羧胺三唑对脂多糖诱导的RAW264．7细胞分泌炎症因子的影响’

目的研究羧胺三唑对脂多糖诱导的RAW264．7细胞炎症模型中炎症因子的影响。方法脂多糖（1μg／ml）刺激生长良好的RAW264．7细胞,建立细胞炎症模型,并用不同浓度羧胺三唑处理。CCK-8法检测羧胺三唑对RAW264．7细胞的毒性作用,ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量,分光光度法检测一氧化氮（NO）含量。结果羧胺三唑在2．5～40μmol／L的浓度范围内对RAW264．7细胞无毒性作用（P〉0．05）。脂多糖可以明显诱导RAW264．7细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和NO（P〈0．01）,10、20、40μmol／L的羧胺三唑能够显著抑制脂多糖诱导的RAW264．7细胞释放TNF-α、IL-6和NO的水平（P〈0．05和P〈0．01）,20、40μmol／L的羧胺三唑能够抑制脂多糖诱导的IL-1β的释放（P〈0．01）。结论羧胺三唑可以抑制脂多糖诱导的RAW264．7细胞炎症反应,其抗炎作用与减少炎症因子TNF—α,、IL-1β、IL-6和NO有关。     

谷氨酰胺在体内/外对巨噬细胞炎症因子分泌的影响

目的 观察谷氨酰胺(Gln)在体内/外条件下对巨噬细胞炎症反应及热休克蛋白(HSP)表达的影响,探讨Gin在脓毒症时抑制体内炎症反应的机制.方法 实验 1:将培养的腹腔巨噬细胞株RAW264.7分为Gln 0、0.5和8 mmol/L 3组,分别于内毒素脂多糖(LPS)刺激后0、1、4、12和24 h收集细胞及上清液.实验2:45只昆明小鼠被随机均分为假手术(Sham)组、模型组、Gin组;采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备小鼠脓毒症模型,术后即刻从尾静脉注射Gin 0.75 g/kg(Gln组)或等量生理盐水(Sham组和模型组).6 h后采血,腹腔灌洗分离巨噬细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液、血清、巨噬细胞裂解液中肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10浓度;用蛋白质免疫印迹法检测巨噬细胞HSP72蛋白表达.结果 体外条件下Gin可显著促进RAW264.7细胞释放TNF-a,IL-6和IL-10,呈剂量和时间依赖性(P＜0.05或P＜0.01),LPS刺激4 h后,Gln 8 mmol/L组RAW264.7细胞HSP72表达显著增加(P均＜0.01).体内条件下,Gin组腹腔巨噬细胞TNF-a、IL-6含量均明显低于模型组(P＜0.01和P＜0.05),3组间IL-10含量比较差异无统计学意义;Gln组血清TNF-a浓度明显低于模型组(P＜0.05),两组血清IL-6、IL-10浓度差异无统计学意义;Gin组巨噬细胞HSP72表达较模型组和Sham组均显著升高(P均＜0.01).结论 Gin体外作用时可显著促进巨噬细胞释放TNF-a和IL-6,且该作用不能被HSP72表达所抑制.体内作用条件下Gln抑制腹腔巨噬细胞合成TNF-a和IL-6.体外和体内条件下Gln都可诱导巨噬细胞表达HSP72,提示HSP72表达可能不是Gln在脓毒症时抑制机体炎症反应的主要机制.     

胰岛素样生长因子1对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)对血管平滑肌细胞凋亡的影响。方法脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞制备炎症模型即条件培养基(CM),未加LPS诱导组为对照组即非条件培养基(n CM)。体外培养血管平滑肌细胞,分别予n CM、CM、CM+IGF-1 60 ng/ml、CM+IGF-1 90 ng/ml、CM+IGF-1 120 ng/ml干预,用AnnexinⅤ-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)流式细胞术检测平滑肌细胞凋亡率。结果 RAW264.7细胞分别在LPS 0 ng/ml,10 ng/ml,100 ng/ml,1μg/ml,10μg/ml刺激下各组上清液中IL-6的浓度分别为(6.75±0.12)pg/ml,(7.82±1.53)pg/ml,(44.09±1.58)pg/ml,(155.71.0±23.93)pg/ml,(436.59±3.15)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.01);n CM、CM、CM+IGF-1 60 ng/ml、CM+IGF-1 90 ng/ml、CM+IGF-1 120 ng/ml条件下血管平滑肌细胞的凋亡率分别为(4.89±0.09)%,(10.86±0.15)%,(9.64±0.65)%,(3.85±0.51)%,(4.82±0.08)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论炎症可促进平滑肌细胞凋亡,但给予IGF-1后可减少平滑肌细胞凋亡,本实验中IGF-1抑制平滑肌凋亡的最适浓度为90 ng/ml。     

