基质细胞衍生因子-1及其受体在G-CSF诱导的造血干/祖细胞动员中的作用

目的探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及其特异性受体CXCR4在G-CSF诱导的造血干／祖细胞（HSPC）动员中的作用。方法应用酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫组织化学、流式细胞术等方法检测健康供者稳态及G-CSF动员过程中骨髓、外周血SDF-1／CXCR4的变化，并应用SDF-1中和性抗体阻断BALB／c小鼠SDF-1信号通路，进一步验证SDF-1／CXCR4在动员中的作用。结果G-CSF动员前骨髓和外周血的SDF-1浓度分别为（7．23±0．66）μg/L和（5．43±0．35）μg／L，动员后分别为（5．88±1．03）μg／L和（5．42±0．52）μg/L。动员后骨髓SDF-1蛋白水平下降（P＜0．05），骨髓和外周血之间的SDF-1浓度梯度消失（P＞0．05）；稳态骨髓、动员后骨髓和动员后外周血的CD34^＋ CXCR4^＋细胞在CD34^＋细胞群中的比例分别为（40．98±21．56）％、（65．80±24．68）％和（27．54±26．03）％。动员后CXCR4在骨髓CD34^＋胞上表达增加（P＜0．05），而外周血CD34^＋细胞CXCR4表达降低（P＜0．05）。SDF-1中和性抗体可降低G-CSF动员的BALB／c小鼠外周血成熟白细胞和祖细胞集落数量（P＜0．05）。结论骨髓中SDF-1水平的降低以及CXCR4在HSPC上表达的下降促进了G-CSF介导的动员的发生。     

CD28/CTLA-4共刺激分子在再生障碍性贫血免疫发病机制中的作用

目的 研究CD28、CTLA-4在再生障碍性贫血（AA）免疫发病机制中的可能作用。方法 以流式细胞术分别分析23例发病期AA、10例恢复期AA患者和15名正常人骨髓细胞中CD3^＋CD4^＋T细胞上CD28、CTLA-4表达率，Th1、Th2细胞比例，评价CD28、CTLA4表达与Th1／Th2、中性粒细胞绝对值（ANC）之间的关系。结果 ①正常对照组CD3^＋CD4^＋T细胞上CD28、cTLA4表达率及CD28^＋／CTLA-4^＋比值分别为（31．40±10．83）％、（2．45±1．30）％、17．02±13．44，AA患者发病期分别为（39．84±10．89）％、（1．43±0．67）％、43．04±37．61，AA患者恢复期分别为（22．00±9．08）％、（3．46±2．26）％、10．49±7．80；与正常对照组比较，AA患者发病期CD28显著升高（P〈0．05），CTLA-4显著下降（P=〈0．01），CD28^＋／CTLA4^＋比值相应地亦显著升高（P〈0．05），而恢复期上述数值与正常对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。②正常对照组Th1、Th2细胞、Th1／Th2比值分别为（4．21±2．11）％、（1．99±1．27）％、2．46±1．28，AA发病期为（11．13±4．96）％、（2．46±1．65）％、5．20±1．98，恢复期分别为（5．39±4．29）％、（2．53±2．41）％、2．87±1．43；与正常对照组比较，AA发病期Th1增高，Th1、Th2平衡向Thl偏移（P值均〈0．01），恢复期与正常对照组比较，差异无统计学意义。③AA患者CD28^＋／cTLA4^＋比值与Thl／Th2比值呈正相关（P〈0．05），ANC与CD3^＋CD4^＋CD28^＋T细胞数呈负相关（P〈0．01），与CD3^＋CD4^＋CTLA-4^＋T细胞数呈正相关（P〈0．01）。结论 ①AA发病期患者骨髓CD4^＋T细胞表面共刺激分子表达异常，CD28升高，而CTLA-4下降，AA患者骨髓T细胞处于“预激活”状态；②CD28／CTLA-4比值与Th1／T12．比值呈正相关提示：CD28、CTLA-4表达失衡可引起Th细胞格局偏移，Th1型细胞增多。③ANC和CD28、CTLA-4间相关分析进一步说明CD28、CTLA-4与AA的发生、发展有关。     

