人胃癌耐药细胞的建立方法及意义

目的 建立人胃癌耐药细胞,为研究人胃癌耐药细胞的耐药机制以及为耐药肿瘤细胞的治疗提供耐药肿瘤细胞模型.方法 体外培养人胃癌细胞SGC-7901,用50μmol/L顺铂多次反复冲击,对冲击4次和6次的SGC-7901分别检测对顺铂的抑制率和多药耐药基因(MDR)及多药耐药特异基因片段的表达,并计算药物对细胞的半数抑制浓度...     

人三阴性乳腺癌细胞耐药株的建立及特性研究

目的建立人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的多西紫杉醇(Doc)耐药模型(MDA-MB-231/Doc)和表阿霉素(Epi)耐药模型(MDA-MB-231/Epi),探讨其生物学特性。方法采用Doc和EPi低浓度逐步加量诱导法历时12个月分别建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药细胞株。通过细胞形态学观察、MTT法和流式细胞术分析、比较其生物学特性,实时荧光定量PCR检测多药耐药基因(MDR1)mRNA表达,Western Blot法检测P糖蛋白(P-gp)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)的表达状况。结果所构建的MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药株可分别在12nmol/L Doc和800nmol/L Epi中稳定生长,在相同的药物浓度下,耐药细胞株的生长增殖率明显高于亲代细胞,其耐药指数分别为亲代敏感细胞的8.32倍和64.93倍,且相互呈交叉耐药状态。与亲代细胞相比,两株耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、处于S期的细胞减少,随撤药时间的延长,细胞的增殖速度加快。两株耐药株的MDR1基因表达水平增高,分别为亲代细胞的4.05倍和5.96倍,P-gp表达为阳性。与MCF-7细胞株相比,MDA-MB-231细胞株ER、PR、HER2表达阴性,是典型的三阴性乳腺癌细胞株。结论成功建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi的耐药细胞株,其生长及耐药性稳定。     

急性淋巴细胞白血病耐药细胞株的建立及耐药机制的研究

目的:构建耐阿霉素的急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞株,并探讨其耐药机制。方法:采用阿霉素(ADR)小剂量浓度递增间歇诱导SUP-B15(Ph~+)和RS4;11(Ph~-)细胞,建立SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR耐药细胞株;应用CCK-8法检测细胞的活力与增殖;Western blot检测P-糖蛋白(P-gp)的表达;RT-PCR检测MDR1基因的表达。结果:成功构建ALL耐药细胞株SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR,耐药指数分别为14.088±0.763和10.473±1.024。冻存的SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR细胞复苏后,细胞存活率分别为88.4±1.2%和89.3±1.6%,耐药指数分别为13.976±0.967和10.342±0.846,与冻存前相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。撤药培养1个月,2株细胞的耐药指数明显降低,分别为12.893±1.255和9.327±0.321(P﹤0.05)。SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR细胞对阿糖胞苷的耐药指数分别为3.459±0.451和3.992±0.795,对依托泊苷的耐药指数分别为3.564±0.365和3.654±0.251。MDR1和P-gp在耐药细胞中的表达较亲本细胞增高。结论:小剂量浓度递增间歇诱导法可成功诱导出ALL耐阿霉素细胞株,其耐药机制是上调MDR1与P-gp的表达。     

