大鼠肝移植(LTx)急性排斥反应(AR)血清蛋白质组学分析

 
目的  探究肝移植(liver transplantation,LTx)急性排斥反应(acute rejection,AR)血清蛋白质组学的变化,寻找与排斥反应相关的血清标志物。方法  建立Lewis→BN大鼠肝移植模型,以BN→BN大鼠肝移植为对照组,根据肝移植物AR的反应程度进行分组,取各组大鼠血清样本进行二维双向凝胶电泳(two dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)及质谱(mass spectrometry,MS)分析,鉴定表达有差异的蛋白质。结果  肝移植模型大鼠分为无排斥、轻度、中度和重度排斥4组,2D DIGE共发现30个蛋白斑点,用MS分析排除重复蛋白斑点之后鉴定出14个蛋白质,根据功能可分为4类。第1类为与金属离子代谢相关的免疫调节蛋白,包括血红素结合蛋白、触珠蛋白前体、srprb Ba1-667和 preproapo A-I;第2类为先天性免疫相关的蛋白成分,包括补体C3、补体C4a、MBP-A、LOC500183蛋白和LOC299458蛋白;第3类为免疫调节多肽,包括T-kininogen 2、α-1巨球蛋白和大鼠α 1巨球蛋白受体结合域A链晶体结构;第4类为未分类蛋白,包括ORF2和rCG36664。结论  肝移植AR过程中血清多种蛋白质的含量发生改变,可能为重要的血清标志物。     

肾移植急性排斥反应早期诊断尿液蛋白质组学研究

目的 利用二维凝胶电泳和生物信息学技术,从严格筛选的2例肾移植术后发生急性排斥反应患者尿液标本中,寻找急性排斥反应早期标志物.方法 在pH值为4～7范围,采用Sypro-Ruby染色,对发生急性排斥反应过程的不同时间点(-3,-2,-1,7,14,21 d)的患者尿液二维凝胶电泳(Two-dimensional Gel Electrophoresis,2-DE)图谱进行比较,挑选了30个有上调或者下调趋势的蛋白点.将这些蛋白点进行切胶、胰酶消化后用MALDI-TOF-MS/MS分析.结果 得到了重复性好、分辨率高的肾移植术后尿蛋白2-DE图谱.30个差异蛋白点经质谱分析和数据库检索,鉴定了16个蛋白点,对应13种蛋白质.根据蛋白功能查询结果,发现了3个蛋白含量变化趋势与排斥反应密切相关的蛋白,分别是α-1抗胰凝乳蛋白酶(alpha-1-antichymotrypsin,AACT)、肿瘤排斥抗原gp96(tumor rejection antigen gp96)和锌-α2糖蛋白(Zn-Alpha-2-Glycoprotein).结论 肾移植术后发生急性排斥反应患者的不同时间点尿液2-DE图谱存在明显差异.AACT、肿瘤排斥抗原gp96和锌-α2糖蛋白可能作为临床诊断肾移植术后急性排斥反应的标志物候选蛋白.     

Impact of acute rejection episodes on long-term renal allograft survival

Objective To assess the impact of the number, and time of acute rejection (AR) and outcome of anti-rejection therapy on the long-term survival of renal allografts and the relative risk factors. Methods The Kaplan-Meier analysis and log-rank test were used to calculate the survival rates of patients and grafts in no acute rejection group (NAR, 895 patients), 1 rejection episode group (1AR, 183), 2 and more than 2 rejection episodes group (2AR, 17), acute rejection group ［AR (1AR+2AR), 200］, early acute rejection group (within 90 days after transplantation, EAR, 125), late acute rejection group (91 days later, LAR, 58), completely AR reversed group (CAR, 105), and incompletely AR reversed group (IAR, 68). The relative risk factors were analyzed by the Cox proportional hazards regression. Results The 5- and 10-year survival rates of renal allografts were 75.4% and 17.1% in AR and 93.2% and 86.5% in the NAR group (P<0.0001). The long-term graft survival was much lower in the 2AR group than in the NAR or 1AR groups (P<0.0001 and P=0.002, respectively). It was similar in either the NAR or CAR groups (P=0.31), but it was significantly lower (P<0.0001) in the IAR group. Multivariate Cox regression analysis revealed that the outcome of anti-rejection therapy is an important risk factor affecting the long-term survival of allografts. Conclusions AR is significantly associated with poor long-term survival of renal allografts. But the long-term graft survival of patients with one acute rejection but completely reversed is not significantly different from that of patients without acute rejection.     