抗小鼠CD122抗体促进脐血CD34^＋细胞在NOD/SCID小鼠体内的重建

本研究旨在探讨抗小鼠CD122抗体促进人脐血CD34^＋造血干细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内的重建能力。对NOD/SCID小鼠进行半致死剂量γ射线照射,照射后腹腔注射200μg同型对照抗体或者抗小鼠CD122抗体,6-8 h后经尾静脉注射人脐血CD34^＋细胞或者注入PBS作为对照。处理后第2、3、4周取仅注射抗小鼠CD122抗体或同型对照抗体的小鼠外周血,动态监测小鼠NK细胞比例变化。在经过脐血CD34^＋细胞移植的小鼠中,利用流式细胞术对移植后小鼠骨髓中人CD45^＋比例以及CD45^＋细胞亚群中人CD34,CD19和CD33比例进行分析,观察抗小鼠CD122抗体对人造血干细胞在小鼠体内重建能力的影响。结果表明,用抗CD122抗体处理后2周和3周时,小鼠外周血中NK细胞比例分别为（4.6±0.6）%和（5.7±1.7）%,与注射同型对照抗体的NOD/SCID小鼠（12.2±1.4）%和（13.3±1.2）%相比下降约60%。在移植了人脐血CD34^＋细胞的小鼠中,同时用CD122抗体处理组在移植后6周和8周时小鼠骨髓中h CD45^＋比例分别为（63.0±12.2）%和（53.2±16.3）%,明显高于同型对照抗体组中h CD45^＋比例（7.7±3.6）%和（6.1±2.4）%。此外,经过抗CD122抗体处理组的小鼠移植8周后骨髓中仍能够明显的检测到人CD34^＋细胞的存在。结论：抗小鼠CD122抗体通过降低NOD/SCID小鼠的NK细胞的比例,大大促进了人脐血CD34^＋造血干细胞在免疫缺陷小鼠体内的重建能力。     

原发性胆汁性肝硬化动物模型的建立及外周血T淋巴细胞表面CD40配体分析

目的用聚肌苷酸胞苷酸（polyinosinic polycytidylic acid，PolyI：C）注射C57BIL/6小鼠以研究建立原发性胆汁性肝硬化（PBC）动物模型，探讨CD40配体（CD40L）在外周血T淋巴细胞表面的表达，和在PBC中T淋巴细胞的活化情况。方法20只C57BIM6小鼠随机分对照组和模型组。将polyI：C以5ms／kg的剂量腹腔注射模型组小鼠，对照组注射PBS，每周2次，120d后处死，留取外周血和肝组织，间接免疫荧光法检测血清抗线粒体抗体（AMA），HE染色观察胆管病理变化，生化分析仪测定血清碱性磷酸酶（ALP）含量，流式细胞术分析外周血CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞所占比例及CD40L在T淋巴细胞表面的表达情况。结果PolyI：C注射120d后模型组小鼠均出现AMA阳性，肝组织小胆管周围有不同程度的炎性细胞浸润，血清ALP明显高于对照组（P〈0．001）；对照组胆管及血清ALP均未发生明显变化；模型组小鼠CD40L^＋／CD4^＋、CD40L^＋／CD8^＋T淋巴细胞[（4．35±0．34）％，（1．42±0．10）％）显著高于对照组[（0．78±0．10）％，（0．43±0．04）％，P〈0．01]；而模型组小鼠CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞所占比例[（25．83±1．80）％，（24．84±2．70）％]与对照组[（20．51±3．46）％，（17．84±1．53）％]比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论PolyI：C腹腔注射C57BIM6小鼠120d可引起PBC病变，活化的CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞在PBC发病中起重要作用。     

