荧光定量PCR检测脂肪肝患者血浆循环DNA及其临床意义

目的检测脂肪肝患者血浆循环DNA（plasma circulatingDNA,PC-DNA）是否发生显著改变,探讨PC-DNA作为脂肪肝早期筛查标志物的可能性。方法从本院体检人群中选取脂肪肝患者和年龄与性别都与之匹配的健康对照人群作为研究对象,采集受试者的全血,分离血浆,提取PC-DNA,采用荧光定量PCR对看家基因—人生长激素基因（HGH）的DNA浓度进行定量以评价PC-DNA水平;另外,我们还检测了每份样本中谷丙转氨酶（ALT）、谷氨酰转移酶（GGT）及高密度脂蛋白（HDL）的浓度。最后,利用t检验和Spearman＇s correlation coefficients等分析方法对数据进行统计分析。结果在脂肪肝患者中PC-DNA的水平（Median=4.10）明显高于健康对照人群的PC-DNA水平（Median=3.47）,P值等于0.0329;分析PC-DNA水平与ALT、GGT及HDL之间的相关性,发现PC-DNA与ALT及GGT正相关,而与HDL呈负相关。结论检测脂肪肝患者PC-DNA水平,并联合ALT、GGT及HDL等生化指标,可筛查脂肪肝。     

荧光定量PCR检测血浆游离DNA方法的建立

[目的] 建立TaqMan探针定量PCR 术检测血浆游离DNA的方法.[方法] 构建重组质粒pMD-18-TGAPDH、pMD-18-T-sRY作为标准品,并通过软件设计出TaqMan探针,优化定量PCR体j募≯并对其特异性进行分析.[结果] 建立了1个检测GAPDH和4个检测SRY荧光定量PCR方法,得到上述5个荧光PCR的扩增动力曲线和定量标准曲线,模板起始浓度与阈值循环数(CT值)之间有很好的相关关系(r分别为0.97.0.99.0.98、0.97、0.99).[结论] 成功建立了定量检测血浆游离DNA的方法,其灵敏度高、特异性强,有望成为一种检测孕母血浆游离DNA含.量的快速简便方法.     

嗜肺军团菌微滴式数字PCR检测方法的建立

目的建立嗜肺军团菌微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR)技术进行比较。方法针对嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,验证其特异性后,用于ddPCR和qPCR。优化ddPCR的退火温度、引物、探针浓度后,比较ddPCR和qPCR灵敏度和重复性,并对模拟样品进行检测。结果用5株非嗜肺军团菌测试特异性,结果表明具有良好的特异性。ddPCR与qPCR对DNA模板的检测限一致(42.6 fg),模拟样品检出限为300 cfu/ml,ddPCR的线性相关系数(0.999)略优于qPCR(0.982),ddPCR检测的RSD(0.78%~14.06%)均高于qPCR(0.30%~1.98%)。结论微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于嗜肺军团菌检测,且可以对基因进行绝对定量。     

乙型脑炎病毒微滴式数字PCR检测方法的建立

目的 建立乙型脑炎病毒微滴式数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)检测方法.方法 根据乙型脑炎病毒基因的NS3序列设计特异性引物和TaqMan探针,用于ddPCR和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR).优化ddPCR的退火温度、引物和探针浓度后,比较ddPCR和qPCR灵敏度和重复性,并用多种虫媒病毒进行特异性验证.结果 该方法特异性良好,灵敏度可以达到16.1 copies/μL,重复性良好.结论 本研究建立的ddRT-PCR能够高度敏感地检测乙型脑炎病毒核酸,将该方法用于临床乙型脑炎病毒感染的检测,可提高检测的准确性.     

