以PGA为三维支架同种异体工程化软骨的构建

为探讨以聚羟基乙酸（PGA）为三维支架材料的同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨的能力,采用胶原酶消化方法分离乳兔肋软骨获取种子细胞,收集体外培养传2-3代的软骨细胞,接种于经多聚赖氨酸处理的PGA支架材料上,将细胞-材料复合物种植在成兔皮下,一定时间取材,对获得的同种异体工程化软骨进行组织学评价。结果显示,软骨细胞体外培养1天后,在PGA支架上分布均匀;培养1周左右,PGA纤维间有呈蜘蛛网状基质产生。种植复合物4周取材可见PGA纤维未完全降解,软骨细胞不成熟,周边存在一定程度炎细胞浸润;8周取材,PGA纤维消失,软骨基本成熟,炎细胞浸润不明显。软骨基质含量丰富,分布与正常肋软骨组织学特征相似,提示以PGA为支架材料同种异体软骨细胞在有免疫力的动物体内可形成工程化软骨,无明显免疫排斥反应。     

组织工程重建兔颞下颌关节盘软骨

目的 应用组织工程学方法重建颞下颌关节盘软骨。方法 分离6只日本大耳白兔髁状突软骨细胞。进行细胞的微载体大规模扩增,将扩增后的软骨细胞接种于组织引导再生胶原膜,体外适当培养后植入4只同种成年兔皮下,植入后12周,对所获组织进行组织形态学观察。结果 髁状[突软骨细胞在胶原膜内生长良好,植入动物体内12周后可形成乳白色类软骨样组织,其表面光滑,有弹性。甲苯胺蓝染色,细胞周围基质呈异染性。结论 应用胶原膜结合软骨细胞共同培养,可形成软骨样组织,该方法将有可能成为软骨缺损及关节盘破损修复的有途径。     

聚乙醇酸负载同种异体软骨细胞移植修复兔关节软骨缺损

目的：应用聚乙醇酸（ＰＧＡ）负载的兔软骨细胞培养移植修复同种异体关节软骨缺损．方法：应用在生物体内可降解吸收、纤维状多孔态的ＰＧＡ作为支架行兔软骨细胞培养．培养１４天后，软骨细胞在ＰＧＡ提供的三维空间中大量分裂、增殖并合成大量软骨基质，形成ＰＧＡ－软骨细胞复合体，然后利用该复合体移植修复同种异体兔膝关节全层软骨缺损，对侧膝关节作对照．术后行大体、组织学、电镜动态观察及修复组织厚度测定．结果：ＰＧＡ在术后８周完全降解吸收，实验侧与对照侧修复组织的厚度有显著性差异（Ｐ＜０．０１）；术后１６周在实验侧可见典型的软骨组织，电镜下为成熟的软骨细胞，而对照侧为纤维组织修复．结论：应用ＰＧＡ－软骨细胞复合体移植，可修复同种异体的兔关节软骨缺损，为临床治疗关节软骨缺损奠定了基础．     

同种异体软骨细胞/聚乳酸复合物即时修复兔耳廓软骨缺损

 目的观察用同种异体软骨细胞/聚乳酸(Poly-DL-lactide,PDLLA)复合物在体内即时修复软骨缺损的能力.方法将兔耳廓软骨细胞体外分离消化,以PDLLA为支架,用软骨细胞/PDLLA复合物即时移植修复兔耳廓软骨缺损,对照组采用PDLLA,6、12、18周后观察软骨缺损修复情况.结果实验组移植后18周,软骨缺损愈合,修复软骨厚度均匀.对照组缺损区为条索状纤维组织修复,中央部凹陷.结论同种异体软骨细胞/PDLLA复合物即时修复软骨缺损是一种非常有前途的且适合临床应用的组织工程学方法.     