人胎儿血造血干／祖细胞的生物学特性及其移植实验

背景：造血干细胞来源目前包括骨髓干细胞、外周血干细胞和脐带血干细胞，寻找新的干细胞来源以满足临床移植需要一直是人们的希望。从妊娠第5周起，肝脏中发育成完善的血窦系统，此后造血干细胞就可以随血液流动迁移。 目的：观察人胎儿血造血干／祖细胞的生物学特性并对其进行非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠移植。 设计：对照实验。 单位：广西医科大学第一附属医院血液科。对象：①细胞来源：21例胎儿血标本取自胎龄为18-29周[（24．2&;#177;3．2）周1死亡胎儿及2l例足月脐带血标本取自广西医科大学第一附属医院产科2002-10／2003-02。所取的血标本均取得其家属的知情同意。②实验动物：非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠12只，6-7周龄，雌性，无菌饲养于超净工作台中。 方法：采用流式细胞术，检测胎儿血的造血干／祖细胞表面标志，包括CD34,CD38，HLA-DR及CD90，同时与2l例足月儿脐血作比较。并将人胎血单个核细胞移植给6只经亚致死量照射的非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠，5周后观察其植人情况，采用流式细胞术检测小鼠骨髓中人白细胞的含量，以及采用聚合酶链反应检测小鼠骨髓中的人Cart-1基因。 主要观察指标：①胎血和脐血造血干／祖细胞表面标志的表达情况。②将胎血细胞移植给非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠的植入情况。结果：①人胎血中CD34^＋细胞的百分率显著高于足月脐血[（2．2588&;#177;O．7209）％，（1．5729&;#177;0．4783）％，P=0.00041，CD34^＋CD38^-细胞和CD34^＋CD90^＋细胞的百分率也均显著高于足月脐血[（1．2986&;#177;0.4706）％。（0.87l0&;#177;0.4095）％。P=0．0016；（0.9300&;#177;0.4692）％，（0.560&;#177;0.3658）％，P=0.03241。②6例胎血中的4例可顺利重建经亚致死量照射的非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠的造血，移植后5周在小鼠骨髓中仍可检测到人的白细胞和人Cart-l基因。 结论：人胎儿血中有比足月脐血更高含量的造血干／祖细胞，其单个核细胞能植入非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠骨髓，并重建髓、淋巴系全面造血。胎儿血有望成为多能造血干细胞来源。     

骨髓腔内输注人造血干／祖细胞促进NOD-SCID小鼠体内造血功能的恢复

本研究比较经骨髓腔内输注（intra—bone marrow infusion,iBMI）及静脉输注（intravenous infusion,iVI）人脐血（cord blood,CB）造血千／祖细胞（HS／PC）对NOD～SCID受鼠体内造血重建的影响。将纯化的CB CD34^＋细胞移植到受亚致死剂量照射的NOD—SCID受鼠体内。受鼠随机分为3组：①iBMI组：骨髓腔内输注CD34^＋细胞5×10^5／只;②iVl组：尾静脉输注CD34^＋细胞5×10^5／只;③阴性对照组：输注PBS缓冲液。于异种移植后第3、5及第8周通过流式细胞术、聚合酶链式反应、免疫组织化学及造血祖细胞集落分析的方法比较人造血系统各系细胞植入率,通过二次移植实验比较NOD—SCID受鼠体内人HS／PC长期造血重建能力。结果表明：移植后第8周,iB—MI组受鼠骨髓、外周血及脾脏中人CD45^＋细胞比例均显著高于iVI组（P〈0．05）;iBMI组及iVI组移植的HS／PC均具有多向分化能力;移植后第8周,iBMI组受鼠骨髓中CD45^＋CD19^＋细胞、CD45^＋CD33^＋细胞、CD45^＋CD56^＋细胞及CD45^＋CD34^＋细胞比例均显著高于iVI组（P〈0．05）,CD45^＋CD14^＋细胞及CD45^＋CD41a^＋细胞比例亦高于iVI组（P〉0．05）。iVI组及iBMI组长期存活受鼠的肝脏、脾脏、肺脏、外周血、骨髓细胞中均可检测到人17号染色体α-卫星特异性片段。应用免疫组织化学法在移植后第8周的iBMI组受鼠的脾脏、肝脏和肺脏中均可检出人CD45抗原的表达.iBMI组受鼠的骨髓细胞各系集落总数于移植后第8周显著高于iVI组（P〈0．05）。二次移植后第6周,iVI组及iBMI组受鼠的各组织脏器中均可检出人17号染色体α-卫星特异性片段的表达。结论：与iVI相比,经iBMI移植人CBCD34^＋细胞至NOD—SCID受鼠可以促进HS／PC的造血重建及多向分化,提高植入率。     