p38MAPK抑制剂对钛颗粒刺激巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的:探讨p38MAPK抑制剂(SB203580)对外培养的RAW246.7细胞分泌炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)]的影响。方法:以体外正常培养RAW246.7细胞为A组,以0.1 mg/m L钛颗粒(Ti Ps)刺激RAW246.7细胞为B组,以10μmol/L SB203580干预的B组细胞为C组。Western blot检测p-p38MAPK蛋白表达,ELISA检测细胞分泌TNF-α,IL-6水平。结果:与A组比较,B组p-p38MAPK蛋白含量培养液上清中TNF-α、IL-6含量都明显升高(P<0.05);与B组比较,C组p-p38MAPK蛋白明显抑制(P<0.05),培养液上清中TNF-α、IL-6含量都明显下降(P<0.05);与A组比较,C组p-p38MAPK蛋白明显抑制(P<0.05),培养液上清中TNF-α、IL-6含量亦有所减少,但两组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:Ti Ps能通过刺激RAW246.7细胞,激活p38MAPK通路,上调TNF-α、IL-6等炎症因子的表达。p38MAPK信号通路可作为抑制炎性骨溶解的新靶点,对临床上防治人工关节置换术后无菌性松动具有重要意义。     

TLR4基因的shRNA对内毒素刺激下RAW264.7细胞TLR2表达的影响及机制

目的 观察针对Toll样受体4的发夹结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)对内毒素刺激后小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞Toll样受体2表达的影响,并探讨其机制.方法 将携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP/TLR4-siRNA,运用脂质体Lipofectamine2000转染至小鼠巨噬细胞系RAW264.7.转染24 h后予新霉素(G418)筛选获取稳定转染细胞株.然后将细胞分为三组:空白组(Blank group),未转染细胞LPS刺激组(LPS group)和稳定转染细胞LPS刺激组(LPS-TLR4-siRNA group),采用荧光定量PCR及流式细胞学方法检测各组细胞TLR2 mRNA和蛋白的表达,Western blot检测NF-κB p65的表达,同时用ELISA方法检测细胞分泌的TNF-α水平的变化.结果 将pEGFP/TLR4-siRNA转染至RAW264.7细胞后,增强型荧光蛋白的表达为(45.25±9.23)%.LPS-TLR4-siRNA组细胞的TLR2mRNA及蛋白的表达均明显低于LPS组(P＜0.05),同时NF-κB p65表达下调及分泌TNF-α的水平下降(P＜0.01).结论 针对TLR4 mRNA的shRNA能降低LPS刺激下的RAW204.7细胞TLB2的表达.     

奈诺沙星对脂多糖诱导炎性反应的免疫调控作用

目的通过体外细胞学实验和体内动物实验来研究奈诺沙星是否对脂多糖(LPS)诱导的炎性反应具有调控作用。方法 (1)体外细胞学实验检测奈诺沙星对LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7产生炎性反应的调控作用。RAW264.7细胞液中先加入奈诺沙星,后加入LPS,在不同时间点收集奈诺沙星+LPS组和LPS组等各组细胞上清液,酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测白介素(IL)-6、IL-10以及肿瘤坏死因子(TNF)-α等细胞因子的含量;(2)低剂量LPS诱导小鼠炎性反应及奈诺沙星干预实验。小鼠先腹腔注射奈诺沙星再注射低剂量LPS(5 mg/kg),ELISA方法检测小鼠血清中IL-6、IL-10以及TNF-α等细胞因子的含量;(3)奈诺沙星对注射高剂量LPS小鼠保护作用的实验:小鼠腹腔注射高剂量的LPS(12.5mg/kg),2 h后开始腹腔注射奈诺沙星40 mg/kg,1次/12 h,记录0～72 h实验组和对照组小鼠的死亡率。结果 (1)体外细胞学实验显示奈诺沙星对LPS诱导RAW264.7产生的炎性反应有抑制作用,表现为奈诺沙星抑制IL-6、TNF-α等促炎因子的分泌,促进IL-10等抑炎因子的分泌;(2)体内动物实验结果显示奈诺沙星对低剂量LPS诱导小鼠的炎性反应也有抑制作用;(3)奈诺沙星能降低因高剂量LPS引起严重内毒素血症小鼠的死亡率。奈诺沙星+LPS组总体死亡率为0/5,而LPS组总体死亡率为3/5。结论奈诺沙星对宿主感染LPS具有免疫调节作用,可以抑制宿主产生的过度免疫反应,对宿主具有保护作用。     