微滴式数字PCR技术及其在产前诊断中的应用

微滴式数字PCR(ddPCR)技术是一种新型核酸检测方法,通过将含有靶分子的反应体系均分到大量独立的反应单元进行扩增,并根据阳性比例和泊松分布原理对靶分子进行绝对定量分析。与传统PCR技术相比,ddPCR具有高灵敏度、高精确度及绝对定量等优点,近年来得到迅速发展,广泛应用于肿瘤、微生物等检测等领域。本文主要在介绍ddPCR基本原理的基础上重点概述其在染色体及单基因遗传病等产前诊断领域的应用进展。     

冬虫夏草微滴式数字聚合酶链式反应定量检测方法的建立及应用

目的 建立一种定量检测冬虫夏草菌的微滴式数字聚合酶链式反应（ddPCR检测方法,探讨其定量检测冬虫夏草的可行性。方法 使用冬虫夏草菌特异性引物和探针建立dd PCR检测方法,对冬虫夏草及其常见伪品进行鉴别,对其特异性和自制混伪品进行检测和评估,并采用该方法对市场流通的冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分进行检测。结果 ddPCR检测方法对冬虫夏草菌具有良好的检测特异性,且在掺伪0%～70%范围内定量检测的准确性高;此外,对冬虫夏草及其制剂市售样品的检测结果显示,该方法可用于冬虫夏草的定量检测。结论 ddPCR检测方法可成功检测市售冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分,具有市场应用价值,可为含冬虫夏草成分的保健食品和药品提供定量和鉴伪检测依据。     

乙型脑炎病毒微滴式数字 PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,用于乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的核酸检测。方法 设计特异性扩增JEV的引物探针并优化条件建立ddPCR检测方法,检测其他病毒核酸,观察有无交叉反应判断其特异性。用实时荧光定量PCR(qPCR)与ddPCR法分别对梯度稀释后JEV体外转录核酸进行检测以评价方法的敏感性;用不同浓度的病毒核酸进行独立重复实验以评价方法的重复性;用乙型脑炎IgM抗体阳性标本评价临床标本,健康人血清用于阴性验证。结果 本法检测与其他病毒核酸无交叉反应;RT-qPCR和RT-ddPCR方法对JEV的最低检出限分别为10⁰和10^-1,对应分别为6.73 copies/μL和0.75 copies/μL;各浓度检测拷贝数变异系数均在2.0%以下,检出率为100.0%;12份乙型脑炎IgM抗体阳性标本中检出7份阳性(58.3%),健康人血清的阴性率为100.0%。结论 本研究建立的RT-ddPCR检测JEV方法有较好的特异性、敏感性、重复性和临床标本适应性,可作为乙型脑炎病...     

一种通用型肠道病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种肠道病毒通用型微滴式数字PCR（ddPCR）的定量检测方法,以实现肠道病毒的量化检测。方法 利用肠道病毒标准品对ddPCR反应中的探针浓度、退火温度进行优化,并确定ddPCR的检测范围。利用已优化好的反应条件对28份临床样本进行病毒载量检测。结果 本研究确定ddPCR的最佳探针浓度为0.4 μmol/L,退火温度为51.0 ℃,核酸检测范围为3.02~3.59×10⁶ copies/μL,检出限为3.02 copies/μL。ddPCR方法线性相关系数为0.993 8,呈良好的线性关系。结论 本研究建立基于ddPCR肠道通用型的定量方法,可有效地对临床样本中不同血清型的肠道病毒临床样本进行拷贝数定量分析,为临床研究病毒载量的测定提供一种技术。     

循环游离DNA的定量检测及面临的问题

循环游离DNA(circulating cell free DNA,cfDNA)与人类疾病之间存在着密切联系。近年来,cfDNA做为一种无创检测生物标志物,展现出临床应用前景。人们针对其含量较低的特点,进行了大量研究,开发出了各种较为可靠的定量检测方法。但目前cfDNA的定量检测仍然面临问题及争议,缺乏规范和标准化的流程。本文对cfDNA的来源组成、定量检测及存在的问题进行了归纳整理及分析,希望能对提高cfDNA的定量检测的可靠性提供有益的参考。     

4种疟原虫核酸通用型微滴式数字PCR检测方法的建立

目的建立疟原虫微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法。方法根据疟原虫18S rRNA基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,用于ddPCR方法建立。优化dd PCR的退火温度、引物和探针浓度后,比较ddPCR和实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)灵敏度和重复性,并对4种疟原虫阳性样本进行检测。结果建立的ddPCR方法特异性良好,灵敏度可达到2.3拷贝/μl,重复性良好。13份经qPCR检测的阳性样本,ddPCR检测也均为阳性,正确率达100%;5份经一个疗程青蒿素为基础的联合疗法治疗后的疟疾病人样本,qPCR检测均为阴性,dd PCR检测发现其中1份阳性(3.8拷贝/μl)。结论建立的ddPCR能够高度敏感、特异地检测人类4种疟原虫核酸。     