转Bt基因大米与相应亲本大米差异蛋白质组学研究

目的：利用差异蛋白质组学及生物信息学等技术方法,探讨外源Bt基因的导入对大米表达蛋白质组的影响,深化转基因大米在蛋白质组学方面的研究。方法在转基因大米“华恢1号”和亲本大米“明恢63”样品中提取大米总蛋白,通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）实验方法,得到相应的蛋白质组2D-PAGE谱,再选择差异明显的蛋白质点进行质谱鉴定及生物信息学分析。结果对转Bt（cry1Ab/1Ac）基因大米和亲本大米2D-PAGE图谱的蛋白质点进行了对比匹配,识别出明显的差异蛋白质点28个,以亲本大米为参照,转Bt基因大米相对高表达的18个,相对低表达的10个;选择转基因大米凝胶上的差异蛋白质点进行了质谱鉴定和生物信息学检索,发现差异蛋白质主要参与能量代谢,蛋白质合成、氧化还原和应激响应等生物过程。结论转Bt基因“华恢1号”及其亲本大米“明恢63”表达的蛋白质组存在一定差异,但未发现这些差异蛋白质具有抗营养性和致敏性,也未发现新蛋白和毒蛋白的表达。     

液质联用法测定人血浆中罗红霉素及其生物等效性研究

目的：建立人血浆中罗红霉素高效液相色谱-质谱联用测定法（HPLC-MS）,研究罗红霉素胶囊的生物等效性。方法：采用双交叉试验设计,血样用乙酸乙酯-异丙醇（95：5）混合液提取,HPLC-MS分离测定,根据血药浓度-时间数据估算主要药动学参数和相对生物利用度,评价生物等效性。结果：罗红霉素两制剂的t1/2分别为（9.2±3.7）和（9.3±4.0）h,Tmax分别为（2.1±0.6）和（2.1±0.8）h,Cmax分别为（11823.0±3157.0）和（11856.0±2970.0）ng/ml,AUC0-t分别为（148800.0±42312.0）和（136443.0±39653.0）ng·h/ml。AUC0-∞分别为（162808.0±48977.0）和（149650.0±48077.0）ng·h/ml。受试制剂的相对生物利用度为（111.2±22.9）%。受试制剂AUC0-t和Cmax的90%置信区间为参比制剂相应参数的100.9%～117.8%和91.3%～107.4%,符合生物等效性指导原则。结论：本法简便,灵敏准确。罗红霉素两制剂生物等效。     

反向高效液相色谱测定法同时测定人血浆中5种镇静催眠药浓度

目的：建立人血浆中地西泮、硝西泮、奥沙西泮、艾司唑仑和阿普唑仑的反向高效液相色谱测定法（RP-HPLC）。方法：以血浆为基质,配制含有5种镇静催眠药的混合标准品,取1 mL样品加入50 mg/L卡马西平10 μL为内标,乙酸乙酯萃取后用100 μL流动相溶解,进样20 μL,通过高效液相色谱仪检测人血浆基质中5种镇静催眠药浓度。色谱条件：色谱柱为C18柱（4.6 mm×250 mm）,柱温30 ℃,流动相为甲醇:水（65∶35）,流速1.0 mL/min,紫外检测波长为230 nm。结果：地西泮、硝西泮、奥沙西泮、艾司唑仑和阿普唑仑在5～1 200 μg/L 范围内线性关系良好(r≥0.9966, P<0.05) ,加样回收率在95.5%~105.6%,萃取回收率均在75%以上,日内及日间变异相对标准偏差(RSD)均小于10%（n=5）。 结论：RP-HPLC方法简便、准确、灵敏,适用于人血浆中地西泮、硝西泮、奥沙西泮、艾司唑仑和阿普唑仑的血药浓度的同时检测。     