HSF1与HMGB1和IL-10作用分子机制的体外研究及意义

目的:本研究以RAW264.7细胞系为研究对象,烧伤血清刺激建立烧伤细胞模型,在体外研究HSF1的抗炎症机制.方法:Western blot法检测烧伤血清刺激前后RAW264.7细胞中HSF1与NF-κB表达,凝胶阻滞法(EMSA)检测HSF1与炎症因子HMGB1和抗炎症因子IL-10基因启动子区相互作用,同时检测NF-κB是否参与上述的相互作用.结果:正常培养条件下的RAW264.7细胞几乎不表达HSF1,少量表达NF-κB,加入烧伤血清刺激后大量表达HSF1和NF-κB.HSF1与HMGB1和IL-10基因的启动子区HSE有相互作用.NF-κB不参与HSF1与HMGB1和IL-10基因启动子区HSE的结合.结论:HSF1与HMGB1和IL-10的启动子区HSE结合,抑制HMGB1的表达,促进IL-10的表达.在炎症反应中HMGB1和IL-10的表达不直接受NF-κB的调节.     

羧胺三唑对TNF-α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞中细胞因子分泌和NF-κB活化的影响

目的 探讨羧胺三唑对TNF-α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞分泌促炎细胞因子的影响及部分机制.方法 用弗氏完全佐剂诱导大鼠佐剂性关节炎模型,分离培养的佐剂性关节炎成纤维样滑膜细胞用20 ng/ml TNF-α刺激并用不同浓度羧胺三唑（10、20、40 μmol/L）处理.ELISA法检测成纤维样滑膜细胞上清中IL-1β和IL-6含量,Western blot法检测NF-KB p65的蛋白表达.结果 经20 ng/mlTNF-α刺激后,成纤维样滑膜细胞分泌IL-1β和IL-6水平,以及细胞核中NF-KB p65的表达显著增加（P＜0.01）.羧胺三唑（20、40 μmol/L）能够显著抑制TNF-α诱导的IL-1β[（417.39 ＋29.80） pg/mlvs.（264.63±9.35） pg/ml,（186.13±25.71）pg/ml,P ＜0.01]和IL-6[（383.45±32.13） pg/ml vs.（248.39±30.51） pg/ml,（189.64±27.86） pg/ml,P＜0.01]分泌,且明显减少细胞核中NF-κB p65的表达（P＜0.01）.结论 羧胺三唑可能通过抑制NF-KB活化来减少TNF-α诱导的佐剂性关节炎成纤维样滑膜细胞中促炎细胞因子IL-1β、IL-6的产生.     

普罗布考对脂多糖刺激下大鼠腹膜间皮细胞白细胞介素18的表达和对氧化应激的影响

目的 研究普罗布考对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下大鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)和氧化应激产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)表达的影响.方法原代培养RPMC,第3代腹膜间皮细胞达80%融合时进入试验.用无血清培养液培养24 h使细胞同步化.随机分组:①正常对照组:只加无血清DMEM/F12培养液;②LPS组:不同浓度LPS(1,10,100 mg/L)培养6 h;10 mg/L LPS分别作用于RPMC 0,3,6,12,24 h;③普罗布考组:20,40,80 μmol/L普罗布考预孵育1 h,加入10 mg/L LPS再作用11 h.用实时聚合酶链反应法检测IL-18 mRNA的表达,酶联免疫吸附法检测细胞上清液中IL-18的蛋白水平,硫代巴比妥酸法检测细胞中MDA的含量.结果与正常对照组比较,LPS刺激下RPMC IL-18和MDA的表达明显增加(P＜0.05),且呈浓度依赖性;随着刺激时间的延长,上述指标呈递增趋势,IL-18于12h达高峰(P＜0.01).与10 mg/L LPS组比较,普罗布考可抑制IL-18及MDA的表达(P＜0.05),随普罗布考浓度增加,抑制作用越强.结论 LPS作用下RPMC促炎症因子IL-18及氧化应激产物MDA表达增加,普罗布考能抑制上述指标的表达,修复间皮细胞的损伤,改善腹膜炎症状态.     