微滴式数字PCR和实时荧光定量PCR对新型冠状病毒肺炎患者不同时间血便尿中核酸检测结果初步探讨

目的 分析微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的核酸检测结果,比较两种方法检测各类样本的差异性,为改进新型冠状病毒核酸检测方案提供数据支持。 方法 利用ddPCR和qPCR技术对已经确诊的3例新型冠状病毒肺炎患者发病不同时间的全血、尿液、粪便共22份标本进行新型冠状病毒核酸检测。 结果 两种方法对人保守区域基因扩增结果一致:全血标本信号最强,尿液次之,粪便最少;ddPCR在1份全血,1份尿液,5份粪便中检出ORF-1ab和N基因的阳性微滴,qPCR仅在3份粪便中检出上述基因,漏检的3个标本基因拷贝数平均浓度为128 copies/ml;ddPCR在发病<5、5~15、>15 d的各类标本中都有检出,qPCR检出以中晚期为主;重症病例用ddPCR均可测到阳性微滴,qPCR检测的各类标本均为阴性;轻症病例的各类标本中qPCR只有粪便核酸检测阳性,ddPCR检出率高于qPCR。 结论 ddPCR可以有效克服qPCR 灵敏度不足的难题,是对qPCR 的有益补充,尤其是针对病毒载量比较低的血液、尿液和可疑的粪便或肛拭子标本,适用于早期感染的判断及患者治愈后出院诊断。     

血浆循环DNA定量检测在乳腺癌患者诊断与预后中的意义

目的:建立一种荧光定量PCR方法用于血浆循环DNA定量,并讨论血浆循环DNA检测在乳腺癌诊断及预后中的意义。方法:以61例乳腺癌患者、33例乳腺良性病变患者和25例健康对照者血浆为材料,用Qiagen纯化柱提取血浆DNA,采用荧光定量PCR技术(SYBR Green I染料法)对血浆DNA水平进行检测,DNA水平用临界域值时的循环数(Ct值)表示,并应用ROC曲线分析血浆循环DNA定量在乳腺癌诊断中的价值。结果:乳腺癌血浆循环DNA水平(27.71±1.41)显著高于健康对照(30.37±1.32)和良性对照(29.7±1.12)(P<0.001),ROC曲线下面积分别为0.921和0.837。循环DNA水平与分期、淋巴结转移、肿瘤大小、年龄及雌激素受体状况均无相关性(P>0.05)。术后乳腺癌患者血浆循环DNA水平显著下降,其中复发患者血浆循环DNA水平显著高于未复发者。结论:血浆循环DNA水平对于乳腺癌诊断和预后均具有一定临床意义。     

荧光定量PCR检测HBV DNA

目的：探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物(HBV M)表现模式的关系。方法：对1207例慢性乙型肝炎患者进行血清HBV DNA荧光定量PCR分析，HBV M检测采用ELISA法。结果：血清HBV DNA水平与HBV M表现模式有关，HBsAg与HBeAg的存在影响HBV DNA水平变化。结论：HBbAg和HBV DNA有明显的相关，抗—HBe、抗HBc阳性者病毒末完全停止复制，只是复制水平降低。     

沙眼衣原体DNA的荧光定量PCR检测

沙眼衣原体(CT)的实验室检测技术主要分为细胞培养观察包涵体的经典细胞生物学方法；免疫学方法和以核酸扩增技术为代表的分子生物学检测方法。长期以来一直以前者作为沙眼衣原体感染诊断的金标准，但该方法操作复杂，技术要求高，所需时间长，所受影响因素多，因此，一直未得到普遍应用。本实验采用实时荧光定量PCR（fluorescence quantitatire PCR，FQ-PCR)方法，检测沙眼衣原体，克服了上述缺点，取得了较好的效果。现报告如下。     