骨髓增生异常综合征患者外周血树突细胞数量、亚群及其表面协同刺激分子表达的研究

目的 检测骨髓增生异常综合征（MDS）患者外周血树突细胞（DC）总量、亚群（pDC和mDC）比例及其表面协同刺激分子（CD80、CD86和CIMO）表达，探讨MDS患者细胞免疫异常的形成机制。方法 选取38例MDS患者及19名正常对照，采用荧光素单克隆抗体标记法和流式细胞术检测MDS患者外周血中Lin1^—HLA-DR^＋细胞（DC）、Lin1^-HLA—DR^＋CD123^＋细胞（pDC）、Lin1—HLA—DR^＋CD11c^＋细胞（mDC）的数量以及CD80、CD86和CIMO在DC膜上的表达。结果低危MDS组、高危MDS组和正常对照组外周血DC总量分别为（33．7±7．0）×10^6／L、（56．3±29．0）×10^6／L和（12．1±1．4）×10^6／L（P〈0．05），pDC数量分另U为（12．6±4．1）×10^6／L、（3．6±1．0）×10^6／L和（6．6±0．7）×10^6／L（P〉0．05），mDC数量分别为（16．7±6．3）×10^6／L、（28．7±17．6）×10^6／L和（5．5±0．9）×10^6／L（P〈0．05）。低危MDS组、高危MDS组和正常对照组DC占外周血单个核细胞（PBMNC）百分比分别为（2．37±0．53）％、（3．58±1．39）％和（0．68±0．08）％（P〈0．05），pDC占PBMNC百分比分别为（0．82±0．29）％、（0．31±0．06）％和（0．37±0．04）％（P〉0．05），mDC占PBMNC百分比分别为（0．96±0．35）％、（1．51±0．70）％和（0．32±0．05）％（P〈0．05）。低危MDS组、高危MDS组和正常对照组外周血中CD80^＋DC分别为（30．6±11．8）×10^6／L、（2．3±0．9）×10^6／L和（2．3±0．6）×10^6／L（P〈0．05），CD86^＋DC分别为（25．1±7．4）×10^6／L、（12．4±6．3）×10^6／L和（6．2±3．2）×10^6／L（P〈0．05），CD40^＋DC分别为（2．8±1．0）×10^6／L、（1．5±0．9）×10^6／L和（3．2±2．3）×10^6／L（P〉0．05）。结论 MDS患者外周血中DC数量增多、比例异常；以mDC增多为主，pDC无明显增多；MDS患者DC高表达CD80和CD86，CD40表达不增高。提示MDS患者诱导抗肿瘤细胞免疫的抗原呈递细胞（pDC）数量及功能不足；而与正常造血克隆炎性损伤有关的抗原呈递细胞（mDC）却增多。这可能是导致MDS患者细胞免疫异常的重要机制之一。     

体外共培养双份脐血CD34^＋细胞对各自归巢相关分子表达的影响

本研究探讨脐血CD34^＋细胞体外混合培养对彼此归巢相关分子表达的影响。从正常人骨髓中分离扩增间充质干细胞，富集传代，加速器照射（12Gy）后作为滋养层细胞，将免疫磁珠分选纯化的两份脐血CD34^＋细胞混合接种到其表面（其中1份CD34^＋细胞用CFSE标记），观察各自归巢相关分子（黏附分子）表达的变化。结果表明，脐血CD34^＋细胞分选富集的纯度为（98．25±0．93）％，实验组在共培养6天后，两份脐血CD34^＋细胞的比例分别降为（60．4±6．32）％和（60．2±5．12）％，但与对照组比较无统计学差异；实验组各份CD34^＋细胞的CD44，CD62L，CD184以及CD26的阳性率较培养前均无显著变化。而CD162表达显著下降。CD54在培养3天后有所上升，但培养6天后下降至培养前水平，与对照组比较无统计学差异。结论：将两份脐血的CD34^＋细胞体外混合培养对彼此归巢相关分子并无明显影响     