锌指蛋白A20对脂多糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞炎症效应的影响

目的 探讨锌指蛋白A20（zinc finger protein A20）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）炎症效应的影响及可能机制. 方法 分离及培养RPMCs,常规传代及鉴定.取第2代细胞用于实验研究.将细胞随机分成对照组、LPS组、转染A20组、空载体组.脂质体转染A20质粒（pGEM-T easy A20）至RPMCs 12h后分别在LPS刺激不同时间点收获细胞提取蛋白及细胞上清液.用Western b]otting检测细胞TLR4、p-Iκ Bα、IκBα蛋白的表达;用ELISA法检测培养上清液IL-18蛋白水平. 结果 LPS刺激8h后,转染A20组RPMCs TLR4蛋白表达水平无明显增高,与对照组相比,P=0.223;与LPS组及空载体组相比,差异有显著性（P=0.003,0.002）.LPS刺激1h后,转染A20组RPMCs p-IκB α蛋白无明显降解,p-I κ Bα/I κ Bα比值与对照组相比,P=0.553.与LPS组及空载体组相比,差异有显著性（P=0.001,0.001）.在LPS刺激12h后,转染A20组RPMCs IL-18蛋白分泌水平（479.12±85.79）pg/ml高于对照组（274.34±47.21） pg/ml （P=0.012）,但明显低于LPS组（1049.45±185.01）pg/ml及空载体组（1028.77±192.90） pg/ml （P=0.011,0.015）.结论 A20通过对LPS信号通路中多个相关功能蛋白的负性调控作用,阻抑LPS诱导的RPMCs炎症效应.     

瘦素对RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α表达的影响

背景:瘦素是脂肪组织分泌的一种多肽激素,研究显示瘦素在动脉粥样硬化形成中发挥了一定重要的作用。目的:观察瘦素对鼠源性巨噬细胞系RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α表达的影响,并从核转录因子κB活性变化角度探讨其可能机制。设计:对照观察实验。单位:华中科技大学同济医学院生物化学及分子生物学系。材料:实验于2005-04/2006-02在华中科技大学同济医学院生物化学及分子生物学系及附属协和医院普外科实验室完成。将培养的RAW264.7细胞分为不同浓度瘦素处理组(12.5,25,50,100μg/L)、IkappaB激酶抑制剂组及空白对照组。每组3瓶,重复实验3次。方法:将鼠源性巨噬细胞株RAW264.7细胞以1×109L-1密度接种于6孔板中,用含体积分数为0.1的小牛血清的RPMI-1640培养基培养。待RAW264.7细胞生长至80%时,换用无血清培养基Opti-MEM继续培养24h后,将细胞分为不同浓度瘦素处理组(12.5,25,50,100μg/L)及空白对照组,瘦素孵育4h后采用反转录-聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子α在mRNA水平的表达。上述分组细胞经瘦素分别孵育1,3,6和9h后采用双抗夹心酶联免疫吸附实验检测肿瘤坏死因子α在蛋白水平的表达。上述分组细胞经瘦素孵育不同时间后采用凝胶迁移率实验检测细胞核内核转录因子κB活性。将RAW264.7细胞分为以下4组:空白对照组、IkappaB激酶特异性抑制剂PS1145(10μmol/L)处理组、瘦素(50μg/L)处理组、瘦素(50μg/L) PS1145(10μmol/L)组,各组孵育时间均为6h,分别检测细胞核内核转录因子κB活性及肿瘤坏死因子α在mRNA水平的表达。主要观察指标:①不同浓度瘦素对RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α:mRNA表达水平的影响;蛋白分泌的影响。②不同浓度瘦素对RAW264.7细胞核内核转录因子κB活性的影响。③抑制IkappaB激酶活性对瘦素诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α的影响。结果:①RAW264.7细胞经不同浓度的瘦素处理后,肿瘤坏死因子α在mRNA水平呈瘦素剂量依赖性增加,50μg/L瘦素处理组达峰值。②蛋白水平的表达呈瘦素剂量时间依赖性增加,50μg/L瘦素处理6h即可达峰值。③核转录因子κB的活性亦与瘦素浓度正相关,50μg/L瘦素处理6h后核转录因子κB活性最高(P<0.05)。④抑制IkappaB激酶活性可部分抑制肿瘤坏死因子α的表达。结论:瘦素可直接促进RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α的表达和分泌,并呈剂量时间依赖性,其机制可能与瘦素激活核转录因子κB有关。这可能是瘦素致动脉粥样硬化的机制之一。     