IL-17在小鼠肾移植急性排斥反应早期诊断中的作用

目的:研究Th17细胞及相关因子白细胞介素17 (IL-17)在小鼠肾移植排斥反应中的表达及意义.方法:建立小鼠肾移植模型,实验动物随机分为同系移植组和急性排斥反应组;在移植术后3,7d分别应用ELISA检测2组小鼠血清中IFN-γ和IL-17的含量,应用流式细胞技术检测移植肾中浸润淋巴细胞中Th1和Th17细胞数量,取移植肾经10％甲醛固定后行常规病理检查.结果:与同系移植组相比,急性排斥反应组术后第3天血清IFN-γ含量无明显差异而II-17含量显著增高(P＜0.05),术后第7天血清IFN-γ和IL-17含量均显著增高(P＜0.05);急性排斥反应组中血清IFN-γ和IL-17含量术后第7天较第3天均显著增高(P＜0.05);急性排斥反应组移植肾中浸润淋巴细胞中Th1与Th17细胞比例在术后第3天及第7天较同系移植组均明显增多(P＜0.05);急性排斥反应组中移植肾中浸润淋巴细胞中Th1与Th17细胞比例术后第7天明显高于第3天(P＜0.05);病理组织学检查急性排斥反应组随着移植时间的延长,排斥反应逐渐增强.结论:Th17细胞在肾移植排斥反应的发生发展中可能起着非常重要的作用,对受体血清中细胞因子IL-17的检测可作为急性排斥反应早期诊断的预见性和特异性指标.     

Daclizumab prevents acute renal allograft rejection. 1 year analysis

Objective To investigate the clinical effect of Daclizumab on preventing acute rejection in renal transplant recipients.Methods71 patients were randomly divided into two groupsDaclizumab group (n =26) and control group (n = 45). Baseline regimen of mycophenolate mofetil (MMF), cyclosporin (CsA), methylprednisolone (MPD) and prednisone (Pred) were administered to all patients. The treatment of Daclizumab was based on baseline regimen. The Daclizumab group received Daclizumab twice before and after renal transplant. The occurrence of post-transplantation acute rejection, renal function and T lymphocyte subtypes were sequentially monitored; meanwhile adverse events, infection episode, and patient and graft survival were observed.All of patients received a follow-up of 12 months at least. Results The occurrence of acute rejection in Daclizumab group in 1,3, 6 and 12 months after renal transplantation was 7.7%, 19.2%, 23.1% and 30.8%, respectively,while it was 15.6% ,28.9%,35.6% and 46.7% in the control group. There was significant difference between the two group(P ＜ 0.05). There was no difference in infection episodes and adverse events between the Daclizumab group and control group. One year patient survival was 92.3% in Daclizumab group, 91.1% in control group (P ＞ 0.05), compared with graft survival of 96.2 % and 93.3 % for Daclizumab and control group, respectively (P ＞ 0. 05). The renal function in Daclizumab group in 1, 6 and 12 months after renal transplantation was better than that in control group (P ＜ 0.05). The CD3 and CD4 subtypes decreased in both two groups after operation but no significant difference (P ＞ 0.05). ConclusionDaclizumab combined with MMF, CsA, MPD and Pred therapeutic regimen was effective to reduce the occurrence of acute rejection in renal transplant recipients and have no influence on T lymphocyte subtypes.     

