采用RT-PCR技术进行SARS冠状病毒基因检测

目的 建立RT—PCR检测SARS冠状病毒基因的方法，用于早期诊断。方法 对临床确诊的20例SARS患的血、鼻拭子、咽拭子、尿、便等69份标本进行总RNA提取，反转录成cDNA后再以本研究室自行设计合成的一对特异引物进行PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，出现140bp带为SARS病毒阳性。采用测序仪对140bp带进行特异性检测，并进行灵敏度试验。结果 140bp扩增序列与公布的SARS病毒的基因序列完全一致，灵敏度可达10个拷贝。SARS患II份尿标本中6份检出140bp阳性扩增带，8份便标本中检出3份阳性，从15份鼻拭子和15份咽拭子中分别检出6份和5份阳性标本，血清15份、白细胞5份分别检出2份阳性。20例SARS患中送检1至4种标本检测到SARS病毒阳性共15例(75％)。结论 本研究建立的RT—PCR方法灵敏、特异，可用于早期诊断。尿、便标本中的SARS病毒检出率较高且取材简便、病人无痛，是取材的极好选择。每例待测患最好同时取其尿、便、拭子、血等多种标本，可以提高SARS病毒检出率。     

用RT-PCR方法检测登革病毒E基因核酸

目的：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术建立检测登革2型病毒E基因的方法。方法：分别抽提登革2型病毒NGC株和从登革出血热病人血清中分离得到的2型登革热病毒(DV)核酸(RNA)，合成CD-NA第一链，经过RT-PCR得到cDNA产物，用HinfI限制性内切酶酶切鉴定。结果：通过RT-PCR检测登革2型病毒核酸。结论：登革2型病毒E基因核酸的RT-PCR检测方法的建立为快速诊断登革病毒感染提供了可靠的方法。     

荧光定量RT-PCR在轮状病毒检测中的应用

目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评价。并将该体系用于临床腹泻样本。结果:该荧光定量RT-PCR体系具有高度灵敏度和特异性,线性范围宽,最低可检出1TCID50/ml。对113份临床腹泻样本的平行检测结果显示,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率差异无统计学意义(χ2=0.41,P>0.5),可同样用于临床样本检测。结论:成功建立了轮状病毒荧光定量RT-PCR体系,该体系灵敏、特异、重复性好,可用于临床检测。     

实时荧光定量RT-PCR与ELISA检测孕妇血清风疹病毒的比较分析

目的应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术定量检测孕妇血清标本中风疹病毒RNA,并与ELISA法比较其敏感度与特异度,为孕妇早期风疹病毒检测提供迅速准确的方法。方法收集126例已确诊风疹病毒阳性孕妇血清标本与107例女性健康查体者血清标本,同时进行实时荧光定量RT-PCR核酸检测与风疹病毒ELISA法IgM抗体检测,比较两种方法的敏感度与特异度。结果以细胞培养法为金标准,实时荧光定量RT-PCR法敏感度为92.9%,特异度为98.1%。ELISA IgM抗体法的敏感度和特异度分别为97.6%,86.9%。两种方法的敏感度无显著性差异（p〉0.05）,实时荧光定量RT-PCR法的特异度明显高于ELISA IgM抗体法（p〈0.01）。结论实时荧光定量RT-PCR简便快捷、敏感性高、特异性高、定量准确,在临床风疹病毒基因检测中具有很大的应用潜力。     

RT-PCR一步法与RT-PCR两步法的比较

RT- PCR是检测 RNA模板或基因表达水平最敏感的技术之一 ,一步法 RT- PCR能克隆微量 m RNA而不需构建c DNA文库 ,即 c DNA合成与 PCR反应在同一 Buffer及酶中进行 ,一步法完成 ,省略了 c DNA与 PCR之间的过程。两步法 RT- PCR:首先用反转录酶 AMV、M- Mulv或 Tth DNA聚合酶合成 c DNA,然后以 c DNA为模板进行 PCR。笔者对RT- PCR一步法与 RT- PCR两步法进行比较 ,显示 RT- PCR一步法 :快速 ,简便 ,敏感 ,减少污染机会 ,减少了 RNA二级结构 ,聚合酶具有校正活性 ,减少 PCR反应的错配率。 RT-PCR两步法 :同一管中同时扩增两个引物 ,减少了一些人为的误差 ;将 RNA转录为 c DNA,易于保存 ;两步法整个过程比一步法的费用少。1　材　料1.1　标本　选用福建医科大学附属第一医院 2 0 0 1- 2 0 0 2年手术切除胃癌标本 6 9例 ,其中低分化 4 1例 ,高中分化 2 8例 ,标本离体半小时内新鲜取材 ,所有的病例均切取癌与癌旁组织 ,生理盐水清洗两遍后 ,装入新的一次性冻存管 ...     