转胰岛素样生长因子-Ⅰ基因软骨细胞体内构建组织工程软骨

目的探讨转胰岛素样生长因子-Ⅰ(insu lin like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ)基因软骨细胞与交联透明质酸复合后在裸鼠体内形成组织工程软骨的能力。方法分离培养人关节软骨细胞,将IGF-Ⅰ基因转染人关节软骨细胞,转基因细胞(转染组)、未转基因的软骨细胞(对照组)分别与交联透明质酸材料在体外孵育2 d后,移植裸鼠皮下。移植后6周,取出裸鼠皮下新生组织进行大体形态学观察(HE染色、阿尔新蓝染色),逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测新生组织中Ⅰ型、Ⅱ型前胶原和IGF-Ⅰ基因mRNA的表达,判断裸鼠体内新生组织的结构和功能。结果转染组裸鼠体内新生组织6周仍能表达IGF-ⅠmRNA,而对照组不能;转染组和对照组在6周后均能形成软骨组织陷窝,但对照组的陷窝数量明显低于转染组;转染组的Ⅱ型前胶原mRNA的相对表达量为1.204±0.139,高于对照组(P<0.05);Ⅰ型前胶原mRNA的相对表达量为0.069±0.019,低于对照组(P<0.01)。结论转IGF-Ⅰ基因软骨细胞与交联透明质酸在体内能构建出软骨样组织,其结构更接近于自然软骨。     

采用温敏性壳聚糖水凝胶体外构建组织工程化软骨的实验研究

目的 验证自行制备的温敏性壳聚糖水凝胶作为软骨细胞支架材料构建组织工程化软骨的可行性.方法 以壳聚糖、β-甘油磷酸钠和羟乙基纤维素为原料,制备温敏性壳聚糖水凝胶,通过SD大鼠肌内注射植入,进行组织相容性检测.在此基础上,将其与软骨细胞复合构建组织工程化软骨,观察软骨细胞在壳聚糖水凝胶中的存活情况,并于体外培养3周后,作相关组织形态学检测.结果 制备的壳聚糖水凝胶具有温度敏感性,即室温时为液态,37℃时10～15min可发生交联反应成为固态凝胶.SD大鼠肌内注射不同时间点组织相容性检测表明,该材料具有良好的组织相容性,植入体内2、4周时有少量炎性细胞浸润,6周时材料降解明显,8周时已经基本降解.采用该材料构建的组织工程化软骨体外培养3周后取材,通过组织学检查,HE染色可观察到软骨陷窝样结构,甲苯胺蓝染色、番红O染色及免疫组化染色结果显示软骨细胞具有分泌细胞外基质的功能.结论 本研究自行制备的温敏性壳聚糖水凝胶材料具有良好的组织相容性,将其与软骨细胞复合后,可以在体外再造组织工程化软骨,是一种有广泛应用前景的软骨组织工程支架材料.     

以藻酸钙为载体的可注射软骨

取新西兰兔双侧耳软骨,用酶消化法获取软骨细胞,将细胞与藻酸钠溶液混悬,加入2.5%的氯化钙溶液,制备成藻酸钙／细胞复合物。在复合物固化前,用注射器注入裸鼠背部皮下,分别于6、12周取材进行大体和组织学观察,以探讨藻酸钙作为软骨组织工程载体的可行性。结果显示：取材时标本质地较注射时明显变硬,组织学观察显示软骨细胞位于类似正常软骨组织的陷窝中,陷窝周围有碱性基质沉积,番红－O及Masson三色法染色阳性,证实有氨基葡聚糖和胶原的合成,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,而对照组没有软骨样组织形成。说明藻酸钙在裸鼠体内可以为软骨细胞提供良好的存活环境,软骨细胞在其中生长良好,并可合成分泌细胞外基质,形成软骨样组织。     