IL-17在小鼠肾移植急性排斥反应早期诊断中的作用

目的:研究Th17细胞及相关因子白细胞介素17 (IL-17)在小鼠肾移植排斥反应中的表达及意义.方法:建立小鼠肾移植模型,实验动物随机分为同系移植组和急性排斥反应组;在移植术后3,7d分别应用ELISA检测2组小鼠血清中IFN-γ和IL-17的含量,应用流式细胞技术检测移植肾中浸润淋巴细胞中Th1和Th17细胞数量,...     

改良反相高效液相色谱法测定血清中异丙酚浓度

目的创建一种新型反相高效液相色谱-荧光法测定血清中异丙酚浓度,为临床上快速准确的监测异丙酚血药浓度提供科学实用的检测手段。方法应用20%高氯酸沉淀血清样品后,混匀离心取上清液50μL进样分析。分析柱为DiamonsilC18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-水(90∶10)(冰醋酸调pH=4.0),流速1.0mL/min,荧光激发波长为276nm,发射波长为310nm。柱温为室温。结果当测定浓度范围为0.05-10μg/mL时,异丙酚与内标麝香草酚的峰面积之比与浓度呈良好的线性关系(r=0.9975),最低检出浓度50ng/mL,日内与日间精密度在4.78-6.59之间,明显小于15%。结论改良反相高效液相色谱法测定人血清异丙酚浓度具有准确高效、灵敏快捷等特点,适用于科研和临床异丙酚血药浓度的监测。R     

鼻咽癌细胞系5-8F和6-10B的差异蛋白质组学研究

目的:比较不同转移潜能的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞系5-8F和6-10B细胞蛋白质组的差异,筛选NPC转移相关蛋白质.方法:应用二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术分离具有相同遗传背景、不同转移潜能的鼻咽癌细胞系5-8F和6-10B细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达的蛋白质,Western免疫印迹方法验证部分差异蛋白质在2株细胞中的表达水平.结果:建立了5-8F和6-10B细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了65个差异表达的蛋白质点,鉴定了15个非冗余的差异表达蛋白质.Western免疫印迹分析证实了差异蛋白质膜联蛋白A1和14-3-3 protein sigma在5-8F和6-10B细胞中的差异表达水平.结论:15个非冗余的差异表达蛋白质为研究NPC转移机制提供了实验依据.     

白细胞介素-17与Th17细胞在小鼠肾移植急性排斥反应中的表达及意义

目的研究Thl7细胞及相关因子白细胞介素17(IL-17)在小鼠肾移植排斥反应中的表达及意义。方法建立小鼠肾移植模型,实验动物随机分为同系移植组和急性排斥反应组,在移植术后3 d和7 d,分别应用酶联免疫吸附实验检测两组小鼠血清中IL-17含量,应用流式细胞术检测移植肾中浸润淋巴细胞中Th17细胞数量,取移植肾经10%福尔马林固定后行常规病理检查。结果与同系移植组相比,急性排斥反应组术后第3天及第7天血清中IL-17含量均升高(P<0.05),且术后第7天时IL-17含量明显高于第3天(P<0.05);急性排斥反应组移植肾中浸润淋巴细胞中Th17细胞比例在术后第3天及第7天较同系移植组均明显增多(P<0.05),且术后第7天时Th17细胞比例明显高于第3天(P<0.05);病理组织学检查急性排斥反应组随着移植时间的延长,排斥反应逐渐增强。结论 Thl7细胞在肾移植排斥反应发生发展中可能起着非常重要的作用,对移植脏器中IL-17的检测可作为急性排斥反应早期诊断的预见性和特异性指标。     

