嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的 建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法 嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。结果 该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。结论 TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测方法的建立

目的：建立嗜肺军团菌mip基因荧光定量PCR检测方法。方法：利用Primer Express软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果：该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达293copies／μl;重复性较好,Ct值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论：该方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。     

空气中嗜肺军团菌的巢式PCR和荧光定量PCR测定方法比较

目的评价巢式PCR和荧光定量PCR方法在嗜肺军团菌气溶胶检测中的应用。方法于2012年8—10月在北京、南京、苏州和深圳四城市选取38家公共场所,使用带有虚拟浓缩器的Bio-sampler生物冲击式采样器采集气溶胶样品,分别应用巢式PCR和荧光定量PCR法检测样品中的嗜肺军团菌。结果共采集气溶胶样品165份。巢式PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为8.5%(14/165),荧光定量PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为26.1%(43/165),后者高于前者,差异有统计学意义(P0.05)。结论采用荧光定量PCR法测定空气中嗜肺军团菌的灵敏度优于巢式PCR法。     

军团菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立一种特异、快速、敏感,同时能区分嗜肺和非嗜肺军团菌的荧光定量PCR方法,用于检测临床和环境样品。方法利用军团菌属特异性23S rRNA基因和嗜肺军团菌种mip基因的保守序列,设计引物和TaqMan探针。提取嗜肺军团菌标准菌株(LP1)DNA,分别构建2个含有目的基因的标准质粒作为阳性模板。优化荧光PCR反应条件和反应体系,对方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。并对环境水样及80份临床痰样进行检测。结果该方法检测灵敏度达10标准质粒拷贝数/反应,具有高度特异性、稳定性。整个过程约需2 h。对35份环境水样进行检测,检出3株嗜肺军团菌和3株非嗜肺军团菌,所有水样经传统分离培养法和普通PCR法检测均显示为阴性。对临床80份随机痰液标本进行检测,2份嗜肺军团菌阳性。结论 TaqMan探针荧光定量PCR双管检测是一种可同时区分嗜肺与非嗜肺军团菌的特异、敏感、稳定的方法,可用于基层医院对环境标本及临床痰样的检测。     

土壤中的军团菌和嗜肺军团菌PCR检测研究

目的调查土壤中军团菌的污染状况并探讨土壤中军团菌的污染来源。方法于2009年7—9月,在江苏省南京市冷却塔水军团菌培养法阳性的公共场所集中空调冷却塔0～2m处及距离冷却塔2km的居民区分别采集20件和10件土壤样品。普通聚合酶链反应(PCR)方法扩增军团菌属5SrRNA基因,巢式PCR方法扩增嗜肺军团菌种Mip基因,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果冷却塔旁土壤和居民区土壤中军团菌阳性率分别是80%(16/20)和70%(7/10);嗜肺军团菌阳性率分别是55%(11/20)和0。冷却塔旁土壤中军团菌的阳性率与居民区土壤比较,差异无统计学意义(χ2=0.373,P=0.542)。结论环境土壤中存在军团菌,受集中空调冷却塔水污染的土壤中可检出嗜肺军团菌。     

快速检测空调冷却水中Lp1型嗜肺军团菌实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立嗜肺军团菌Lp1型实时荧光定量PCR检测方法,以实现对中央空调冷却水中嗜肺军团菌Lp1型的快速检测。方法基于Lp1型嗜肺军团菌基因组ORF11区域设计特异性的引物和探针,建立体系,验证方法的灵敏度、特异性和重复性,并对模拟的中央空调冷却水水样进行检测。结果该方法的检测灵敏度达3.8×10 cfu/ml,具有良好的特异性,仅嗜肺军团菌Lp1型菌株呈阳性结果,重复检测平均Ct值变异系数。对模拟的水样进行检测,与方法的灵敏度相一致,且具有良好的重复性。结论该方法可实现对嗜肺军团菌Lp1型的快速检测。     