同种异体关节软骨细胞分离体外培养再移植修复关节软骨缺损实验研究

目的关节软骨一旦缺损，其修复能力有限。本实验通过移植同种异体兔软骨细胞，修复关节软骨缺损。方法软骨细胞取自出生后３周雄性新西兰幼兔，体外培养，移植于成年雌性新西兰兔膝关节。股骨内髁缺损区为移植细胞组，左股骨外髁缺损为移植胶原凝胶组，右股骨外缺损为空白对照组。术后所有动物不加外固定任意自由活动，于术后４，８，１２周处死，进行肉眼、组织学、透射电镜观察，标本用带有Ｙ染色体的Ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ－ｒｅｇｉｏｎ－Ｙ（ＳＲＹ）基因进行杂交。结果移植软骨细胞组术后股骨内髁缺损区得到修复，而移植胶原凝胶组和空白对照组术后股骨外髁缺损未得到修复。ＳＲＹ基因性别鉴定也证明了以上结果。结论关节软骨的缺损及骨性关节炎通过软骨细胞移植方法进行治疗，可再生出新的透明软骨。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对软骨细胞移植修复关节软骨缺损的作用

目的：观察胰岛素样生长因子－Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)对关节软骨缺损修复的作用。方法：采用组织工程方法制备骨基质明胶（BMG）－软骨细胞移植物。40只4－5个月龄的新西兰兔均分为软骨细胞实验组及软骨细胞对照组,BMG对照组,空白对照组。实验组兔膝关节注射IGF－Ⅰ,各对照组均注射等渗盐水。术后行大体,组织学观察及免疫组化检测。结果：实验组软骨细胞生长较快,术后24周修复的软骨组织Safranin-O染色,Ⅱ型胶原染色与正常关节软骨一致,软骨细胞呈柱状排列,软骨细胞对照组术后24周修复软骨组织Safranin-O染色较淡,部分软骨细胞呈柱状排列,BMG,空白对照组未修复。结论：IGF－Ⅰ能促进关节软骨缺损修复。     

异种异体半月板移植延缓关节软骨退行性变的研究

目的:探讨异种异体半月板移植对延缓关节软骨退变的作用。方法:对15只成年新西兰兔的后肢左、右膝均进行内侧半月板全切。在15只兔的左膝进行猪半月板组织成型后所得的异种异体内侧半月板移植,以其已切除内侧半月板的右膝作为对照。分别于术后6周、12周、24周择期处死动物,观察各组兔膝关节软骨的大体病理表现、组织病理Mankin评分改变,并用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原单克隆抗体免疫组织化学染色法观察关节软骨中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原的表达情况。结果:兔内侧半月板全切组膝内侧胫骨平台和内侧股骨髁软骨破坏严重,有大量骨赘形成,呈骨性关节炎表现。异种异体半月板移植在短期内对关节软骨具有明显保护作用,但随着术后24周移植半月板被破坏,关节软骨出现退变,但与同期的半月板切除膝相比,关节软骨退变较轻。结论:异种异体半月板移植短期内对关节软骨有保护作用;异种异体半月板移植可延缓关节软骨退行性变。     

成骨细胞接种于珊瑚-羟基磷灰石构建骨组织的研究

体外分离、培养、扩增兔成骨细胞 ,将收集的细胞接种于珊瑚 羟基磷灰石中 ,然后自体移植入兔背部肌肉组织内 ,同时植入未接种细胞的HA一块作为对照。术后 4、8周取材 ,通过组织学、扫描电镜观察新骨的形成情况。结果表明 ,培养的兔成骨细胞在珊瑚 羟基磷灰石表面生长良好。成骨细胞 /珊瑚 羟基磷灰石复合物植入兔背肌肉内 4周 ,局部形成骨样组织 ,8周时形成大量新骨组织。提示珊瑚 羟基磷灰石用于骨组织工程进行骨再造和骨缺损修复有很多优点 ,具有广阔的应用前景。     

