含量的影响

目的观察高糖培养对大鼠肾小球系膜细胞内胆固醇含量的影响并探讨其可能机制。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞, 分为高糖培养组(高糖组, 培养基糖浓度为30 mmol/L)及正常糖培养组(正常组, 培养基糖浓度为5.5 mmol/L)。分别于培养24、36、48 h时, 用油红O染色及分光光度计比色法测定细胞内脂质含量, 采用细胞内蛋白印记法检测细胞低密度脂蛋白胆固醇受体(LDLR)和三磷酸腺苷结合盒A1(ABCA1)的表达。结果油红O染色提示培养36 h时高糖组细胞内脂滴少于正常组, 培养24 h及48 h时两组无明显差别。高糖组大鼠肾小球系膜细胞在培养36 h时细胞内总胆固醇(TC)及胆固醇酯(CE)显著低于正常组(P=0.028、0.029), 而游离胆固醇(FC)差异无统计学意义(P=0.306)。培养24、48 h时, 两组间细胞内TC、CE及FC差异均无统计学意义(均P>0.05)。高糖组大鼠肾小球系膜细胞LDLR表达量在培养24、36、48 h时均显著低于正常组(P=0.043、0.004、0.028), ABCA1表达量在培养24、36、48 h时均显著高于正常组(P=...     

矽肺患者肺泡巨噬细胞培养上清对人胚肺成纤维细胞c-myc基因表达的影响

目的 探讨矽肺患者肺泡巨噬细胞(AM)培养上清对人胚肺成纤维细胞(HEFB)c-myc基因表达的影响.方法 AM分为加尘组(SiO2,30μg/ml)和对照组,培养1、2、6、12、24和36 h,收集培养上清.Ⅲ代HEFB用质量分数为0.5%的血清培养液培养48 h使大部分细胞处于静止期后,加人SiO2刺激6 h的AM培养上清(S6组),用反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot方法观察c-mycmRNA和蛋白的时程变化.然后将各组AM上清与静止状态的HEFB孵育2和7 h,观察c-myc mRNA和蛋白表达的变化.结果 HEFB在静止状态时c-myc mRNA和蛋白的表达为0,在对照组中,培养不同时间的AM上清刺激了c-myc mRNA及蛋白的表达,以AM培养12 h的卜清作用最明显,比值分别为0.749±0.088和0.759±0.101.加尘组中各上清也刺激了c-myc mRNA和蛋白的表达,但作用高峰提前,以SiO2刺激6 h的上清作用最明显,比值分别0.982±0.147和0.978±0.141.与同期对照相比,SiO2刺激1、2和6 h的AM上清诱导mRNA和蛋白表达增多,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 SiO2激活的AM培养上清可促进HEFB c-myc基因的表达.     

缺氧条件下前列腺上皮细胞体外培养生长类激素受体的表达

目的 观察在缺氧条件下前列腺上皮细胞体外培养生长类激素受体表达的变化.方法 人前列腺上皮细胞株RWPE-1体外培养.在缺氧或有氧培养环境中分别于接种后4、8、12、24、48 h检测前列腺上皮细胞膜表面生长类激素受体:表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、转化生长因子B1受体(TGF-β1R)、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)基因和蛋白表达.基因表达采用RT-PCR法检测,蛋白表达采用免疫组织化学法检测.结果 缺氧和有氧培养时EGFR、FGFR、IGF-1R、TGF-β1R、VEGFR mRNA和蛋白的表达均呈上升趋势,差异有统计学意义(P＜0.01).从各时间点看,两种培养条件除4hEGFR mRNA和12 h EGFR蛋白表达,4 h IGF-1R mRNA和4、8 h IGF-1R蛋白表达,4、8 h TGF-β1R mRNA和TGF-β1R蛋白表达,4 hVEGFR mRNA表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各时间点均以缺氧培养时EGFR、FGFR、IGF-1R、TGF-β1R、VEGFR mRNA和蛋白表达高于有氧培养时(P＜0.01).结论 缺氧可刺激前列腺上皮细胞膜表面生长类激素受体表达的上调.     