硫化氢对急性肺损伤大鼠白细胞介素的调节

目的 研究气体信号分子硫化氢(H2S)在油酸诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)中的作用及其在ALI中对炎症反应的调节.方法 采用鼠尾静脉缓慢注射油酸(OA,0.01 ml/kg)复制大鼠急性肺损伤模型,将SD大鼠49只随机分为三组:对照组、OA组及OA+硫氢化钠(NaHS)组.OA组和OA+NaHS组分为2 h、4 h、6 h三个观察点.对照组鼠尾静脉注射生理盐水(0.01 ml/kg),观察6 h.测定动脉血氧分压(PaO2)、肺湿干重比(W/D)、肺泡灌洗液中性粒细胞百分比(PMN%),光镜下半定量肺损伤评分(IQA),用敏感硫电极法检测血浆、肺组织匀浆H2S含量,用双抗体夹心ELISA法测定血浆、肺组织匀浆IL-6、IL-8和IL-10的含量.多组样本的均数的比较采用单因素差分析.结果 油酸鼠尾静脉注射可引起肺组织明显的形态学改变;与对照组比,OA组可见PaO2下降,W/D、PMN%、IQA增加(P＜0.01),在2 h、4 h、6 h时,血浆中H2S[对照:(36.58±6.80)μmol/L,2 h:(21.30±2.75)μmol/L,4 h:(20.63±1.26)μmol/L,6 h:(20.00±1.60)μmol/L,P＜0.01]以及肺匀浆中H2S[对照:(27.61±2.20)μmol/L,2 h:(20.67±1.37)μmol/L,4 h:(20.79±1.10)μmol/L,6 h:(18.92±0.75)μmol/L,P=0.000]均明显降低,血浆中IL-6[对照:(73.95±14.68)pg/ml,2 h:(186.70±23.85)pg/ml,4 h:(238.50±26.46)pg/ml,6 h:(215.95±25.86)pg/ml,P＜0.01]、肺匀浆中IL-6[对照:(60.58±12.91)pg/ml,2 h:(160.32±24.57)pg/ml,4 h:(195.27±46.28)pg/ml,6 h:(185.66±17.42)pg/ml,P＜0.01]均显著增加,血浆IL-8[对照:(80.69±20.42)pg/ml,2 h:(184.11±19.51)pg/ml,4 h:(286.20±53.34)pg/ml,6 h:(241.30±45.85)pg/ml,P＜0.01]、肺匀浆中IL-8[对照:(69.14±15.96)pg/ml,2 h:(174.10±20.36)pg/ml,4 h:(249.02±31.17)pg/ml,6 h:(237.74±34.18)pg/ml,P＜0.01]均显著增加,血浆IL-10[对照:(39.78±8.97)pg/ml,2 h:(111.18±11.46)pg/ml,4 h:(115.60±13.91)pg/ml,6 h: (102.41±9.93)pg/ml,P＜0.01]、肺匀浆中IL-10[对照:(71.86±14.19)pg/ml,2 h:(126.96±18.72)pg/ml,4 h:(151.88±27.61)pg/ml,6 h:(137.28±14.22)pg/ml,P＜0.01]含量均显著增加.而预先给予NaHS能减轻油酸引起的肺损伤,显著提高血浆和肺匀浆中H2S含量[4 h,血浆:(26.67±3.44)μmol/L vs(20.63±1.26)μmol/L,P=0.042;肺匀浆:(23.20±1.48)μmol/L vs(20.79±1.10)μmol/L,P=0.011;6 h,血浆:(26.98±4.93)μmol/L vs(20.00±1.60)μmol/L,P=0.022;肺匀浆:(21.43±1.79)μmol/L vs(18.92±0.75)μmol/L,P=0.016),同时血浆IL-6(185.37±21.98 pg/ml vs 238.50±26.46 pg/ml,4 h,P＜0.01;(124.22±21.84)pg/ml vs(215.95±25.86)pg/ml,6 h,P＜0.01 ]、IL-8[(199.40±34.56)pg/ml vs(286.20±53.34)pg/ml,4h,P＜0.01;(146.58±20.23)pg/ml vs(241.30±45.85)pg/ml,6 h,P＜0.01]含量明显降低,而IL-10含量增高[(154.48±18.08)pg/ml vs(115.60±13.91)pg/ml,4 h,P=0.000;(138.06±20.01)pg/ml vs(102.41±9.93)pg/ml,6 h,P=0.1300].结论 油酸诱导的大鼠ALI内源性H2S生成减少.外源性H2S通过抑制炎症因子IL-6和IL-8的表达,增加抗炎因子IL-10的表达,进而改变炎症/抗炎因子之间的比例,对油酸诱导的大鼠急性肺损伤起保护作用.     