紫杉醇耐药人肺腺癌细胞系的建立及生物学活性

目的：体外建立紫杉醇耐药人肺腺癌A549/TAX细胞系,并对其生物学特性进行研究.方法：采用逐步增加紫杉醇浓度结合低剂量持续诱导法,建立紫杉醇耐药人肺腺癌A549/TAX细胞系.MT T法描绘A549和A549/TAX细胞的生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期并比较经紫杉醇诱导24 h后A549和A549/TAX细胞平均凋亡率的差异;检测紫杉醇对A549/TAX细胞的半数抑制浓度、耐药系数（RI）及A549/TAX细胞对其他 5种化疗药物（顺铂、长春新碱、表阿霉素、足叶乙甙及吉西他滨）的交叉耐药谱;RT-PCR半定量分析A549/TAX细胞凋亡基因（bcl-2）及耐药基因（MDR1、LRP、GST-π）的mRNA表达.结果：A549/TAX细胞生长较亲本细胞快,S期细胞增多[（51.61±0.48）%],G1 期减少[（37.26±0.23）%],经紫杉醇（150 μmol/L）诱导前后平均凋亡率差异与A549细胞相比差异有显著性.A549/TAX细胞对紫杉醇、长春新碱、表阿霉素及足叶乙甙的RI分别为 21.3、12.91、5.88和4.79,而对顺铂（RI=1.06）和吉西他滨（RI=1.03）则无交叉耐药;A549/TAX细胞bcl-2、 MDR1、LRP mRNA的表达均较亲本细胞显著增高（P＜0.001）,GST-πmRNA未见表达.结论：成功建立了紫杉醇耐药A549/TAX细胞系,该细胞抗药性能明显、稳定,推测其多药耐药性与bcl-2、MDR1和LRP高表达有关.     

人视网膜母细胞瘤耐药细胞系SO-Rb50/CBP的建立及耐药相关基因表达检测

目的用卡铂诱导人视网膜母细胞瘤SO-Rb50成为耐药细胞SO-Rb50/CBP,检测其生物学特性,并探讨其耐药机制。方法以人视网膜母细胞瘤SO-Rb50为亲本细胞,采用卡铂高浓度间歇诱导法诱导多药耐药细胞SO-Rb50/CBP。MTT法测定其药物敏感性及生长曲线、倍增时间;分别用免疫细胞化学、流式细胞术对MRP、GST-π蛋白表达进行检测,用RT-PCR检测耐药相关基因MRP、GST-π的表达。结果耐药细胞SO-Rb50/CBP的耐药指数为15.7。亲本细胞与耐药细胞群体倍增时间分别为44.32h和50.9h。SO-Rb50/CBP对CBP、DDP、VCR、MMC、VP-16和5-FU的耐药指数分别为15.7、6.89、5.68、4.58、2.28和1.88。免疫细胞化学SO-Rb50/CBP的GST-π和MRP表达的阳性率分别为96.19%和90.21%,亲本细胞两种蛋白的阳性率分别为20.12%和30.48%。SO-Rb50/CBP的MRP及GST-π的mRNA表达水平比SO-Rb50明显增高。结论诱导出耐卡铂的视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50/CBP呈高度耐药,且存在多药耐药现象。其耐药现象的产生,可能与GST-π和MRP耐药蛋白表达的增加有关。     

人胰腺癌5-Fu耐药细胞株的诱导建立及细胞学特性研究

目的建立稳定传代的抵抗5-Fu的人胰腺癌细胞株MiaPaca2—5-Fu，并对细胞生物学特性进行研究。方法逐步增加培养基中5-Fu的浓度，建立对5-Fu耐药的人胰腺癌细胞株MiaPaca2—5-Fu；采用WST法计算出MiaPaca2和MiaPaca2-5-Fu的半数抑制浓度（IC50）和耐药指数（RI）；检测MiaPaca2和MiaPaca2—5-Fu的生长曲线，计算2个细胞系的倍增时间并进行比较，用流式细胞仪技术检测其细胞周期。结果5-Fu对MiaPaca2和MiaPaca2—5-Fu的IC50分别为（4．29±0．15）μg／mL、（41．55±2．79）μg／mL，RI为9．68（P=0．0019）。根据生长曲线计算出MiaPaca2和MiaPaca2-5-Fu的倍增时间分别为（39．52±0．32）h、（43．27±0．33）h（P=0．0069），2细胞株的G0／G1期、S期、G2／M期均存在显著性差异（P〈0．01）。结论成功建立了对5-Fu耐药的人胰腺癌细胞系MiaPaca2—5-Fu，耐药性能明显、稳定，适合于胰腺癌中5-Fu耐药机制的研究。     

