大鼠胰腺间质细胞体外培养过程及其形态学特征

目的:对胰腺间质细胞进行原代及传代培养,观察其形态学的变化。以探索一种简单稳定的获取及培养胰腺间质细胞的方法。方法:用机械剪切加胰蛋白酶消化的方法制备SD大鼠胰腺单细胞悬液,取新生SD大鼠1只麻醉断髓处死,体积分数0.75的乙醇浸泡消毒,无菌条件下取出胰腺组织,去除红细胞,剪切,加入胰蛋白酶消化,消化终止后细胞筛过滤,收集滤过的细胞悬液离心,弃上清液,重复1次。收集获得的单个胰腺间质细胞。接种于含体积分数0.1的胎牛血清、0.05g/L的亚胺培南的DMEM/F-12(1∶1)培养基,培养48h后换液,弃上清及悬浮细胞,继续培养48h后,换用含1×10-5mol/L阿糖胞苷的完全培养基培养24h,再换正常培养基继续培养,在培养细胞达到80%～90%的细胞汇合时,按1∶3进行传代培养。测定细胞生长曲线及贴壁率,原代细胞及传代细胞用双硫腙染色,鉴定有无胰腺β细胞。结果:①原代细胞及传代细胞形态学观察:原代培养换液前,显微镜下可见细胞大小不等,悬浮,有较多细胞碎片。48h首次全量换液后,悬浮细胞减少,经3次换液可基本去除。加用阿糖胞苷培养24h,大量细胞相继死亡。至第10-14天,培养细胞明显增加,基本铺满瓶底,以星形、梭形为主,细胞呈放射状或漩涡状生长,部分区域呈灶状。传至第5代细胞出现老化。②细胞生长曲线:细胞从传代后第2天,数量即开始增加,第4天增加幅度最大,至第6天细胞数量最大,以后数量略有下降。传代培养对数增殖期为2-4d,对数增殖期结束后,第6天细胞生长缓慢,进入平台期。③细胞的贴壁率:传代细胞培养2h已有部分细胞贴壁;培养4h贴壁细胞接近50%;培养10h贴壁达79%;培养12h细胞全部贴壁,而且部分细胞开始分裂增殖,细胞形态与原代细胞基本相似。④胰腺β细胞的化学鉴定:对胰腺组织分离所得单个细胞、原代培养细胞及传代培养细胞分别用双硫腙染色。培养前细胞染色,可见少量腥红色细胞,随着培养时间延长腥红色细胞逐渐减少,在原代培养10～14d,腥红色细胞消失,传代培养细胞染色未见腥红色细胞。结论:细胞培养12h全部贴壁,传代培养对数增殖期为2-4d,第6天细胞进入平台期。原代培养胰腺间质细胞形态多样,主要呈梭形,少数呈三角形或星形,贴壁爬行生长,第1周增殖较慢,随后增殖加速,细胞团块多见,偶可见大的圆形细胞生长,核大,胞浆内颗粒多。传代培养,细胞能迅速贴壁生长,细胞形态逐渐均一,主要为梭形、三角形细胞,呈集落样生长,双硫腙染色阴性;但细胞培养至第5代,胞浆颗粒增多,细胞增殖减慢,大部分细胞逐渐老化死亡。     