微弧氧化镁合金对巨噬细胞肿瘤坏死因子和白细胞介素6的影响

背景:微弧氧化处理可提高镁合金的抗腐蚀性能,延缓其降解速率.目的:观察微弧氧化处理镁合金对小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的影响.方法:在小鼠RAW264.7细胞中分别加入镁合金浸提液(对照组)、微弧氧化处理镁合金浸提液(实验组)及RPMI-1640(空白对照组),1 h后加入脂多糖,作用24 h后,收集细胞上清液,检测肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平,MTT法测定脂多糖刺激前后的RAW264.7细胞活性.结果与结论:①脂多糖刺激前的RAW264.7细胞活性:对照组>实验组>空白对照组(P均<0.05).②脂多糖刺激后的 RAW264.7细胞活性:实验组与对照组高于刺激前,但差异无显著性意义;空白对照组明显高于刺激前(P <0.01).3组间RAW264.7细胞活性差异无显著性意义(P >0.05).③脂多糖刺激后RAW264.7细胞白细胞介素6与肿瘤坏死因子α的表达量:对照组白细胞介素6表达量明显高于实验组和空白对照组(P <0.05);3组肿瘤坏死因子α表达量两两之间比较差异无显著性意义(P >0.05).表明微弧氧化处理镁合金对小鼠巨噬细胞活性无明显影响,同时降低了炎性反应.     

替加环素对脂多糖诱导的脓毒症的免疫调节作用

目的 通过细胞学实验和动物实验来研究替加环素是否对脂多糖（LPS）诱导的炎性反应具有调控作用。方法 (1)检测替加环素对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的增殖活性影响；(2)检测替加环素对LPS诱导的RAW264.7产生炎性反应的调控作用。RAW264.7细胞液中先后加入替加环素和LPS，不同时间点收集LPS组和替加环素+LPS组等各组上清液，ELISA检测细胞因子含量；(3)低剂量LPS诱导小鼠炎症反应及替加环素干预实验。小鼠先尾静脉注射替加环素（6.5 mg/kg）再注射LPS(15 mg/kg),ELISA检测各时间点血清细胞因子，24 h处死后取脾脏行流式检验，并记录24 h内小鼠的死亡情况。结果 (1)替加环素对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的增殖活性有促进作用；(2)替加环素对LPS诱导RAW264.7产生的炎性反应有抑制作用，减少IL-6、IFN-γ、CCL5等细胞因子的分泌，增加IL-10分泌；(3)替加环素对LPS诱导小鼠的炎症反应也有类似的抑制作用；流式细胞仪检测发现替加环素可促进内毒素血症状态下巨噬细胞的M2极化；对小鼠死亡有一定的保护作用。结论 替加环素对宿主...     

iPSC-MSC来源的外泌体对LPS刺激肺泡巨噬细胞产生炎性因子的影响

目的探讨i PSC-MSC来源的外泌体(exosome,Exo)对LPS刺激的肺泡巨噬细胞释放炎性因子的作用。方法采用旋转超滤法提纯i PSC-MSC外泌体,以无外泌体培养基培养肺泡巨噬细胞NR8383,分别给予Exo(50μg/ml)、LPS(50ng/ml)、LPS(50ng/ml)+Exo(50μg/ml)培养24h,以不含Exo和LPS培养为对照组,利用酶联免疫标记法(ELISA)检测各组上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白浓度。结果提取物经透射电镜观察为圆形或半圆形囊泡,直径40~100nm,表达Exo标志物CD9和CD63;LPS组上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度(435.38±36.31pg/ml、319.76±39.14pg/ml和408.33±43.44pg/ml)与空白对照组(37.48±8.75pg/ml、33.51±7.88pg/ml和37.73±8.46pg/ml)和Exo组(38.71±9.14pg/ml、32.05±6.81pg/ml和42.84±6.54pg/ml)比较显著上调(P0.01);LPS+Exo组TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度(369.30±32.74pg/ml、249.23±36.77pg/ml和328.91±46.45pg/ml)与LPS组相比,明显减少(P0.05);空白对照组与Exo组的TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度无显著性差异。结论成功富集Exo;i PSC-MSC来源的Exo可抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞表达炎性因子。     