活化蛋白-1和细胞周期蛋白在石英诱导的细胞周期改变中的作用

目的 探讨在石英刺激的人胚肺成纤维细胞(HELF)中AP-1/细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)通路在细胞周期改变中的作用.方法 建立稳定转染空载体PXJ的HELF系(HELF-PXJ)及空载体PXJ与反义cyclin D1质粒或反义细胞周期蛋白依赖激酶(CDK4)质粒分别共转染的HELF系(简称anti-D1和anti-K4),将HELF-PXJ、anti-D1和anti-K4细胞分为对照组和石英刺激组(共6组),各对照组不加任何处理,石英刺激组用200 μg/ml石英处理细胞24h.检测AP-1对石英诱导的cyclin D1、CDK和E2F-4表达改变的影响.AP-1的化学抑制剂姜黄素(curcumin) 20μmol/L预处理细胞1h后,200 μg/ml石英刺激24 h,将HELF分为4组,分别为HELF对照组、HELF+石英组、HELF+curcumin对照组、HELF+curcumin+石英组.用免疫印迹(Western blot)法和免疫荧光法检测cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达;运用反义RNA技术证明通路的上下游关系;用流式细胞术检测细胞周期变化.结果 200 μg/ml石英处理HELF细胞,cyclin D1和CDK4蛋白表达升高,E2F-4蛋白表达明显降低,而E2F-1蛋白的表达没有明显改变.HELF-PXJ+石英组G1期细胞所占比例下降,S期细胞所占比例升高,与HELF-PXJ对照组的差异有统计学意义(P＜0.05).抑制cyclin D1或CDK4表达后,与对照组比较,anti-D1+石英组和anti-K4+石英组G1期细胞和S期细胞百分比无明显变化.抑制AP-1活性,与HELF+石英组比较,HELF+curcumin+石英组cyclin D1和CDK表达均减低,E2F-4表达增多.结论200μg/ml石英可诱导cyclin D1和CDK4蛋白表达增高,E2F-4蛋白表达减少,并通过AP-1/cyclin D1通路诱导细胞周期改变.     

活化T细胞核因子在双酚A调控巨噬细胞分泌IL-10中的作用

研究活化T细胞核因子(NFAT)在环境内分泌干扰物双酚A(BPA)调控小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)分泌白细胞介素-10(IL-10)蛋白中的作用,为进一步研究BPA的免疫毒作用机制提供理论依据。将不同剂量的BPA(0.1、1、10、100及1000μmol/L)作用于RAW264.7细胞24 h、48 h,用CCK8试剂盒检测细胞活性。以1μg/ml脂多糖(LPS)为激活剂,以1、10、50、100μmol/L BPA作用细胞24 h,ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-10蛋白含量。10、100μmol/L BPA作用细胞4 h、12 h,用实时定量PCR方法测定IL-10、NFATc、NFATp基因表达。与对照组比较,1000μmol/L BPA无论作用24 h还是48 h均能明显抑制细胞活性(P0.01);LPS显著促进巨噬细胞分泌IL-10蛋白,50和100μmol/L BPA作用细胞24 h,与LPS组比较,显著抑制IL-10蛋白的分泌(P0.01);10μmol/L、100μmol/L BPA染毒4 h能明显促进NFATp mRNA表达(P0.01);染毒12 h时,IL-10 mRNA水平降低,差异有统计学意义(P0.05)。提示本实验条件下,NFATp在BPA调控巨噬细胞分泌IL-10蛋白中具有一定的作用。     

下调FoxM1 mRNA对子宫颈癌细胞的增殖及侵袭能力的影响

目的探讨宫颈癌细胞中叉头框转录因子(Fox M1) mRNA表达下调对其增殖、侵袭能力的影响。方法采用RNA干扰技术(si Fox M1)下调子宫颈癌细胞系C33A、Hela及Siha中的Fox M1 mRNA表达为干扰处理组,未经si FoxM1处理的子宫颈癌细胞系C33A、Hela及Siha作为对照组,采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹法(Westren-blot)检测转染24 h后两组Fox M1 mRNA、蛋白的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝染色观察两组转然后的细胞增殖能力,采用Transwell方法检测转染48 h后细胞的侵袭能力。结果 si Fox M1转染处理24 h后,干扰处理组的子宫颈癌细胞系C33A、Hela及Siha中的Fox M1 mRNA及蛋白表达水平均低于对照组(P<0. 05); si Fox M1转染处理48 h后,干扰处理组的子宫颈癌细胞系C33A、Hela及Siha增殖能力均低于对照组(P<0. 05); si Fox M1转染处理48 h后,干扰处理组的子宫颈癌细胞系C33A、Hela及Siha中的穿透Transwell小室的细胞数均低于对照组(P<0. 05)。结论宫颈癌细胞中Fox M1 mRNA表达下调可以抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭能力。     

绿茶多酚对牛内皮细胞窖蛋白-1表达影响

目的探讨绿茶多酚（GTPs）对牛内皮细胞窖蛋白-1（Cav-1）表达的影响。方法以体外原代培养的牛主动脉内皮细胞（BAECs）为研究对象;以4μg/ml的绿茶多酚分别作用于牛内皮细胞0,4,8,12,16和24 h,免疫印迹方法观察Cav-1的蛋白水平变化;RT-PCR检测窖蛋白-1的mRNA表达水平变化。结果Cav-1蛋白和mRNA表达水平在4μg/ml GTPs作用4 h开始下降,可以维持到8 h,在12 h后Cav-1蛋白和mRNA恢复到正常水平。结论绿茶多酚可降低内皮细胞窖蛋白-1的蛋白和mRNA表达,并且有时效性,可能是茶及其多酚改善内皮功能和预防心血管疾病的分子机制之一。     