CD4+CD25+调节性T细胞在特发性血小板减少性紫癜患者中的变化

目的探讨CD4^＋CD25^＋T细胞在特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者发病机制中的作用。方法应用流式细胞术检测ITP患者外周血CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4^＋CD25^highT细胞、CD4^＋FOXP3^＋T细胞、CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋T细胞的数量；实时荧光定量PCR检测外周血FOXP3 mRNA的表达水平。将ITP患者和正常人CD4^＋CD25^highT细胞与自身CD4^＋CD25^-T细胞混合培养，检测CD4^＋CD25^high T细胞免疫抑制功能。结果ITP患者外周血中CD4^＋CD25^＋T细胞约占CD4^＋T细胞的（15．64±5．82）％，明显高于正常对照组（9．30±3．95）％（P〈0．01），CD4^＋CD25^high T细胞比例为（1．53±0．66）％，与对照组[（1．36±0．55）％]比较差异无统计学意义（P〉0．05）；CD4^＋FOXP3^＋T细胞和CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋T细胞分别为（1．82±1．42）％和（1．25±0．94）％，均明显低于对照组[（3．90±1．37）％和（2．65±0．92）％]（P值均〈0．01）。ITP患者外周血FOXP3 mRNA表达水平较正常人明显下调（P〈0．01），CD4^＋CD25^high T细胞的抑制活性较正常人减弱（P〈0．01）。结论ITP患者中CD4^＋CD25^＋T细胞FOXP3表达水平降低，抑制活性减弱。     

不同时相移植人骨髓间充质干细胞对人脐血CD34^＋细胞植入NOD／SCID小鼠的影响

为了观察不同时相移植人骨髓间充质干细胞（MSC）对脐血（UCB）CD34^＋细胞移植的NOD／SCID小鼠造血重建的影响，明确最佳的移植时机，将体外培养扩增的人骨髓MSC分别于UCBCD34^＋细胞移植同时、移植前48小时及移植后48小时输入经^60Coγ射线照射的NOD／SCID小鼠，观察共移植后42天内小鼠外周血白细胞和血小板变化，并于移植后42天处死小鼠，用FACS检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量。结果表明：（1）MSC和UCBCD34^＋细胞同时输注可明显降低外周血白细胞和血小板下降幅度，缩短白细胞和血小板恢复时间；二者不同时输注均不降低白细胞和血小板下降幅度，且输注UCBCD34^＋细胞后48小时输注MSC时外周血血小板恢复时间明显晚于同时输注者。（2）与单纯UCBCD34^＋细胞移植相比较，不同时相输注MSC均可促进UCBCD34^＋细胞的植入，三个共输注组间促进骨髓各系造血植入效应无明显差异。结论：人骨髓MSC与UCBCD34^＋细胞共移植时，以同时移植效果最佳，此结果为MSC的临床应用提供了实验依据。     