结直肠癌患者血浆FIB和ANG-2检测的临床意义

目的检测结直肠癌患者血浆中纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)和血管生成素-2(angiopoietin-2,ANG-2)含量,探讨其对于结直肠癌的诊疗意义。方法使用ACTTOP500血凝分析仪检测108例结直肠癌患者和60例健康体检者血浆中的FIB,采用酶联免疫分析(ELISA)检测两组血浆中的ANG-2。结果结直肠癌患者血浆中的FIB和ANG-2含量分别为(5.08±1.14)g/L、(3.15±0.58)g/L,均显著高于健康对照组的(2.78±0.32)g/L、(1.03±0.21)g/L,差异均有统计学意义(P<0.01),FIB和ANG-2含量均随着临床分期的升高而递增(均P<0.01),且相关性分析两者呈正相关(r=0.97,P=0.0136)。结论 FIB和ANG-2共同参与了结直肠癌的发生发展,联合检测血浆FIB和ANG-2含量,对结直肠癌的早期诊断、分期及预后判断具有重要临床价值。     

应用表观遗传学标记检测孕妇血浆中的胎儿游离DNA

[目的]探讨应用非性别依赖的表观遗传学标记检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的可行性. [方法]随机选择60例孕妇作妊娠组,15例未生育非妊娠女性作对照组1,15例已生育非妊娠女性作对照组2.以甲基化特异性PCR扩增各待检对象血浆DNA中不同甲基化状态的maspin基因,并对结果进行统计学分析.[结果]m-maspin(maspin基因的甲基化序列)在妊娠组和两对照组中均被检测出,其检测阳性率在各组间无差异.u-maspin(maspin基因的非甲基化序列)在妊娠组中有53例被检测出,检出率88.3%,而在两对照组中均未被检测出,其检测阳性率在妊娠组和两对照组间的差异均具有统计学意义. [结论]u-maspin基因可作为非性别依赖的胎儿DNA特异性标志物应用于非侵入性产前诊断.     

结直肠癌微转移检测及其临床意义

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤,其发病呈上升趋势.20多年来,结直肠癌根治手术的方法不断改进,但患者的顶后并未明显改善,复发和转移率高达50%左右[1].在常规病理检查"无淋巴结转移"的结直肠癌DukesB期患者中,有近30%的人5年内死于肿瘤复发或远处转移,提示可能有结直肠癌微转移的存在[2].     

荧光定量PCR检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞乙肝病毒 DNA

目的探讨定量检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)的临床意义.方法采用荧光定量PCR检测PBMC及血清中HBV-DNA含量.结果 49例慢性乙肝患者PBMC及血清中HBV-DNA阳性率分别为44.9%(22/49),51.0%(25/49),两者阳性率无统计学意义的差异(P＞0.05),具有一致性;血清HBV-DNA高水平组PBMC的HBV-DNA含量与低水平组比较,两者有统计学意义差异(P＜0.01);血清HBV- DNA高水平组PBMC的HBV-DNA阳性率(100%)与血清低水平组PBMC的HBV-DNA阳性率(42.9%)比较,两者有统计学意义的差异(P＜0.05);在24例血清HBV-DNA阴性患者中,发现5例PBMC HBV-DNA阳性.结论 PBMC的HBV-DNA检测可反映病毒在体内的复制程度,是对慢乙肝患者血清HBV-DNA检测有意义的补充,有助于临床上对慢乙肝患者血清病毒复制状态的了解及指导治疗用药.     

孕妇血浆中胎儿DNA的定量检测

目的: 定量检测孕妇血浆中游离胎儿DNA含量。方法: 以SRY基因序列作为胎儿DNA的基因标志, 应用实时定量PCR技术测定不同孕期的孕妇血浆中胎儿DNA的含量。结果: ①最早检测出孕妇血浆中胎儿DNA的时间为 7-1周; ②早、中、晚孕期孕妇血浆中胎儿DNA浓度平均值分别为 77. 86、95 .43、325 .61copy/ml, 在孕妇血浆总DNA含量中的相对浓度分别为 4 .88%、6 .10%、4. 77%。结论: 在孕妇血浆中可监测到较高浓度胎儿游离DNA, 并且随着孕期的进展, 胎儿DNA含量逐渐增加, 这一结果有助于进一步无创伤性产前基因诊断的研究。