酶消化法获得成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞的体外原代培养及其特征鉴定术

目的：建立成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞的原代培养方法，为进一步观察其电生理特性提供目标细胞。方法：实验于2005-04／08在第三军医大学第一附属医院中心实验室完成。①细胞提取：取1～2个月龄成年豚鼠2只，雌雄不限。麻醉状态下处死，下腹部10g/L碘伏消毒后，即刻由腹部正中切15、于膀胱颈处取出膀胱，于解剖显微镜下仔细剔除膀胱外膜，纵行剖开膀胱、去除膀胱黏膜，将膀胱肌层置入含双抗的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10min。将上述处理的肌层组织剪成1mm^3小块，在含双抗的磷酸盐缓冲溶液中漂洗2次；换入10g/L胶原酶P溶液，盖紧瓶盖，置入37℃培养箱中消化30min，完全消化溶解后，移入离心管中离心。②细胞培养：细胞沉淀中加入新鲜配制的达尔伯克（氏）改良培养基溶液（含体积分数为0．1的胎牛血清），吹打后按每瓶（容积25mL）含（25-30）&;#215;10^4活细胞接种在培养瓶内，37℃，体积分数为0．05的CO2孵箱内静置培养；细胞接种第2天，可见胞体为梭形并有两个细胞突起的细胞贴壁，平滑肌细胞尚未贴壁。将未贴壁的平滑肌细胞转移至另一培养瓶，孵箱内静置3d后，可见平滑肌细胞贴壁。③培养细胞的观察与鉴定：采用相差显微镜观察和免疫细胞化学方法鉴定。结果：①体外培养第2天可见胞体为梭形且胞体两极有两个细长突起的细胞贴壁，该类细胞酪氨酸蛋白激酶受体免疫细胞化学染色阳性，平滑肌肌动蛋白染色阴性，确认为豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞。②逼尿肌细胞3d后贴壁，呈成纤维形生长，平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学染色阳性，酪氨酸蛋白激酶受体染色阴性：结论：用酶消化法可获得成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞，并在体外条件下生长，可用于卡哈尔间质细胞样细胞的电生理特性观察。     

SD大鼠角朊细胞体外培养的实验

目的：观察SD大鼠角朊细胞在体外培养的生长特性。方法：采用dispase酶消化法从SD大鼠仔鼠皮肤获得角朊细胞，在体外进行培养并传代，采用倒置显微镜和MTT法观察细胞的形态学变化和生长曲线。结果：通过酶消化法可以获得较纯的角朊细胞，原代培养10d细胞即可以达到融合，传代后细胞部分发生变性，呈成纤维细胞样，传代次数高，成纤维样细胞比例也相应增高。结论：SD大鼠角朊细胞可以在体外培养分裂增殖，但传代后即发生变性。     

小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法的建立

背景:组织块培养睾丸生殖细胞对污染不容易控制,胰蛋白酶消化接种培养睾丸生殖细胞可能损伤细胞.目的:建立一种切实可行的小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法.方法:小鼠睾丸间质细胞的分离采用胶原酶消化法,纯化采用Percoll 等密度梯度离心法,活率鉴定采用锥虫蓝拒染法,纯度鉴定采用3.-羟基固醇脱氢酶染色方法.结果与结论:小鼠睾丸间质细胞纯度达可达90%以上;体外培养的细胞形态完整、增殖速度快、贴壁生长状态良好.说明实验成功建立了小鼠睾丸间质细胞的体外原代培养模型.     

小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法的建立

背景：组织块培养睾丸生殖细胞对污染不容易控制,胰蛋白酶消化接种培养睾丸生殖细胞可能损伤细胞。目的：建立一种切实可行的小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法。方法：小鼠睾丸间质细胞的分离采用胶原酶消化法,纯化采用Percoll等密度梯度离心法,活率鉴定采用锥虫蓝拒染法,纯度鉴定采用3β-羟基固醇脱氢酶染色方法。结果与结论：小鼠睾丸间质细胞纯度达可达90%以上;体外培养的细胞形态完整、增殖速度快、贴壁生长状态良好。说明实验成功建立了小鼠睾丸间质细胞的体外原代培养模型。     