RT-PCR法检测HNP1基因在气管上皮细胞转染后的表达

采用脂质体转染法将人中性粒细胞防御素（ Ｈ Ｎ Ｐ１ ）的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 重组真核表达质粒ｐ Ｂａｂｅ Ｎｅｏ Ｈ Ｎ Ｐ１导入无血清培养的人和兔的气管粘膜上皮细胞,利用逆转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）法,在核酸水平检测 Ｈ Ｎ Ｐ１ 在气管上皮细胞的表达。结果：在人和兔的转染上皮细胞中均可检测到 Ｈ Ｎ Ｐ１ｍ Ｒ Ｎ Ａ 的表达,而在未转染的上皮细胞中 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ检测结果呈阴性。这一结果与作者先前用免疫组化法在蛋白质水平上检测的结果一致,并证明ｐ Ｂａｂｅ Ｎｅｏ Ｈ Ｎ Ｐ１ 转染至气管粘膜上皮细胞后能得到有效表达。     

蜂毒肽对新生大鼠心肌细胞Na^＋,K^＋—ATP酶基因表达的影响

目的　观察蜂毒肽对新生大鼠培养心肌细胞Na ,K ATP酶α1和 β1亚基mRNA的表达。方法　采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术。药物与培养的心肌细胞温育 1h后 ,观察蜂毒肽对Na ,K ATP酶基因表达的影响。用GAPDHmRNA作为内参照。　结果　蜂毒肽对α1亚基mRNA表达有显著促进作用。经GAPDH校正 ,光密度值对照组为 0 .47± 0 .14(n =5 ) ,蜂毒肽 0 .0 1mmol/L组为 0 .6 6± 0 .10 (n =6 ,P <0 .0 5 ) ,哇巴因 1mmol/L组为 0 .6 7± 0 .0 9(n =6 ,P <0 .0 5 )。蜂毒肽 0 .0 1mmol/L组和哇巴因 1mmol/L组对Na ,K ATP酶β1亚基mRNA表达无显著影响。结论　蜂毒肽 0 .0 1mmol/L对Na ,K ATP酶α1亚基mRNA表达有促进作用 ,但对 β1亚基mRNA的表达无促进作用     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的：比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,χ2=8.1, P<0.005。结论通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。     

实时荧光RT-PCR对SARS患者血清中病毒含量的定量检测

目的:阐述SARS患者病程与血清中SARS病毒含量间的关系.方法:采用高灵敏度荧光实时定量RT-PCR方法,对156份SARS患者进行检测,同时,以9.4×109copies/L(Robert Koch Institute)灭活的SARS冠状病毒为定量标准品,病毒样颗粒为阳性对照,分析SARS-CoV阳性血清样本中的病毒含量.结果:检测试剂的灵敏度达1×105copise/L,与相关病原体没有交叉.81份血清样本中病毒含量分布在1×105～1×107copies/L之间,患者血清样本中病毒含量较低,经统计学分析,病毒含量与病程长短无明显数量关系.结论:SARS患者血清中病毒含量低,与病程没有明显的相关性.     

RT-PCR测定非小细胞肺癌骨髓微转移

目的 探讨RT－PCR法检测非小细胞肺癌骨髓微转移的临床可行性。方法 以CK19mRNA作为标记物，运用RT－PCR方法检测41例非小细胞肺癌手术患者骨髓中CK19mRNA的表达，并以肺癌组织作为对照。结果 肺癌组织中CK19mRNA表达的阳性率100％，41例非小细胞肺癌患者骨髓中CK19mRNA阳性15例，阳性率36．64％，非肿瘤对照组均阴性。结论 以CK19mRNA作为肿瘤标记物，用RT－PCR法作为检测骨髓中肺癌微转移的手段是敏感和可行的。     