传统细菌培养法与荧光PCR法分离公共场所嗜肺军团菌结果比较

目的：对公共场所环境样本（水、土壤、气溶胶）进行嗜肺军团菌监测,掌握南京市公共场所中军团菌的污染情况和菌型分布。方法：对12家商场、医院中央空调系统采集水样（冷却水、景观水、淋浴水、自来水）,土壤类样品（背景土、花卉土、风管积尘、景观土）,采用传统细菌培养法及荧光PCR法进行嗜肺军团菌的分离鉴定。结果：12家单位共采样234份（水样88份、土壤146份）,传统细菌培养法检出嗜肺军团菌9份（主要类型为Lp1型）,检出率为3.85%;而实时荧光PCR法检出47份阳性（主要类型为Lp1型）,检出率为20.08%。两者检出阳性率比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：南京市公共场所存在嗜肺军团菌污染,荧光PCR法总检出率明显高于传统细菌培养法,荧光PCR方法较培养法灵敏性较好。     

荧光定量PCR在军团菌监测中的应用

目的发展一种敏感、快速、特异的检测军团菌的方法,并与运用常规的细菌培养方法所检测结果相比较。方法分别用传统的细菌培养法和以鉴定嗜肺军团菌种水平的mip设计引物的荧光定量PCR方法对68份公共场所中央空调的冷却塔水、客房热水、冷凝水进行检测,通过检测结果比较,评价该方法在实际工作中的应用。结果传统的细菌分离培养共有20份军团菌培养阳性,阳性检出率为29.4%,而以Mip基因为引物,对68份浓缩后的水样进行荧光定量PCR扩增共检出32份为嗜肺军团菌阳性,阳性检出率为47.1%,且细菌分离培养阳性的标本荧光定量PCR均阳性。结论荧光定量PCR法检测阳性率明显高于细菌培养法,且快速、敏感、特异;值得在疾病监测筛查检验中推广应用。     

酶底物法定量检测嗜肺军团菌的应用研究

目的开展嗜肺军团菌检测新方法的应用研究,利用酶底物法定量检测技术应用于辖区公共场所不同水样的嗜肺军团菌检测中。方法 2018年—2021年收集辖区公共场所淋浴热水、水龙头水样以及集中空调冷凝水、冷却水样,采用酶底物法进行检测,对检出的阳性样本经细菌分离技术与TaqMan荧光定量PCR实验验证确认。结果应用酶底物定量检测法在336件水样中检出阳性样本81件,阳性率为24.1%。嗜肺军团菌计数结果在<1 MPN/100 ml～2 272.6 MPN/100 ml。对81件阳性样本经细菌分离培养、血清分型实验、荧光定量PCR实验加以验证确认,无假阳性,方法特异度为100%。结论通过应用酶底物法检测嗜肺军团菌,操作简便、结果快速、定量、灵敏,具有推广应用的价值。     

酶底物定量法检测水中嗜肺军团菌

目的 建立水中嗜肺军团菌定量检测法—酶底物定量法。方法 通过加标比对试验确定酶底物定量法的样品保存条件以及试验条件;通过酶底物定量法与传统培养法对采集的水样加标前后测定结果的比对,获得该方法的准确度、精密度、特异性和灵敏度等技术指标,确定该方法的检测性能。结果 酶底物定量法的样品应在含硫代硫酸钠的无菌采样容器中,常温条件下送往实验室完成检测;试验最适培养条件为36℃下培养7 d;准确度(回收率)范围在109%～113%;精密度RSD为0.37%～2.46%;方法特异性为94.59%,灵敏度为92.31%;50份实际样品测定时,酶底物定量法结果与真值的一致性为94%,准确度和灵敏度均高于传统培养法。结论 酶底物定量法具有较好的准确度、精密度、特异性和灵敏度,适用于批量样品筛查以及较低水平嗜肺军团菌污染时的测定,是水中嗜肺军团菌标准检验方法的有益补充,同时为国标方法修订提供技术储备。     