兔气管纤毛上皮细胞原代培养的生物学特性及其体外生长规律

目的：建立兔气管纤毛上皮细胞原代培养模型，观察其体外培养条件下的生物学特性并确定其体外生长规律。方法：实验于2005-03／07在解放军第四军医大学唐都中心实验室完成。①纤毛上皮细胞提取及培养：日本大耳兔20只，利用酶消化法分离获取兔气管纤毛上皮细胞，无血清生长因子培养基（成分：DMEM：Ham＇sF12为1：1，并加入以下激素及生长因子：10mg／L胰岛素、5mg／L转铁蛋白、20μg／L甲状腺素、0．4mg／L氢化可的松、7．5mg／L内皮细胞生长支持物、25μg／L表皮生长因子、1mmol／L-谷氨酰胺，100IU／mL青霉素，50mg／L链霉素）体外培养。②细胞纯度及鉴定：用抗角蛋白单克隆抗体进行SP法免疫细胞化学反应，二氨基联苯胺显色阳性为上皮细胞。扫描电镜观察细胞表面结构。结果：①气管上皮细胞的分离：酶低温消化加刷洗法获得的气管上皮细胞数量较多，呈圆形，较大，悬浮旋转。②气管上皮细胞生长状态和形态特征：套皿接种细胞24h后，贴壁率约为60％，细胞增大，并进入分裂相。五六天后细胞增殖旺盛，部分无纤毛上皮细胞汇合呈多角形铺路石样相嵌生长，在相差显微镜下放大200～400倍清晰可见纤毛呈海葵样向心摆动活跃，第3周纤毛逐渐消失成遗迹，细胞凋亡。③纤毛细胞的电镜观察：可见纤毛由细胞顶膜伸出，大部分集结成束，除纤毛外，还有稠密的较细短的微绒毛由细胞顶膜伸出。④气道上皮细胞的免疫细胞化学鉴定：抗角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色阳性，细胞达（91&;#177;3）％。结论：酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养，可以建立兔气管纤毛上皮细胞的原代培养模型，具有成为气管组织工程种子细胞的应用价值。     

新生大鼠视神经少突胶质细胞原代培养及其对视神经损伤修复研究的意义

目的：探讨视神经少突胶质细胞的分离方法和体外培养条件，为研究视神经损伤修复及少突胶质细胞相关课题研究奠定基础。方法：新生Wistar大鼠20只视神经取材，以DMEM／F12为基础的化学限定性培养基进行组织块培养，并用少突胶质细胞特异性标记物半乳糖脑苷脂的抗体鉴定细胞。结果：培养第3天，视神经周围出现少突胶质细胞生长，呈圆形或梭形；10d左右基本铺满盖玻片。免疫细胞化学检测该细胞为阳性细胞，纯度较高。结论：采用视神经组织并用化学限定性培养基能成功获取体外培养的少突胶质细胞．为视神经损伤修复的研究提供了先决条件。     

构建神经再生室培养成年SD大鼠许旺细胞

目的：探讨从成年SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量许旺细胞的有效手段。方法：实验于2005-05／1在解放军第四军医大学口腔医学院组织病理教研室和组织工程实验中心完成。①取成年SD大鼠1只截断坐骨神经5mm，缝接入20mm硅胶管中，形成神经再生室。7d后重新打开伤口，刨开硅胶管，截取再生室内神经段置离心管中作为实验组。②取SD仔鼠5只，无菌条件下取双侧坐骨神经混合于离心管中作为对照组。③将两组坐骨神消化培养。通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了许旺细胞增殖和纯化程度。结果：①两组培养的细胞光镜观察结果：实验组的许旺细胞密度高于对照组，特别是在培养4d后细胞的密度差别尤为显著。实验组的许旺细胞密度大于600个／mm^2，而对照组密度不足200个／mm^2。②两组许旺细胞免疫组织化学染色：实验组衬染后计数许旺细胞的纯度为（98．0&;#177;1.2）％，而对照组许旺细胞的纯度为（93．0&;#177;2．1）％（P〈0．05）。③两组细胞的生长曲线：培养7d，实验组细胞数量较对照组明显增加，达到（49．6&;#177;3．5）&;#215;10^7L^-1，远高于对照组的（31．7&;#177;3．9）&;#215;10^7L^-1。结论：从成年SD大鼠坐骨神经分离培养方法能获得大量高纯度的许旺细胞，为自体许旺细胞在修复周围神经缺损中的应用提供了可能。     