人胰腺癌5-Fu耐药细胞株的诱导建立及细胞学特性研究

目的建立稳定传代的抵抗5-Fu的人胰腺癌细胞株MiaPaca2-5-Fu,并对细胞生物学特性进行研究。方法逐步增加培养基中5-Fu的浓度,建立对5-Fu耐药的人胰腺癌细胞株MiaPaca2-5-Fu;采用WST法计算出MiaPaca2和MiaPaca 2-5- Fu的半数抑制浓度(IC50)和耐药指敷(RI);检测MiaPaca2和MiaPaca2-5-Fu的生长曲线,计算2个细胞系的倍增时间并进行比较,用流式细胞仪技术检测其细胞周期。结果5-Fu对MiaPaca2和MiaPaca2-5-Fu的IC50分别为(4.29±0.15)μg/mL、(41.55±2.79)μg/mL,RI为9.68(P=0.0019)。根据生长曲线计算出MiaPaca2和MiaPaca2-5-Fu的倍增时间分别为(39.52±0.32)h、(43.27±0.33)h(P=0.0069),2细胞株的G0/G1期、S期、G2/M期均存在显著性差异(P<0.01)。结论成功建立了对5-Fu耐药的人胰腺癌细胞系MiaPaca2-5-Fu,耐药性能明显、稳定,适合于胰腺癌中5-Fu耐药机制的研究。     

裙带菜多糖对人食管癌Eca-109细胞抑制作用的实验研究

目的观察裙带菜多糖（PUP）体外抑制食管癌细胞增殖的作用及其作用机制。方法以食管癌Eca—109为研究对象,MTT法检测PUP对其增殖的抑制作用;用流式细胞术分析Eca-109细胞的凋亡率和检测Survivin蛋白的表达水平。结果不同浓度的裙带菜多糖均可明显抑制食管癌细胞的增殖（P均〈0．05）,浓度越高细胞凋亡率越高,100μg／ml的裙带菜多糖可诱导Eca-109细胞凋亡率达72．25％,可使Eca-109细胞Survivin蛋白表达水平均明显降低（P〈0．01）。结论裙带菜多糖可抑制Eca-109细胞生长,诱导细胞凋亡,其作用可能与下调细胞Survivin蛋白的表达有关。     

喜泊芬对人食管癌Eca-109细胞的光动力效应

目的：探讨不同孵育浓度和不同光照剂量密度喜泊芬介导的光动力治疗（photodynamic therapy,PDT）对人食管癌细胞Eca-109体外效应的影响。方法：以不同浓度喜泊芬孵育食管癌Eca-109细胞,并分别在不同光照剂量密度（0、12、24、30J/cm2）下行PDT,24h后通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞生存率。结果：不同孵育浓度喜泊芬在4种不同光照剂量密度下食管癌Eca-109细胞生存率间均有显著差异（P〈0.01）。在同一光照剂量密度下,不同喜泊芬浓度的食管癌Eca-109细胞的生存率有显著差异（P〈0.01）,而同一喜泊芬孵育浓度下,不同光照剂量密度的食管癌Eca-109细胞的生存率有显著差异（P〈0.01）。结论：喜泊芬的不同孵育浓度和不同光照剂量密度对人食管癌Eca-109细胞体外PDT效应有显著影响。     

耐三尖杉酯碱L1210白血病细胞的建立及异搏定对耐药细胞的作用

耐三尖杉酯碱Ｌ＿（１２１０）白血病细胞的建立及异搏定对耐药细胞的作用潘秀英，崔淑香，黄一虹，徐开林，万美蓉，韩泽广，张大锤建立耐药细胞是研究肿瘤耐药性的基础。三尖杉酯碱（Ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ，ＨＨ）是目前国内治疗急性白血病的常用药物，但...     