氯化镧阻断LPS诱导巨噬细胞钙信号通路激活及TNF-α释放

目的探讨氯化镧(LaCl3)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞钙信号通路激活及肿瘤坏死因子α(TNF-α)释放的影响。方法将巨噬细胞RAW 264.7随机分成四组:LPS组(培养液中含1μg/ml LPS),LaCl3+LPS组(以含2.5μmol/ml LaCl3的培养基孵育细胞一定时间后,再予以1μg/ml LPS刺激),LaCl3组(培养液中含2.5μmol/ml LaCl3)及对照组(培养液中不含LaCl3和LPS)。于不同时间点分别收集各组细胞及其培养上清待测。以Fluo-3/Am加载细胞,经上述不同分组处理一定时间后,流式细胞术观察细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中TNF-α水平。结果流式细胞术测定结果显示:LPS组细胞内[Ca2+]i为(336.67±26.16nmol/L),与对照组比较差异显著(P0.01);LaCl3+LPS组(162.67±26.41nmol/L)显著低于LPS组(P0.01);LaCl3组(29.84±6.42nmol/L)与对照组相比略低但无统计学意义(P0.05)。LPS组细胞培养上清TNF-α含量(152.19±15.68pg/ml)与对照组相比,显著升高(P0.01);而LaCl3+LPS组细胞培养上清中TNF-α含量为43.95±6.55 pg/ml,与LPS组相比显著下降(P0.01)且与对照组相比无差异;LaCl3组细胞培养上清中TNF-α含量(27.84±3.73pg/ml)与LPS组相比显著下调(P0.01),并且与对照组相比亦显著下调(P0.05)。结论一定浓度的LaCl3可阻断LPS诱导巨噬细胞钙信号通路激活及抑制TNF-α的释放。     

氯化镧阻断LPS诱导巨噬细胞钙信号通路激活及TNF-α释放

目的探讨氯化镧（LaCl3）对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导巨噬细胞钙信号通路激活及肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放的影响。方法将巨噬细胞RAW 264.7随机分成四组：LPS组（培养液中含1μg/ml LPS）,LaCl3＋LPS组（以含2.5μmol/ml LaCl3的培养基孵育细胞一定时间后,再予以1μg/ml LPS刺激）,LaCl3组（培养液中含2.5μmol/ml LaCl3）及对照组（培养液中不含LaCl3和LPS）。于不同时间点分别收集各组细胞及其培养上清待测。以Fluo-3/Am加载细胞,经上述不同分组处理一定时间后,流式细胞术观察细胞内Ca2＋浓度（[Ca^2＋]i）的变化;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中TNF-α水平。结果流式细胞术测定结果显示：LPS组细胞内[Ca^2＋]i为（336.67±26.16nmol/L）,与对照组比较差异显著（P〈0.01）;LaCl3＋LPS组（162.67±26.41nmol/L）显著低于LPS组（P〈0.01）;LaCl3组（29.84±6.42nmol/L）与对照组相比略低但无统计学意义（P〉0.05）。LPS组细胞培养上清TNF-α含量（152.19±15.68pg/ml）与对照组相比,显著升高（P〈0.01）;而LaCl3＋LPS组细胞培养上清中TNF-α含量为43.95±6.55 pg/ml,与LPS组相比显著下降（P〈0.01）且与对照组相比无差异;LaCl3组细胞培养上清中TNF-α含量（27.84±3.73pg/ml）与LPS组相比显著下调（P〈0.01）,并且与对照组相比亦显著下调（P〈0.05）。结论一定浓度的LaCl3可阻断LPS诱导巨噬细胞钙信号通路激活及抑制TNF-α的释放。     