体外培养及其诱导分化人胚胰腺巢蛋白和神经元素3阳性细胞的实验

目的：观察从人胚胎胰腺体外分离培养的巢蛋白和神经元素3阳性细胞，分析其基因表达及诱导分化能力，探讨为胰腺组织工程移植提供种子细胞的可能性。方法：实验于2002—01／2004—05在北京大学干细胞中心完成。实验采用标本为北京市海淀妇产医院产科药物引产的人胚胎，引产药物为米索。使用的胚胎经孕妇同意，并签署同意书。选取18例胎龄为12～24周的人胚胰腺，用Ⅴ型胶原酶消化获得贴壁生长的人胚胰腺细胞，观察其原代培养、传代培养、增殖能力及体外诱导分化能力；胰腺干细胞标志巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达应用免疫荧光染色及反转录聚合酶链反应检测；细胞总蛋白中胰岛素含量应用化学发光法检测。结果：18例胎龄为12～24周的人胚胰腺全部纳入实验。①人胚胎胰腺组织体外培养和诱导分化：人胚胎胰腺组织消化后可获得胰岛样结构，能贴壁生长，传代20代以上，然后进入凋亡期。汇合的细胞加入诱导分化培养基，24h后即可见大部分细胞聚集成团；周围散在贴壁细胞突起细长，立体感增强。随着诱导时间的延长，细胞增殖缓慢，个别细胞脱落、死亡。细胞团易于脱落漂浮，继而死亡。但仍有部分细胞及细胞团贴壁生长。②巢蛋白、胰岛素、胰高血糖素、广谱角蛋白及角蛋白19含量测定：无论是第2代还是第10代细胞中均无胰岛素、胰高血糖素CK-Pan和CK-19染色阳性的细胞。第2代细胞中，巢蛋白阳性细胞约占总细胞数的20％，个别细胞核神经元素3阳性，多数细胞为两者均阴性。第10代细胞中95％以上为巢蛋白强阳性细胞，约90％细胞神经元素3阳性且阳性部位同时存在于细胞核和细胞质中，并与巢蛋白共表达。但第18代细胞，荧光染色神经元素3染色转阴性（反转录聚合酶链反应可检测到少量mRNA的表达），而巢蛋白阳性无明显变化。③诱导前后巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达：诱导前有巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因-1、神经元素3的表达，无胰岛素表达。诱导后出现胰岛素表达，胰十二指肠同源盒基因-1表达增高，巢蛋白和神经元素3表达下降。④胰岛素含量测定结果：诱导分化后，巢蛋白和神经元素3阳性细胞的总蛋白质中含有胰岛素量为2．10IU／g总蛋白，作为阳性对照的人胚胎胰腺组织总蛋白中的含量为2．70IU/g总蛋白，而未诱导的细胞的总蛋白质中未检测到胰岛素。结论：从人胚胎胰腺可以体外分离获得巢蛋白和神经元素3阳性人胚胎胰腺干细胞，为未分化细胞，能在体外大量扩增，可长期培养。总蛋白中有胰岛素表达，有分化为胰岛素阳性细胞的潜能，有望为胰腺组织工程移植提供足够的种子细胞。     

体外培养肌腱细胞功能老化的观测

目的：研究体外贴壁培养肌腱细胞的功能老化。方法：取材成年鸡的趾深屈肌腱，经胶原酶消化法获取肌腱细胞，在体外进行传代培养，收集不同培养时期的细胞，进行形态学、细胞增殖、组织学、逆转录聚合酶连反应（RT－PCR）及Western blot技术分析，观察不同体外培养时间肌腱细胞表型的变化。结果：组织学、RT－PCR及Western blot等均证实随着体外培养时间的延长，肌腱细胞传至第5代后，细胞形态发生明显改变，产殖能力显著减弱，胶原分泌明显减少。结论：体外贴壁培养的肌腱细胞传至第5代后，细胞表型发生显著老化的改变。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化