培养人骨髓基质细胞接种多孔陶瓷再造骨组织

为探讨人骨髓基质细胞作为骨组织工程种子细胞的可行性，作者观察了体外培养的人骨髓基质细胞复合多孔珊瑚羟基磷灰石在体内的成骨能力。穿刺抽吸入髂骨区骨髓基质细胞，体外培养扩增、诱导后，与多孔珊瑚羟基磷灰石复合，植入裸鼠皮下。术后4、8周取材，通过组织学检查了解植入物体内成骨情况。结果显示，复合物在体内成骨活跃，说明人骨髓基质细胞可以作为骨组织工程的种子细胞，珊瑚羟基磷灰石可作为一种细胞种植基质材料。     

关节软骨修复细胞基因治疗中软骨细胞支架载体特点

目的 探讨四种不同类型三维支架中培养的关节软骨细胞活性状况及其转基因特性.方法 原代培养兔膝关节软骨细胞,并且以表达绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(GL3)的腺病毒载体AdGFP和AdGL3进行感染.在I型胶原海绵、纤维蛋白胶、透明质酸和聚乳酸四种类型的支架材料中,以荧光显微镜和荧光素酶分析法检测细胞的活性状况及其转基因特性;以阿辛蓝染色评价软骨基质的产生.结果 表达绿色荧光蛋白的腺病毒(AdGFP)成功感染兔关节软骨细胞,并且持续表达绿色荧光蛋白.被感染的软骨细胞在所有被测试的细胞支架上均能存活,并能表达GFP和荧光素酶报告基因.与其余三种支架比较,聚乳酸支架中转基凶表达率最高(P<0.01).而且聚乳酸培养体系中,4周时可以检测到阿辛蓝染色阳性的基质材料.结论 在关节软骨修复的细胞基因治疗领域,聚乳酸可能是一种合适的支架材料.     

海藻酸钙膜对兔胫骨骨缺损的修复作用

目的 探讨海藻酸钙膜（calcium alginate film, CAF）在骨创伤或骨缺损应用中的组织学特点。方法 以家兔为研究对象，在其双侧胫骨形成洞形骨缺损，实验侧骨缺损上覆盖CAF，对照侧覆盖胶原膜或不覆盖任何膜，分层缝合，随诊饲养。分别在术后1，2，4，6，8周时取出胫骨，进行大体观察、组织切片观察以及行骨形态发生蛋白（BMP）、骨钙素和血管内皮生长因子（VEGF）免疫组织化学染色后，对此3种骨诱导因子含量进行测定。结果 CAF4～6周吸收，胶原膜6～8周吸收；前者巨噬细胞反应程度轻，后者反应程度重；前者大体观骨缺损愈合表面平整，后者表面不连续或有突起，系由过量肉芽组织过渡而来；术后4周内实验侧BMP、骨钙素、VEGF总体含量明显高于对照侧（P〈0．01）。结论 CAF在骨创伤中应用效果好，能更快地促进骨缺损的愈合，异物反应过程短、程度轻，早期骨诱导因子的富集作用强。     

骨髓基质成骨细胞-松质骨基质复合人工骨肌袋移植的成骨作用

成年新西兰兔骨髓细胞体外培养、诱导后 ,经混匀、接种、固化形成骨髓基质成骨细胞 藻酸盐 松质骨基质复合人工骨 ,并植回取材兔肌袋内 ,对照组分别植入藻酸盐 松质骨基质复合物和松质骨基质。植入 4、8周取材 ,行X线摄片、组织学检查 ,观察骨形成情况。结果显示 ,骨髓基质成骨细胞 松质骨基质复合人工骨肌袋内成骨效果明显优于藻酸盐 松质骨基质复合物组和松质骨基质组。复合人工骨标本兼有膜内成骨和软骨成骨 ,以膜内成骨为主 ;对照组仅见少量软骨成骨。提示 ,采用组织工程方法形成的复合人工骨肌袋内成骨作用明显 ,用该方法所形成的组织工程骨展现出良好的应用前景。     