小鼠肿瘤坏死因子α增强造血干/祖细胞归巢效率的机制研究

目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF)α在调节造血干/祖细胞(HS/PC)归巢中的增效作用及其机制.方法 将荧光染料CFSE标记的脐血CD34+细胞移植入接受照射(对照组)或联合TNFα预处理(实验组)的BALB/c受鼠.移植后20 h,采用流式细胞术(FACS)检测脐血CD34+细胞在BALB/c受鼠中的分布(外周血、肝脏、肺脏)与归巢(骨髓、脾脏)特征,计算其相应的归巢效率;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测BALB/c受鼠血清基质衍生因子(SDF)-1α水平;FACS检测TNFα预处理前、后脐血CD34+细胞表面CXCR4表达水平的变化;免疫组化法检测BALB/c受鼠骨髓及脾脏组织切片中SDF-1α的表达水平.结果 脐血CD34+细胞主要归巢于BALB/c受鼠骨髓和脾脏;经TNFα预处理的实验组BALB/c受鼠骨髓归巢率[(0.65±0.13)%]显著高于对照组[(0.30±0.09)%,P<0.01];但TNFα预处理同时显著抑制脐血CD34+细胞归巢于BALB/c受鼠脾脏(P<0.01);不同剂量的TNFα预处理不影响受鼠血清SDF-1α水平;新鲜分离的脐血CD34+细胞与不同浓度TNFα共孵育18 h后,其表面CXCR4表达水平并无明显变化;但TNFα预处理受鼠骨髓龛组成细胞SDF-1α表达增高,且脾脏红髓区小梁动脉和小梁静脉内皮细胞SDF-1α表达增高.结论 TNFα通过提升骨髓龛SDF-1α浓度梯度促进HS/PC归巢于骨髓,这一发现将有助于为临床提供可行性HS/PC归巢增效剂.     

不同来源的造血干/祖细胞表面归巢相关分子表达谱的比较研究

目的　比较不同来源的造血干 /祖细胞表面归巢相关分子 (HRM)表达谱的差异性。方法　采用高度灵敏的四色流式细胞术检测脐血 (UCB)、动员后的外周血 (mPB)及骨髓 (BM)来源的造血干 /祖细胞表面系列HRM表达水平。结果　UCB、mPB及BM来源的CD34bright细胞均高度表达黏附分子CD4 4、CD11a、CD18、CD6 2L、CD31及CD4 9d ;但UCB来源的CD34bright细胞及CD34brightCD38-细胞黏附分子CD4 9e、CD4 9f、CD5 4及趋化因子受体CXCR 4的表达水平显著低于mPB及BM来源者 ;上述不同来源的造血干 /祖细胞均不表达其他趋化因子受体 ,包括CCR 1、CCR 2、CCR 3、CCR 5、CXCR 1、CX CR 2、CXCR 3及CXCR 5 ;更为有意义的是 ,只有mPB来源的CD34bright细胞表达基质金属蛋白酶MMP 2及MMP 9。CD34brightMMP 2 及CD34brightMMP 9 细胞百分率分别为 (11.4± 4 .9) %及 (2 7.6± 7.8) %。结论　UCB来源的造血干 /祖细胞低表达或不表达某些HRM ,这可能是UCB移植后造血重建延迟的原因之一。     

脐带间充质干细胞对CD34+细胞在小鼠体内归巢的影响及其机制研究

目的 探讨脐带来源间充质干细胞(MSC)对脐血来源CD34+细胞在NOD/SCID小鼠体内归巢的影响及其可能的机制.方法 将CD34+细胞与MSC细胞共移植入经放射线照射后的NOD/SCID小鼠,采用流式细胞术和RT-PCR检测移植后20 h NOD/SCID小鼠骨髓及脾脏中人CD34+细胞,计算其相应的骨髓和脾脏的归巢效率.将脐血CD34+细胞与脐带MSC体外共培养,检测MSC细胞对CD34+细胞趋化功能的影响;并于培养4、7 d检测培养后CD34+细胞表面CD49e、CD31、CD62L、CD11a等归巢相关黏附分子表达情况.结果 ①移植后20 h采用流式细胞术成功在小鼠骨髓和脾脏中检测到人CD45+细胞.共移植组CD34+细胞骨髓归巢率[(7.2±1.1)%]高于单移植组[(5.4±0.9)%](P<0.05).②RT-PCR结果 显示共移植组小鼠骨髓细胞和脾脏细胞,单移植组小鼠脾脏细胞扩增得到人GAPDH基因片段,而单移植组小鼠骨髓细胞未见明显扩增条带.③MSC存在时,CD34+细胞的体外迁移能力为(35.7±5.8)%,显著高于CD34+细胞自发迁移率[(3.5±0.6)%,P<0.05].④CD34+细胞与MSC体外共培养后细胞表面CD49e、CD31和CD62L黏附分子的表达水平高于CD34+细胞单独培养组.结论 MSC细胞与CD34+细胞共移植有利于CD34+细胞向骨髓、脾脏等造血器官归巢,这可能与MSC促进CD34+细胞迁移以及维持CD34+细胞表面归巢相关黏附分子的表达相关.     