目的:体外分离培养成人脂肪组织来源的间充质干细胞,探索其基本生物学特性及向心肌细胞诱导分化的潜能,为心肌再生提供理想的自体干细胞来源。方法:实验于2005-01/12在解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心完成。取本院微创外科中心一急性单纯性阑尾炎患者大网膜脂肪组织(取得家属同意并告知仅用作实验室研究)。体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并传代扩增培养。采用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态学特点,四氮唑蓝比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及CD44、CD34的表达,第4代细胞用5-氮胞苷诱导使其向心肌细胞分化,免疫细胞化学鉴定心肌样细胞。结果:①分离培养的脂肪间充质干细胞经传代纯化后细胞形态呈均一梭形生长,电镜显示细胞较为幼稚,核大,核仁明显,常染色质多,异染色质少,细胞器结构及种类简单,以粗面内质网和线粒体为主。②细胞生长曲线呈“S”形,第1和2天为细胞生长潜伏期,第3天开始进入对数生长期,第7天达顶点,群体细胞倍增时间为18～20h。③流式细胞仪检测91.83%细胞CD44表达阳性、CD34阴性。④细胞周期分析显示76.2%细胞处于G0/G1期,S期细胞占8.7%,G2/M细胞占15.1%。⑤5-氮胞苷诱导后4周免疫细胞化学显示部分细胞缝隙连接蛋白-43表达阳性,表达率约为(29.0±1.2)%。结论:成人脂肪组织存在细胞活力旺盛的间充质干细胞且易于体外分离扩增,并在体外一定条件下具有向心肌细胞分化的潜能,可望成为心肌再生医学理想的自体干细胞种子来源。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化

目的：体外分离培养成人脂肪组织来源的间充质干细胞，探索其基本生物学特性及向心肌细胞诱导分化的潜能，为心肌再生提供理想的自体干细胞来源方法：实验于2005—01／12在解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心完成。取本院微创外科中心一急性单纯性阑尾炎患者大网膜脂肪组织（取得家属同意并告知仅用作实验室研究）。体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并传代扩增培养。采用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态学特点，四氮唑蓝比色法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期及CD44、CD34的表达，第4代细胞用5-氮胞苷诱导使其向心肌细胞分化，免疫细胞化学鉴定心肌样细胞。 结果：①分离培养的脂肪间充质干细胞经传代纯化后细胞形态呈均一梭形生长，电镜显示细胞较为幼稚，核大，核仁明显，常染色质多，异染色质少，细胞器结构及种类简单，以粗面内质网和线粒体为主。②细胞生长曲线呈“S”形，第1和2天为细胞生长潜伏期，第3天开始进入对数生长期，第7天达顶点，群体细胞倍增时间为18～20h。③流式细胞仪检测91．83％细胞CD44表达阳性、CD34阴性。④细胞周期分析显示76．2％细胞处于G0／G1期，S期细胞占8．7％，G2／M细胞占15．1％。⑤5-氮胞苷诱导后4周免疫细胞化学显示部分细胞缝隙连接蛋白-43表达阳性，表达率约为（29．0&;#177;1．2）％。 结论：成人脂肪组织存在细胞活力旺盛的间充质干细胞且易于体外分离扩增，并在体外一定条件下具有向心肌细胞分化的潜能，可望成为心肌再生医学理想的自体干细胞种子来源。     

大鼠胎盘来源间充质干细胞的生物学特性

背景：研究报道,人间充质干细胞用于实验动物研究的结果不令人满意,所以考虑使用大鼠胎盘来源的间充质干细胞用于动物实验研究,以期获得更好的实验结果。查阅国内外相关文献,目前尚未发现大鼠胎盘来源间充质干细胞的相关报道。目的：建立从大鼠胎盘分离间充质干细胞的方法,观察其基本生物学特性。方法：通过胶原酶消化法从大鼠胎盘分离并得到间充质干细胞。每天用倒置显微镜观察其形态。用MTT法测定其生长动力学并绘制生长曲线。用流式细胞仪检测其表型及细胞周期。通过免疫组化法证实其成脂及成骨分化的潜能。结果与结论：原代细胞培养8h后细胞贴壁,24h内细胞形成集落,第4代细胞大小、形态基本一致,以梭形为主。细胞周期检测提示G0/G1期、S期、G2期的比例分别为83.76%,8.01%,8.23%。免疫表型分析其表达CD29和CD90,不表达CD45。体外诱导实验证实胎盘间充质干细胞具有成脂和成骨分化的潜能。     