应用PCR检测环境水体中的嗜肺军团菌

目的　建立检测Mip基因的PCR方法,以检出环境水体中的嗜肺军团菌。　方法　采用Godkey软件设计引物,制备菌种模块,对模拟和环境水样进行处理,然后作PCR扩增及其产物检测。　结果　该方法检测军团菌的灵敏度为5 .8×10 2 cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出65 0bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0 %。　结论　该方法快速、灵敏、特异,为水体中的嗜肺军团菌检测提供了有效方法     

环境水中嗜肺军团菌的分离培养法和巢式PCR法比较

目的应用传统分离培养法和巢式PCR法检测环境水中嗜肺军团菌污染状况,并比较两种方法的检测效果。方法于2012年7-10月,采集北京市丰台区商场和超市、宾馆和饭店、综合性医院三类场所的中央空调冷却水、自来水、淋浴水、景观水,分别使用培养法及巢式PCR法检测嗜肺军团菌。结果共检测187件水样,传统分离培养法对嗜肺军团菌的检出率为2.67%(5/187),低于巢式PCR法[19.79%(37/187)],差异有统计学意义(χ~2=27.465,P0.01)。结论北京丰台区多种环境水体存在嗜肺军团菌污染;巢式PCR法对环境水中嗜肺军团菌的灵敏度优于传统分离培养法。     

中央空调系统嗜肺军团菌传统细菌培养与荧光PCR结果比较

目的中央空调系统嗜肺军团菌传统细菌培养与TaqMan荧光定量PCR检测结果比较。方法对9家商场、宾馆、医院、办公楼公共场所中央空调系统的冷却塔水、生物膜、淤泥三环节样本进行军团菌检测,用传统细菌分离培养法分离鉴定,并用TaqMan荧光定量PCR法加以验证。结果本次对9家单位的水冷式中央空调系统三环节采样18份,其中传统细菌培养法检出4份军团菌,检出率为22.2%;冷却塔水、生物膜、淤泥检出率分别为22.2%、25.0%、20.0%。用荧光PCR法检出9份,检出率为50.0%;冷却塔水、生物膜、淤泥检出率分别为44.4%、50.0%、60.0%。结论金华市中央空调系统中存在嗜肺军团菌,荧光PCR检出率高于传统细菌培养法。     

嗜肺军团菌微滴式数字PCR检测方法的建立

目的建立嗜肺军团菌微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR)技术进行比较。方法针对嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,验证其特异性后,用于ddPCR和qPCR。优化ddPCR的退火温度、引物、探针浓度后,比较ddPCR和qPCR灵敏度和重复性,并对模拟样品进行检测。结果用5株非嗜肺军团菌测试特异性,结果表明具有良好的特异性。ddPCR与qPCR对DNA模板的检测限一致(42.6 fg),模拟样品检出限为300 cfu/ml,ddPCR的线性相关系数(0.999)略优于qPCR(0.982),ddPCR检测的RSD(0.78%~14.06%)均高于qPCR(0.30%~1.98%)。结论微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于嗜肺军团菌检测,且可以对基因进行绝对定量。     

公共场所空气中存活嗜肺军团菌叠氮溴乙啶-定量PCR检测的初步研究

目的建立叠氮溴乙啶(ethidium monoazide bromide,EMA)与定量PCR(qPCR)相结合检测公共场所空气中存活的嗜肺军团菌的方法。方法用培养的嗜肺军团菌进行实验以得到EMA处理的最适条件;采集嗜肺军团菌气溶胶模拟样品,采用EMA-qPCR(EMA处理组)和qPCR(对照组)验证其检测活菌的效果;并将该方法在公共场所进行现场应用实验。结果 EMA终浓度在2.5μg/ml、4℃孵育5min、光照5 min的处理条件下,可在基本不影响活菌PCR扩增的情况下使死菌qPCR的信号降低约2 lg,即可以抑制99%的死菌PCR扩增。当死菌和活菌的浓度比例不超过1 000∶1时,EMAqPCR方法可实现对空气中存活嗜肺军团菌的定量检测。采集的公共场所气溶胶样品中,EMA处理组和对照组的嗜肺军团菌阳性率分别为37.5%(15/40)和57.5%(23/40);在两组检测结果均为阳性的10对样品中,1对样品的检测结果相同,5对样品EMA处理组检测结果低于对照组,平均低0.70 lg copies/ml,4对样品EMA处理组的检测结果高于对照组,平均高0.65lg copies/ml。结论 EMA-qPCR方法可用于公共场所空气中嗜肺军团菌活菌的快速定量检测。     