马法兰和阿霉素耐药人骨髓瘤细胞系的建立

目的:建立对马法兰和阿霉素耐药的人骨髓瘤细胞系。方法:在人骨髓瘤细胞系RPMI8226培养体系中分别加入1.0×10-8M的阿霉素(DOX)和1.0×10-6M的马法兰(LP),每周3次换液,DOX于10月后增加至1.0×10-7M,LP于47周后增加至5×10-6M。MTT法测定敏感细胞系和耐药系8226/DOX的IC50值,在耐LP细胞系8226/LP中加入丁硫氨酸亚砜胺(BSO)阻断谷胱甘肽的合成,MTT法测定细胞系8226/S、8226/LP细胞及8226/LP+BSO细胞的IC50值。HE染色普通光学显微镜下观察各组细胞形态,流式细胞仪检测各组细胞表面P-糖蛋白、CD38、CD45、CD19。台盼蓝拒染法测出8226/S、8226/DOX、8226/LP细胞的生长曲线。结果:所培养耐药细胞系8226/DOX、R8226/LP具有亲母细胞系的生物学特点,形态相似,均为CD38+CD45-CD19-表达细胞,倍增时间与亲母细胞系相近。比较IC50,8226/DOX对DOX的耐药约15倍于亲母细胞系。8226/LP对LP的耐药约7倍于亲母细胞系,而经过BSO阻断,其敏感性明显增加。结论:建立的骨髓瘤细胞系RPMI8226/LP、RPMI8226/DOX可作为骨髓瘤耐药研究的有效模型。     

高侵袭力人膀胱癌细胞亚系的建立及鉴定

目的建立人膀胱癌细胞BIU-87的高侵袭力亚系,并对侵袭过程进行观察。方法通过构建侵袭小室,以穿透人工基底膜、聚碳酸脂膜能力为依据筛选具有体外高侵袭能力的膀胱癌细胞亚系。运用扫描电镜观察细胞侵袭的过程,通过生长曲线、细胞周期、体外侵袭力对母代与子代细胞体外增殖及侵袭能力进行对比。结果通过扫描电镜观察到了细胞的侵袭运动。筛选后的各子代细胞,经16代以上传代后,细胞形态与母代无明显变化,细胞增殖速度较母代有明显加快(P0.05),体外侵袭能力较母系明显提高(P0.01)。结论运用改良的侵袭实验筛选膀胱癌细胞系的高侵袭力亚系的方法是可靠的,建立的高侵袭力亚系细胞为今后对膀胱癌侵袭及转移的研究提供了较为可靠的细胞模型。     

肿瘤耐药基因和细胞凋亡基因在大肠癌中的表达及意义

目的 探讨肿瘤耐药基因、细胞凋亡基因在大肠癌中的表达及相关性在临床应用中的意义.方法 应用免疫组化方法(SP)检测P-糖蛋白(PgP)、谷胱苷肽转移酶-π(GSTπ)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(ToPoⅡ)、胸苷酸合成酶/5-FU(TS)、细胞凋亡基因(bcl-2)在144例大肠癌根治标本中的表达.结果 144例大肠癌中PgP、GSTπ、ToPoⅡ、TS、bcl-2的阳性率分别为66.7%(96/144)、56.9%(110/144)、76.4%(82/144)、44.4%(64/144)、38.9%(56/144).PgP、ToPoⅡ、TS的表达在不同性别、年龄、组织分型、侵犯深度、淋巴结转移、UIDD分期差异均无统计学意义(P均>0.05),GSTπ的表达在临床分期差异有统计学意义[Ⅰ、Ⅱ期的阳性率为72.9%(86/118),Ⅲ、Ⅳ期的阳性率为92.3%(24/26),χ2=4.458,P=0.035],bcl-2在大肠癌不同分化程度[中～高分化程度阳性率52.4%(44/84),低分化程度阳性率20.0%(12/60),χ2=15.442,P=0.001]、不同侵犯深度[浅肌层～深肌层阳性率55.6%(30/54),浆膜以外阳性率28.9%(26/90),χ2=10.099,P=0.001]的表达差异有统计学意义,bcl-2与PgP、GSTπ、ToPoⅡ呈正相关(r=0.374,0.340,0.221,P均<0.05).结论 PgP、GSTπ、ToPoⅡ、TS、bcl-2联合作用是大肠癌多药耐药性的主要作用机制之一,PgP、GSTπ、ToPoⅡ、TS、bcl-2可作为耐药的标志物,进行肿瘤耐药及细胞凋亡监测,对大肠癌患者化疗药物选择及判断预后,具有重要应用价值.     