血管内皮生长因子对脂多糖诱导的巨噬细胞极化和破骨细胞分化的影响

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)对在脂多糖(LPS)诱导下的RAW264.7巨噬细胞表型极化水平及破骨细胞分化的影响。方法 将处于对数生长期的RAW264.7细胞分为3组,培养周期为4 d, Control组为正常培养的RAW264.7细胞;LPS组为细胞接种贴壁后每次换液同时加入100 ng/mL LPS;LPS+VEGF组加LPS的方法与LPS组相同,第4天换液时加入1μg/mL VEGF。梯度密度培养RAW264.7细胞行甲苯胺蓝染色明确适宜种植密度;显微镜观察各组细胞形态变化;Western blot法检测各组白细胞介素(IL)-12、IL-10、精氨酸-1(Arg-1)蛋白表达水平;流式细胞术荧光标记测定各组巨噬细胞极化水平;抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测各组破骨细胞分化水平。结果 甲苯胺蓝染色明确细胞种植密度为2.5×10³/cm²。显微镜下观察LPS组出现大量M1型巨噬细胞,LPS+VEGF组出现少量M2型巨噬细胞。LPS+VEGF组IL-12蛋白表达量低于LPS组(P<0.05),IL-10和Arg-1蛋白表达量显著高...     

LncRNA-PVT1在巨噬细胞炎症反应中的表达及与炎症基因相关性研究

目的:研究长链非编码RNA(LncRNA)PVT1在LPS诱导THP-1源巨噬细胞炎症反应中的表达及其与炎症基因表达相关性,推测lncRNA-PVT1在脓毒症急性肺损伤炎症反应中的可能作用。方法:通过LPS刺激THP-1源巨噬细胞产生炎症反应造模,利用RT-qPCR检测,比较不同刺激浓度(0、0.5、5.0μg/ml,8 h)下各组细胞中lncRNA-PVT1及TNF-α、IL-1βmRNA表达情况。结果:与对照组相比,IL-1β及TNF-αmRNA在LPS不同刺激浓度下,均表达上调,且具有统计学差异(均P0.05)。随着刺激浓度增加,IL-1β及TNF-αmRNA表达量上升,呈浓度依赖,在LPS 5.0μg/ml作用8 h下,IL-1β及TNF-αmRNA表达量达峰值。与对照组相比,在5.0μg/ml LPS组中ln-cRNA-PVT1表达明显上调,具有统计学差异(P0.0001)。相关性分析发现5μg/ml LPS刺激8 h后,THP-1源巨噬细胞中lncRNA-PVT1相对表达量分别与IL-1β及TNF-αmRNA相对表达水平呈正相关(分别为R~20.6134,P=0.0125;R~20.7825,P=0.0015)。结论:LncRNA-PVT1在LPS致THP-1源巨噬细胞炎症反应中高表达,且与TNF-α及IL-1βmRNA表达呈正相关,提示该lncRNA-PVT1在脓毒症急性肺损伤炎症反应中可能起重要作用。     

八肽胆囊收缩素对脂多糖攻击小鼠抗炎症细胞因子表达的影响

目的观察脂多糖（LPS）攻击小鼠白细胞介素-4（IL-4）、IL-10的动态变化规律，以及八肽胆囊收缩素（CCK-8）对其表达的影响。方法随机将小鼠分组，每组7只。腹腔注射LPS10mg／kg，于攻击后0、2、4、6和12h检测血清、肺组织IL-4和IL-6表达高峰的时间。对照组腹腔注射生理盐水0．2ml；LPS组腹腔注射LPS10mg／kg；LPS＋CCK-8组在注射LPS前30min腹腔注射CCK-8 60μg／kg；CCK-8组腹腔注射CCK-8 60μg／kg。用酶联免疫吸附法（ELISA）及逆转录-聚合酶链反应（PT—PCR）方法检测各组小鼠血清和肺组织中IL-4、IL-10的含量及其mRNA的表达情况。结果LPS攻击后2h血清及肺组织IL-4、IL-6均显著升高，血清IL-4、IL-6于4h和6h达高峰；肺组织IL-4、IL-6则均于6h达高峰。说明LPS攻击可使小鼠血清及肺组织中IL-4、IL-10的蛋白及mRNA表达均增加；预先注入CCK-8可使IL-4和IL-10的蛋白以及mRNA表达均进一步增加（P均〈O．01）；而单独注射CCK-8对血清、肺组织IL-4、IL-10的表达无明显影响。结论CCK-8可能通过进一步增加LPS攻击小鼠IL-4、IL-10的表达参与抗炎反应过程，从而减轻LPS引起的肺组织炎症反应。