急性移植肾排斥反应类固醇冲击治疗后淋巴细胞凋亡的作用

目的: 探讨在初始类固醇冲击治疗后急性肾移植排斥反应中浸润淋巴细胞的凋亡情况. 方法: 64例发生急性细胞性排斥反应的患者的肾活检标本,活检均于类固醇冲击治疗后3 d进行. 检测活检标本的细胞凋亡并与40例有淋巴细胞浸润的非特异肾损伤标本进行比较. 采用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡. 结果: 在急性排斥组(n=64)中有44例患者标本中观察到淋巴细胞凋亡,34例中观察到肾小管上皮细胞凋亡,20例中未检测到细胞凋亡. 对照组(n=40)中有24例检测到肾小管上皮细胞凋亡(P＝0.2351),淋巴细胞凋亡在4例患者中发现(P＝0.000). 根据Banff分类Ⅰ级排斥反应为16例,Ⅱ级为34例,Ⅲ级为14例,检测到淋巴细胞凋亡分别为:14例,22例和8例(P=0.1530). 结论: 在初始类固醇冲击治疗后急性肾移植排斥反应中浸润淋巴细胞凋亡是重要的,可能与排斥反应的转归有关.     

反相高效液相色谱法测定肾移植术后全血环孢素A浓度

目的建立单步萃取反相高效液相色谱法测定人全血中环孢素A（CsA）浓度。方法病人血样经乙醚单步萃取,环孢素D（CsD）为内标,C18色谱柱,乙腈-水（80：20）为流动相,流速1.0ml/min,柱温70℃,检测波长214nm。结果CsA全血浓度在50-600ng/ml范围内线性关系良好,r=0.9998,最低检测浓度为20ng/ml,平均回收率100.44%,日内和日间RSD均〈5%。结论本法简便灵敏、准确可靠、经济,可用于临床人体器官移植术后全血中CsA浓度的监测。     

肾移植急性排斥反应中的蛋白质组学研究初步探索

目的 探讨蛋白质组学在急性排斥反应(AR)发病机制研究中的应用.方法 应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)标记的定量蛋白质组学方法比较2008至2010年复旦大学附属中山医院肾移植术后5例发生AR和8例肾功能稳定患者的血浆蛋白谱.结果 比较两组患者血浆蛋白谱,发现了179个差异表达的蛋白;其中有66个蛋白表达差异在2倍以上.MetaCore软件分析结果显示差异蛋白主要参与炎症反应、补体激活等病程,符合AR的免疫排斥病程;并且蛋白组学结果提示AR患者存在高凝状态.转录调控网络分析发现AR中有多个转录因子包括核因子-κB、信号转录和激活因子( STAT)1、STAT3及它们之间的交联对话在AR和凝血系统激活中起到重要作用.结论 蛋白组学分析为AR的机制研究提供一种新的研究策略.     

糖尿病肾病大鼠血浆差异表达蛋白的质谱分析

目的 探讨应用比较蛋白质组学分析糖尿病肾病大鼠血浆的差异表达蛋白,寻找和糖尿病肾病发生相关的蛋白质.方法 建立糖尿病肾病(DN)大鼠模型,将DN模型组和正常组大鼠血浆采用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离血浆蛋白,经PD-Quest软件分析结合人工对比确认差异蛋白点,MALDI-TOF/TOF鉴定差异表达的蛋白. 结果 成功建立2-DE血浆蛋白图谱,经质谱鉴定出8种差异蛋白,这些差异蛋白主要与氧化应激、炎症反应及脂质代谢紊乱等相关. 结论 双向电泳质谱技术可有效筛选糖尿病肾病相关蛋白,为进一步早期诊断提供依据.     

人类脑脊液的蛋白质组学研究

脑脊液成分的改变可精确地反映疾病的病理过程。蛋白质组学研究方法的出现为分析脑脊液的蛋白质组成提供了一个很好的平台。文章综述了用于脑脊液蛋白质组学分析的方法,以及利用这些方法对脑脊液蛋白质组成进行研究的进展,包括脑脊液样本的准备、二维凝胶电泳、质谱分析技术、蛋白质组学的生物信息学、脑脊液的比较蛋白质组学、脑脊液的功能蛋白质组学等。