三氧化二砷对人胃癌细胞BGC-823凋亡及耐药基因表达影响的研究

目的:研究三氧化二砷(As2O3)对人胃癌细胞系BGC-823的凋亡诱导作用及对LRP、C-myc基因表达的影响.方法:进行体外细胞培养,MTT法,流式细胞术检测As2O3对人胃癌细胞系BGC-823的凋亡诱导作用;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测LRP、C-myc mRNA的表达.结果:As2O3对人胃癌BGC-823细胞具有抑制作用,其抑制率呈时间-剂量依赖关系.不同浓度的As2O3均可诱导凋亡.1.0 μmol/L、2.0 μmol/L的As2O3可下调LRP、C-myc的表达.结论:As2O3具有抗胃癌作用,主要通过诱导细胞凋亡实现,其机制可能与下调LRP、C-myc表达有密切关系.     

肺移植缺血再灌注损伤细胞模型的建立及意义

【目的】在体外模拟临床肺移植,建立起肺移植缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury ,IRI）的细胞模型。【方法】将人肺泡上皮细胞系A549用Perfadex液保存于100％氧气,4℃环境中来模拟缺血过程,缺血时间分为6h、12h、18h、24h,然后加入37℃含10％胎牛血清的DM EM培养基来模拟再灌注过程,再灌注时间为2 h。分别检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）含量,并应用CCK‐8测细胞存活率。【结果】与对照组相比,各时间点试验组M DA、LD H含量逐渐增加,而SOD含量和细胞存活率则逐渐降低。各时间点MDA、LDH、SOD、细胞存活率水平也存在差异。【结论】成功建立了肺移植IRI细胞模型,此模型能够在分子与细胞水平研究肺移植IRI机制。     

瘤细胞纯度梯度体系及APC-LOH模型的建立和意义

建立了一个瘤细胞标本纯度参照体系,以降低标本不纯对抑癌基因杂合性缺失(LOH)研究的影响。根据代表不同纯度的标本中两个等位基因的配比推算纯合子/杂合子DNA的构成比及掺入量,进而构建了瘤细胞模拟纯度梯度体系,并以APC基因的LOH分析为例,在优化实验条件基础上建立了不同纯度瘤细胞的APC-LOH模型。结果表明,该APC-LOH检测系统至少能分析纯度低至60％的标本,优于其它文献提出的纯度要求(>70%)。结论是构建纯度梯度体系及抑癌基因LOH模型有利于提高及确定LOH检测系统的分辨能力。     

Notch信号分子在人淋巴瘤细胞中的表达及意义

本研究探讨Notch信号分子在人淋巴瘤细胞中的表达及其意义。选择人B淋巴瘤细胞系(Raji、Maver、Z138)和T淋巴瘤细胞系Jurkat细胞,利用RT-PCR技术检测Notch信号分子在这些细胞中的表达情况;利用流式细胞术检测γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号后对淋巴瘤细胞凋亡以及细胞周期的影响;利用CCK-8法检测DAPT对淋巴瘤细胞增殖的影响。结果表明:Notch分子在不同淋巴瘤细胞中的表达有所不同,Notch1和Notch2在4种细胞中均有表达,Notch3主要表达于Jurkat细胞,而Notch4仅在Raji细胞中弱表达;另外,Notch下游靶基因Hes1仅表达于Raji和Jurkat细胞。DAPT对Jurkat和Raji细胞的增殖抑制以及凋亡诱导作用比较明显,并将细胞周期阻滞在G1期,但是对Maver和Z138细胞的作用较弱。DAPT可以通过抑制Notch下游靶基因Hes1的表达而发挥作用。结论:Notch信号的异常表达与活化对淋巴瘤细胞的增殖起着重要作用,Notch信号有望成为淋巴瘤治疗的一个新靶点。     