大鼠胎盘来源间充质干细胞的生物学特性

背景:研究报道,人间充质干细胞用于实验动物研究的结果不令人满意,所以考虑使用大鼠胎盘来源的间充质干细胞用于动物实验研究,以期获得更好的实验结果。查阅国内外相关文献,目前尚未发现大鼠胎盘来源间充质干细胞的相关报道。目的:建立从大鼠胎盘分离间充质干细胞的方法,观察其基本生物学特性。方法:通过胶原酶消化法从大鼠胎盘分离并得到间充质干细胞。每天用倒置显微镜观察其形态。用MTT法测定其生长动力学并绘制生长曲线。用流式细胞仪检测其表型及细胞周期。通过免疫组化法证实其成脂及成骨分化的潜能。结果与结论:原代细胞培养8h后细胞贴壁,24h内细胞形成集落,第4代细胞大小、形态基本一致,以梭形为主。细胞周期检测提示G0/G1期、S期、G2期的比例分别为83.76%,8.01%,8.23%。免疫表型分析其表达CD29和CD90,不表达CD45。体外诱导实验证实胎盘间充质干细胞具有成脂和成骨分化的潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养与慢病毒转染方法的建立

本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗提供合格的细胞.无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用冲洗法冲出骨髓,贴壁培养法分离纯化BMMSC,体外扩增;流式细胞术进行免疫表型鉴定,并进行成骨,成脂分化鉴定;利用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒液转染大鼠BMMSC...     

胰岛干细胞和脐血间充质干细胞体外分离培养的形态学特征观察

背景:干细胞是具有自我更新能力和高度增殖能力和多种分化潜能的较原始细胞,在一定的条件下,干细胞可以分化成机体内的多种功能细胞。胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以治疗相应系统的疾病,但是目前有关这两类干细胞的培养仍有困难。目的:探讨胰岛干细胞和脐血间充质干细胞分离和培养的方法,并观察在培养过程中两类干细胞的形态学变化。设计:完全随机分组设计,重复测量实验。单位:郑州大学医学院生理学教研室干细胞研究中心材料:实验于2004-04/2005-01在郑州大学医学院干细胞中心完成。选用鼠龄1～3d新生SD大鼠10～15只进行胰岛干细胞培养,采集年龄24～35岁的足月妊娠健康产妇(经过产妇知情同意)新鲜脐带血进行脐血间充质细胞的培养。方法:取新生SD大鼠,无菌条件下剖腹取胰,眼科剪反复剪切后V型胶原酶消化分离胰岛。连续转瓶法纯化胰岛。取新鲜采集脐带血,用1.077g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将胰岛细胞和脐血单个核细胞接种于37℃,体积分数0.05CO2培养箱内培养。于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况。主要观察指标:胰岛干细胞和脐血间充质干细胞的分离培养方法以及在细胞生长过程中的形态学变化。结果:①培养中可见梭形胰岛祖细胞贴壁呈极性生长,并且不断增殖,约12～14d长满瓶底,可连续多次传代。撤去生长因子和血清后有圆形细胞团开始形成。②从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,瑞士染色显示这些细胞大多数为粒系的集落,7d后出现贴壁的扁平状的上皮样细胞和长梭形的成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂。随着培养时间的延长,细胞数目不断增加。结论:胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以在体外分离和培养,用于进一步相关实验工作。     