间充质干细胞与人脐血CD34+细胞共移植对NOD/SCID小鼠造血重建的影响

目的 观察间充质干细胞(MSC)与不同比例脐血CD34+细胞共移植对NOD/SCID小鼠造血重建的影响,明确MSC与脐血CD34+细胞共移植的最适数量.方法 给60Coγ射线照射的雌性NOD/SCID小鼠共移植人MSC和不同比例的脐血CD34+细胞,观察共移植后42 d内小鼠外周血白细胞和血小板变化,并于移植后42 d处死小鼠,用流式细胞术检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量.结果 与单纯脐血CD34+细胞移植相比较:①脐血CD34+细胞与1、5和10倍数量的MSC共移植时,可明显减轻外周血白细胞和皿小板的下降幅度(P<0.01),提前1周使白细胞和血小板恢复至正常水平(P<0.05),三组间差异无统计学意义(P>0.05);②MSC与不同比例的脐血CD34+细胞共移植均可明显提高外周血、骨髓和脾脏造血细胞植入率.比例为10:1时,外周血、骨髓和脾脏中的人源细胞(huCD45+细胞)含量分别增加了(2.8±0.6)倍、(3.5±0.9)倍和(5.2±0.6)倍,增加倍数差异均有统计学意义(P<0.01),达到了最佳的植入效果.结论 脐血CD34+细胞与10倍数量的MSC共移植可达到最佳的促进造血重建作用.     

脐血造血干/祖细胞免疫表型的流式细胞术双标法分析及其意义

目的比较脐血和骨髓中造血干/祖细胞(HSPC)的免疫表型差异.方法使用流式细胞术(FCM)双标法对38份脐血及10份骨髓HSPC进行免疫表型分析.结果①脐血有核细胞中CD34+细胞所占比例与骨髓中相近,约为0.5%;②脐血CD34+细胞中CD34+CD38-[(17.C4±5.37)%]、CD34+HLA-DR-[(32.65±10.71)%]及CD34+H-CAM+(CD44+)[(77.84±7.69)%]亚群含量均高于骨髓[含量分别为(8.26±3.19)%、(14.05±1.67)%和(70.02±6.40)%],CD34+CD13+、CD34+CD19+亚群比例低于骨髓.结论脐血与骨髓CD34+细胞比例相近,但前者较原始的干细胞含量更高,故脐血是极具潜力的HSPC来源;而脐血CD34+细胞中髓系及淋系祖细胞含量低于骨髓,可能是脐血移植后造血及免疫重建缓慢的原因之一.     

SCID-repopulating activity of human umbilical cord blood-derived hematopoietic stem and/or progenitor cells in a nonobese diabetic/Shi-SCID mice serial xenotransplantation model and immune cell activities in vitro: a comparative study of the filter method and the hydroxyethyl starch method

BACKGROUND: A novel filter system was developed for umbilical cord blood (UCB) volume reduction. The aim of this study was to compare the functions of cryopreserved UCB cells processed by the filter and by the hydroxyethyl starch (HES) sedimentation method from the aspect of the graft quality. STUDY DESIGN AND METHODS: UCB specimens were divided into two portions, processed in parallel by the filter or HES, and then cryopreserved in the clinical setting. The thawed UCB specimens containing 1 x 10(5) CD34+ cells were injected into nonobese diabetic/Shi-SCID mice, and the engraftment capacity in primary and secondary transplants was assessed. The functions of natural killer (NK) cells and monocyte-derived dendritic cells (DCs) were also assayed in vitro. RESULTS: The percentage of recovery of CD34+ cells by both methods was equivalent. In the marrow of the primary transplant recipients, the percentage of hCD45+ cells in the filter group and HES group was 58.2 +/- 31.6 and 46.5 +/- 28.4 percent, respectively (p = 0.016). The engraftment capacity and multilineage differentiation in the secondary transplantations were equal in both groups. The cytotoxic activity of the NK cells and phagocytosis activity of the DCs from both the groups were similar. CONCLUSION: The filter yielded a desirable percentage of recovery of hematopoietic cells with engraftment ability in the clinical setting. Thus, it is considered that the filter system may be useful for UCB banking for cord blood transplantation.     