As2O3对人胃癌多药耐药细胞模型的逆转耐药作用

目的体外建立人胃癌细胞多药耐药模型,研究多药耐药机制及三氧化二砷（As2O3）对其逆转耐药作用。方法采用阿霉素（ADM）浓度梯度递增法诱导建立人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/ADM,MTT法检测SGC7901/ADM细胞对ADM、长春新碱（VCR）、紫杉醇（TAX）的敏感性及As2O3对其逆转耐药倍数,免疫细胞化学法（PV法）检测细胞P-糖蛋白（P-gp）、Caspase3表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 SGC7901/ADM细胞对ADM、VCR和TAX均耐药,耐药倍数分别是7.49、7.56及5.33。在As2O3作用48h后,3种抗癌药物对SGC7901/ADM细胞生长抑制50%时的浓度（IC50）明显降低,差异有显著性（F=169.766-1 199.812,q=6.86-70.40,P〈0.01）;耐药细胞经As2O3及环孢素A（CsA）作用后,P-gp表达明显下调,差异有显著性（F=42.870,q=7.70-21.50,P〈0.01）;As2O3高浓度组细胞中Caspase3表达上调,差异有显著性（F=7.220,q=6.63,P〈0.05）。As2O3作用组SGC7901/ADM细胞凋亡率随As2O3浓度增加而增加（F=1 986.63,q=21.23-95.08,P〈0.05）。结论 SGC7901/ADM细胞具有多药耐药性,As2O3可逆转其耐药,并呈剂量依赖性。     

人子宫内膜细胞体外培养模型的建立

【目的】构建人子宫内膜细胞体外培养模型。【方法】收集子宫内膜组织,采用酶消化、筛网滤过、梯度离心的方法获得腺上皮与基质细胞混合细胞进行体外原代培养,采用光学显微镜下观察体外培养的细胞形态,采用波形蛋白和角蛋白单克隆抗体进行免疫组化法鉴定子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞。【结果】倒置显微镜下发现子宫内膜细胞中腺上皮细胞和基质细胞呈混合生长,其中基质细胞占大部分,为72．0％;腺上皮细胞占小部分,为24．5％,基质细胞和腺上皮细胞免疫组化染色后呈阳性,细胞纯度分别为24．5％和70．5％,两种细胞加起来的纯度为95％。【结论】该方法操作简便,效率高,可建立一个稳定实用的人子宫内膜细胞体外培养体系。     

转移性人小细胞肺癌裸鼠模型的建立

目的建立转移性人小细胞肺癌(SCLC)的裸鼠模型,探讨其用于人SCLC的治疗研究的可行性。方法 RPMI 1640培养基培养的人SCLC细胞株NCI-H446用无血清培养液重悬成1×107个/mL,取0.1 mL细胞悬液接种于BALB/c-nu裸鼠胫骨结节骨髓腔内,构建裸鼠模型并观察腿部肿瘤生长情况及肺等器官的转移情况。免疫组化染色检测小细胞肺癌标志物CD56及神经上皮干细胞标志物netsin的表达情况。结果经胫骨结节骨髓腔注射的方法注射细胞后裸鼠腿部均形成原位瘤,肺部转移6/6只,肝、脾等脏器未见转移灶。肿瘤组织细胞CD56阳性率>75%,nestin阳性率为4%～12%。结论经胫骨结节骨髓腔注射的方法可以形成弥散性肺部肿瘤,其他各器官则未见肿瘤块,可以为人SCLC实验性治疗的研究提供一种高效的实验模型。