胰岛干细胞和脐血间充质干细胞体外分离培养的形态学特征观察

背景：干细胞是具有自我更新能力和高度增殖能力和多种分化潜能的较原始细胞，在一定的条件下，干细胞可以分化成机体内的多种功能细胞。胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以治疗相应系统的疾病，但是目前有关这两类干细胞的培养仍有困难。目的：探讨胰岛干细胞和脐血间充质干细胞分离和培养的方法，并观察在培养过程中两类干细胞的形态学变化。设计：完全随机分组设计，重复测量实验。单位：郑州大学医学院生理学教研室于细胞研究中心材料：实验于2004-04／2005-01在郑州大学医学院干细胞中心完成。选用鼠龄1-3d新生SD大鼠10-15只进行胰岛干细胞培养，采集年龄24—35岁的足月妊娠健康产妇（经过产妇知情同意）新鲜脐带血进行脐血问充质细胞的培养。方法：取新生SD大鼠，无菌条件下剖腹取胰，眼科剪反复剪切后V型胶原酶消化分离胰岛。连续转瓶法纯化胰岛。取新鲜采集脐带血，用1．077g／cm^3的淋巴细胞分层液，密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将胰岛细胞和脐血单个核细胞接种于37℃，体积分数0.05 CO2培养箱内培养。于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况。主要观察指标：胰岛干细胞和脐血间充质千细胞的分离培养方法以及在细胞生长过程中的形态学变化。结果：①培养中可见梭形胰岛祖细胞贴壁呈极性生长，并且不断增殖，约12-14d长满瓶底，可连续多次传代。撤去生长因子和血清后有圆形细胞团开始形成。②从脐血中分离出的单个核细胞，培养中先出现大量的造血细胞集落，瑞士染色显示这些细胞大多数为粒系的集落，7d后出现贴壁的扁平状的上皮样细胞和长梭形的成纤维样细胞，同时有大量的破骨样细胞混杂。随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。结论：胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以在体外分离和培养，用于进一步相关实验工作。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养表型鉴定与标记

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离培养、表型鉴定和标记的方法，为临床进行细胞移植治疗心、肝、脑等器官急性衰竭提供种子细胞。方法 无菌条件下取大鼠股骨、胫骨和腓骨，用冲洗法冲出骨髓，用直接贴壁法分离纯化MSCs，体外扩增，用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的MSCs进行鉴定，并检测第3代MSCs的细胞周期。结果体外培养的原代MSCs 72h内可见有少量贴壁细胞，7d左右达到汇合。免疫细胞化学示，MSCs CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表达阳性，而CD14、CD34、CD45表达阴性。流式细胞仪示，CD14阳性率为0．19％、CD29为64．36％、CD34为0．17％、CT44为86．73％、CD45为0．18％、CD73为90、21％、CD105为74．25％、CD166为54．60％。细胞周期显示，第3代MSCs约有90％的细胞处于G0／G1期。结论 MSCs在体外很容易分离培养和扩增，DAPI标记MSCs敏感性好，标记效率高，可作为标记细胞的一种有效手段，MSCs体外培养成功为细胞移植治疗急危重症器官衰竭提供新的治疗途径。     

体外培养人羊膜间充质细胞的神经生物学特点

目的：探讨体外培养人羊膜间充质细胞（hAMCs）的神经生物学特征。方法：应用MTS分析法、BrdU掺入法和增殖细胞核抗原（PCNA）的免疫荧光染色,探讨体外培养hAMCs的增殖活性。利用免疫细胞化学法检测hAMCs 中间充质细胞标记（STRO-1、Vimentin）、神经干细胞标记蛋白（Nestin、PSA-NCAM）、神经细胞标记蛋白（β-tubulin-Ⅲ、TH）和神经分化相关蛋白（math-1、mash-1）的表达。结果： MTS分析法显示hAMCs在接种后第6—8天增殖速度最快,第8—24天活细胞数基本保持稳定;BrdU和PCNA的免疫荧光染色结果显示体外培养hAMCs中具有大量BrdU和PCNA阳性细胞存在;体外培养的hAMCs表达间充质干细胞特异性标记物STRO-1和Vimentin,也表达神经干细胞标记物Nestin和PSA-NCAM,同时还可见神经元特异性标记物β-tubulin-Ⅲ和TH,以及神经元分化相关蛋白math-1和mash-1的表达;体外培养hAMCs中存在有TH/BrdU和β-tubulin-Ⅲ/BrdU双阳性细胞。结论：体外培养的hAMCs表达间充质干细胞、神经干细胞、神经元的特异性标记蛋白,同时具有增殖活性;hAMCs表达神经元分化相关蛋白,提示hAMCs具有向神经元分化的潜能。