复合新型骨基质材料体内外成骨能力的组织工程研究

为评价一种新型无机－有机复合骨基质材料（new bone-martrix material,NBM)的体内外成骨能力，取骨髓基质干细胞来源的成骨细胞与材料进行体外复合培养，复合体再行肌内植入，通过相差显微镜，扫描电镜以及组织学观察体内外成骨情况。结果发现，体外培养时成骨细胞与材料可发生良好的粘附、增殖、并分泌大量细胞外基质成分，而细胞－材料复合体肌内植入后4周可见大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，8周仍未见新生骨组织生成。作者认为NBM的这种体内外成骨能力的差异可能与NBM具有免疫原性，引起宿主免疫反应，从而丧失体内成骨环境有关。     

骨膜包绕肌腱松质骨粒与BMP复合体替代月骨的实验研究

目的　探讨自体骨膜包绕肌腱松质骨粒与BMP形成复合体替代月骨治疗Kienbock病的可行性。方法　 4 2只日本大耳白兔随机分为 2组 ,A组取兔胫骨上段骨膜包绕部分髌腱、松质骨粒与BMP组成复合体 ,B组以骨膜包绕髌腱复合体作为对照 ,将两组复合体分别置于兔膝关节髌上囊(此环境类似于人体替代月骨后的生理环境 ) ,术后 1、2、4、8、1 2、1 6、2 4周取标本进行放射学、光镜及电镜检查 ,并对复合体CT值进行统计学分析。结果　A组复合体在骨膜及BMP/松质骨粒缓释系统双重诱导下 ,2周即有新生骨出现 ,8周形成表面光滑、外周为完整骨包壳中心为骨髓细胞的类圆形骨性团块 ,2 4周复合体无退变吸收。B组复合体 2 4周内无骨团块形成 ,A、B组复合体CT值在不同时间段差异均有统计学意义 (P <0 0 1 )。结论　自体骨膜包绕肌腱松质骨粒与BMP复合体成骨时间早、成骨完全 ,并具有适宜的可塑性 ,为临床应用提供了必要的实验依据     

以PLGA为支架的组织工程脂肪的实验研究

目的：研究以PLGA为支架材料形成的组织工程脂肪作为软组织填充材料的可行性。方法：实验组：取兔的脂肪间充质干细胞，行体外扩增培养至第3代，达到一定数量后成脂诱导1周，接种于PLGA支架上，继续诱导1周，置于兔背部肩胛骨两侧皮下，分别于4、8周从大体和组织学方面观察脂肪形成情况；对照组：单纯以未接种细胞的支架移植于兔背部肩胛骨两侧皮下，于相同时间点进行检测。结果：实验组植入4周后，该复合物在支架中有脂肪形成，并可见细胞突入支架材料中；8周后支架材料继续降解，脂肪组织形成明显，伴有少量血管长入。对照组支架材料逐渐崩解，未见脂肪组织形成。结论：以PLGA为支架材料形成的组织工程脂肪作为软组织填充材料提供了一个好的思路。     

bBMP对体外培养人胎儿关节软骨细胞分化的促进作用

为了解运动创伤中肌肉、肌腱、关节囊中异位化骨的机制及软骨细胞在此过程中所起的作用，本研究用牛骨形态发生蛋白（ｂＢＭＰ）诱导体外不传代培养的胎儿关节软骨细胞，发现：在ｂＢＭＰ的诱导下，不传代培养的软骨细胞逐渐变为成骨细胞样形态，它们表达的碱性磷酸酶明显增加，细胞周围的钙沉积和基质沉积也明显增加。在ｂＢＭＰ的诱导下，关节软骨细胞开始表达具有成骨细胞特异性和骨基质特异性的骨钙素。这些结果表明，在ｂＢＭＰ的诱导下，胎儿关节软骨细胞已开始表达成骨细胞表型，并向成骨细胞样细胞方向分化。本研究提示，在异位化骨和各种软骨内化骨过程中，软骨细胞可能具有较活跃的参与骨形成的作用，可能不像以前所假设的那样仅分化为肥大软骨细胞，然后变性，最终坏死。