深低温冻存的外周血单个核细胞活性氧水平与造血干/祖细胞归巢黏附分子表达之间关系的研究

本研究通过检测经程控降温液氮保存前后的富集造血干/祖细胞的外周血单个核细胞(PBMNC)的活性氧(ROS)水平及造血干/祖细胞归巢分子的表达,分析二者之间的相关性。以冻存PBMNC为实验组,以新分离PBMNC为对照组,通过台盼蓝染色方法检测2组细胞的存活率;通过流式细胞分析法检测2组细胞ROS水平;通过流式细胞分析法检测造血干/祖细胞表面抗原CD34、CD133以及归巢相关分子VLA4、CXCR4、CD44的表达;通过相关系数分析ROS水平与归巢分子表达之间的相关性。结果表明:PBMNC随冻存时间延长存活率逐渐降低,冻存3、6、9、12个月的细胞存活率比冻前显著降低(P<0.05);造血干/祖细胞表面标志性抗原CD34、CD133及归巢相关分子CD44、VLA4、CXCR4表达率随冻存时间的延长有所下降,冷冻保存1年后的表达率比冻存前显著降低(P<0.05);随着冷冻保存时间的延长,细胞内ROS水平逐渐升高,冻存6、9、12个月后细胞内ROS水平比冻存前显著升高(P<0.05)。PBMNC内ROS水平与造血干/祖细胞CD34+VLA4+、CD34+CXCR4+、CD34+CD44+双阳性表达率均呈负相关(相关系数分别为-0.503、-0.457、-0.465)。结论:造血干/祖细胞的归巢黏附分子表达随冻存时间延长而逐渐下降;冻存的PBMNC中的ROS水平与造血干/祖细胞归巢黏附分子表达率成显著负相关;ROS水平增高可能是冻存外周血造血干/祖细胞归巢功能降低的原因之一。     

Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy

BACKGROUND: Regenerative stem cell therapy (SCT) is currently being tested in clinical trials. The ideal type and source of cells have not yet been defined. Lineage (Lin) depletion is an experimental procedure capable of enriching all recently recognized SC types with regenerative potency. This study was performed to define a practicable monoclonal antibody (MoAb) cocktail for Lin depletion and to test whether clinical-scale Lin depletion is possible. STUDY DESIGN AND METHODS: MoAbs (CD2/14/15/19/41/56/glycophorin A) were selected to mark seven mature hematopoietic lineages. Lin7-negative (Lin7NEG) cells were analyzed in peripheral blood (PB, n = 9), mobilized PB (MPB, n = 5), umbilical cord blood (UCB, n = 5), and marrow aspirates (BM, n = 4) by flow cytometry. Preclinical Lin depletion was tested with leukapheresis products from PB following good manufacturing practice (GMP) principles. RESULTS: Lin7NEG cells comprised 0.23 +/- 0.04, 0.27 +/- 0.03, 0.53 +/- 0.07, and 0.49 +/- 0.03 percent of PB, MPB, UCB, and BM, respectively. Basophils, CD34+, and dendritic cells constituted the major Lin7NEG subpopulations (84 +/- 2, 90 +/- 3, 40 +/- 3, and 80 +/- 3% in PB, MPB, UCB, and BM, respectively). Minor populations included CD7- and CD45- cells. Preclinical CD2/14/15/19/56 (Lin5) depletion after automated red blood cell and platelet reduction resulted in up to a 16.7-fold enrichment of CD34+ and CD34-/Lin5NEG cells. CONCLUSIONS: A seven-MoAb cocktail is sufficient to label more than 99 percent of nucleated cells in PB, MPB, UCB, and BM. Preclinical Lin depletion can be performed under GMP conditions from PB apheresis procedures.