应用巢式PCR法检测综合医院肺炎患者痰样本中的嗜肺军团菌

目的调查综合医院肺炎患者嗜肺军团菌的感染情况。方法 2012年6月-2013年6月,选择北京市丰台区、江苏省常州市和无锡市、广东省深圳市综合性医院的肺炎住院患者为调查对象,采集肺炎患者的痰样本,问卷调查收集患者的基本信息,采用基于mip基因的巢式PCR法检测肺炎患者痰样本中的嗜肺军团菌。结果共调查157例肺炎住院患者,痰样本嗜肺军团菌的阳性率是12.1%(19/157),北京市丰台区、江苏省无锡市、江苏省常州市和广东省深圳市4地区综合医院肺炎患者痰样本中嗜肺军团菌的阳性率分别为11.9%、11.8%、20.0%和6.5%,差异无统计学意义(χ2=3.404,P=0.333)。入院前没有户外活动和有户外活动的肺炎患者痰样本中,嗜肺军团菌的阳性率分别为9.4%和15.3%,差异无统计学意义(χ2=1.261,P=0.261)。结论综合医院肺炎患者存在嗜肺军团菌感染。     

水中嗜肺军团菌的定量培养和抗原检测技术

BINAX Equate试验是一种快速检测水中嗜肺军团菌血清群I型(是90％的军团病的病原体)的免疫技术。在此之前,嗜肺军团菌的检测不仅费时费力,培养长达2周,且不能现场检测;直接免疫荧光抗体试验结果对环境样品不可靠且不能现场进行;PCR技术需要经高级培训的专业人员和精密仪器,造价昂贵,且在环境样品检测中应用有待证实。BINAX Equate试验是专     

实时荧光定量PCR快速检测嗜水气单胞菌方法的建立

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立一种快速、特异、灵敏、定量检测嗜水气单胞菌的方法,用于病人腹泻物或水产品病变部位目的菌的快速检测。方法以GenBank中嗜水气单胞菌WP3的溶血素基因(hlyA)为靶序列,设计引物与TaqMan探针,对模板DNA制备方法,PCR反应时间和温度进行优化,以嗜水气单胞菌ATCC7966和20株相关细菌考核检测体系的特异性、灵敏性和重复性。结果本方法检测时间仅需30min,定量线性范围5.4×103～5.4×108cfu/ml,与20株常见肠道细菌均无反应,对4个浓度的嗜水气单胞菌测定的批内标准差在0.08～0.14之间。结论成功建立实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌方法,该方法可在半小时左右直接定量检测病人腹泻物或水产品病变部位中的嗜水气单胞菌,具有推广应用价值。     

PCR方法捕获环境水样中嗜肺军团菌DNA

嗜肺军团菌是军团病的主要病原体，它所导致的军团病病例占临床病例的80％以上，多数军团病暴发由嗜肺军团菌所引起。通过针对嗜肺军团菌种保守基因（mipgene）设计的引物，我们建立了一种多聚酶链反应（PCR）检测方法，可以准确捕获环境标本中的嗜肺军团菌，同时具有很好的特异性，其最低可检出18cfu／ml的细菌。该方法的建立为嗜肺军团菌病的诊断以及在军团病流行病学调查中嗜肺军团菌病原的追踪提供了一条便捷、准确、可靠的途径。