Ag85B蛋白诱导小鼠脾淋巴细胞表达IL-2、IFN-γ及促进细胞增殖的实验研究

目的探讨结核分枝杆菌Ag85B蛋白在体外诱导BALB/c小鼠脾淋巴细胞表达IL-2和IFN-γ的能力及对细胞增殖的影响,以了解Ag85B基因表达在特异性细胞免疫应答中的作用。方法体外分离培养BALB/c小鼠脾淋巴细胞,除去蛋白中的内毒素,采用BCA法对Ag85B蛋白进行定量,10μg/ml浓度的蛋白与小鼠脾淋巴细胞共同孵育24、72 h,RT-PCR方法检测细胞培养液上清中IL-2和IFN-γ的表达;用不同浓度的Ag85B蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞24、48、72 h,MTT法检测其对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响。结果小鼠脾淋巴细胞在体外分离培养成功;经RT-PCR检测,Ag85B蛋白能诱导小鼠脾淋巴细胞表达IL-2和IFN-γ,对照组表达呈阴性;MTT法检测到Ag85B蛋白对小鼠脾淋巴细胞的增殖具有促进作用,在一定范围内呈时间和剂量依赖性,在同对照组的增殖比较中,除0.5μg/ml组在24、48 h差异无统计学意义外,其他浓度组在各个时间点差异均有统计学意义(P0.05)。结论结核分枝杆菌Ag85B蛋白能诱导小鼠脾细胞产生IL-2和IFN-γ因子,能在体外促进小鼠脾淋巴细胞增殖,诱导了特异性的T细胞免疫应答。     

他克莫司在体外对HepG2细胞增殖及细胞周期的影响

目的研究他克莫司在体外对肝癌细胞HepG2的细胞增殖、细胞周期及细胞周期蛋白A(cyclin A)表达的生物学影响。方法选择肝癌细胞HepG2进行体外培养,经含有不同浓度的他克莫司(低、中和高浓度组剂量分别为50μg/L、100和500μg/L、1 000和3 000μg/L,对照组0μg/L)的培养基干预后,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)及流式细胞技术,分别检测细胞增殖、细胞周期及cyclin A水平。结果①中浓度(500μg/L)和高浓度(1 000和3 000μg/L)的他克莫司对HepG2细胞有增殖抑制作用,且抑制作用随浓度的增加而增加,而低浓度的他克莫司则无抑制作用。②他克莫司对HepG2细胞周期的影响:中浓度(500μg/L)和高浓度(1 000和3 000μg/L)的他克莫司作用时,HepG2细胞停止在G0/G1期,从而对肿瘤细胞的生长有抑制作用,且抑制作用随浓度的增加而增加,而低浓度的他克莫司则无抑制作用。③他克莫司可以降低HepG2细胞中cyclin A的表达,且与浓度相关,他克莫司浓度越高,cyclin A表达越少。结论他克莫司在体外对HepG2增殖有抑制作用,其中cyclin A发挥一定的作用。     

TGF-β1-Smad2/3信号转导通路在百草枯中毒致肺纤维化中的作用

目的观察百草枯(PQ)染毒对人肺成纤维细胞的影响,探讨PQ中毒致肺纤维化中转化生长因子β1-Smad2/3蛋白(TGF-β1)-Smad2/3信号转导通路的作用。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),以终浓度为0、12.5、25、50、100、200、400μmol/L的PQ处理细胞24h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞存活率。使用终浓度50μmol/L PQ处理细胞6、8、12、24、48、72h,检测PQ在不同时间点对细胞的损伤程度。终浓度0、25、50、100μmol/L PQ处理细胞24h,酶联免疫吸附(ELISA)检测细胞TGF-β1蛋白表达水平,聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞TGF-β1 mRNA表达水平。为了观察PQ染毒对TGF-β1/Smad信号通路的影响,将MRC5细胞分成6组:正常对照组、25μmol/L PQ染毒组、50μmol/L PQ染毒组、100μmol/L PQ染毒组、TGF-β1阳性对照组、TGF-β1刺激组(100μmol/L PQ+50μmol/L TGF-β1),免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化Smad2/3蛋白(p-Smad2/3)表达水平。结果与对照组比较,MRC-5细胞存活率随着PQ剂量和时间的增加明显降低(P0.05),呈剂量和时间依赖性;ELISA显示,PQ作用MRC-5细胞24h后,TGF-β1蛋白表达升高至37.4、48.8、39.3μg/ml,但诱导作用呈非剂量依赖方式;RT-PCR显示,随着PQ浓度增加TGF-β1mRNA表达水平明显升高,分别是对照组的3.5、6.9和9.7倍,诱导作用呈剂量依赖方式(P0.05);Westem blot显示,浓度为25、50、100μmol/L PQ作用细胞24h后,p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平明显升高(P0.05),给予细胞100μmol/L PQ+50μmol/L TGF-β1共同刺激下,p-Smad2、p-Smad3蛋白量达到最多(P0.05)。结论TGF-β1、pSmad2、p-Smad3的异常表达参与了PQ致MRC5细胞损伤过程,TGF-β1/Smad信号通路激活在PQ致肺纤维化中发挥重要作用。