SYBR Green实时定量PCR检测急性髓系白血病患者BAALC基因表达

目的:观察SYBR Green相对定量逆转录聚合酶链反应(RQ-PCR)方法检测急性髓系白血病(AML)患者外周血单个核细胞(PBMC)中脑和急性白血病细胞胞质(BAALC)基因mRNA的表达水平。方法:分离12例初发AML患者和5名健康成年人PBMC,以白血病细胞株K562为阳性对照,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,SYBR Green相对定量RQ-PCR检测BAALC基因表达水平。结果:健康成年人PBMC中检测不到BAALC mRNA的表达,12例AML患者中,有8例BAALC mRNA高表达,与K562比较,其相对值为K562的0.8~5.6倍。结论:用SYBR Green相对定量RQ-PCR可以检测到AML患者PBMC中BAALC基因的表达,该方法稳定、敏感、可靠。     

逆转录聚合酶链反应检测小鼠MN/CA9基因的表达

目的：克隆、分析ICR小鼠MN/CA9基因序列,并检测MN/CA9基因在ICR小鼠各组织中的表达。方法：分别取ICR小鼠小肠、肝、肾、脾、胃、胸腺、心脏、卵巢、肺、胰腺、肌肉、皮肤、子宫和膀胱新鲜组织,采用胍尼啶异硫氢酸呱酚氯仿提取法（GIT）提取总RNA。合成cDNA的第1链和第2链,连接EcoRⅠ载体,EcoRⅠ末端磷酸化,XhoⅠ消化,将cDNA构建到ZAP express vector进行包装、种植培养,筛选、切取噬菌体,使用引物扩增后进行DNA 序列分析。用逆转录聚合酶链反应检测小鼠MN/CA9基因在上述组织中的表达。结果：使用人类MN/CA9基因片段做探针,用放射性同位素 ³² P 标记探针,筛选1.47×10³大肠埃希菌落,杂交后发现一阳性cDNA信号,序列测定确定其含1 671 bp核苷酸序列（已在GenBank 登录,登录号AB086322）,这个序列与人类的MN/CA9 (基因序列号Z54349)有69.1％的同源性。在引物P521-P1193区间,MN/CA9基因在小鼠小肠、子宫、肌肉、胰腺、心脏、肺、胸腺、脾、肾、卵巢、胃和膀胱组织表达均较强,在皮肤和肝脏不表达。结论：MN/CA9基因在ICR小鼠组织中的表达与人类基本相同,可以用ICR小鼠进行MN/CA9基因的研究。     

食管鳞癌区域淋巴结微转移分子学检测的临床病理意义

目的：评价RT-PCR法检测食管鳞癌区域淋巴结微转移的临床病理意义。 方法：取23例食管鳞癌患者的区域淋巴结共104枚，将每枚淋巴结均分为两等份，分别进行病理学检查和上皮组织特异性标志物角蛋白CK19基因的表达分析。对两法测得的淋巴结转移结果与常见临床病理参数间的关系进行统计学分析。结果：23例病人中，病理检查发现其中10例 （43.5%）淋巴结存在癌转移，淋巴结是否转移与临床病理参数之间不存在相关性。CK19RT-PCR法不但证实了病理检查的结果，而且还另外发现5例病人存在淋巴结微转移，淋巴结转移与否与组织分化等级（P =0.035）和pTNM分期（P =0.024）间存在相关关系。结论：运用RT-PCR法检测区域淋巴结转移有助于揭示食管癌固有的转移规律。     

一种去除聚合酶链式反应引物二聚体的简便方法

目的提供一种去除聚合酶链式反应(PCR)引物二聚体的简便方法。方法根据聚乙二醇(PEG)能够选择性沉淀DNA片段的原理,确定分别去除100 bp、100～200 bp、100～300 bp条带的PEG 6000最终质量分数,因引物二聚体大小一般为200 bp,最终运用到去除含有引物二聚体的PCR产物中。结果最终质量分数为10.67%、9.00%、8.00%的PEG能分别除去100 bp、100～200 bp、100～300 bp条带。最终质量分数为24.00%的PEG能有效去除PCR引物二聚体并纯化PCR产物。结论 PEG 6000能有效去除PCR扩增产物的引物二聚体,达到纯化PCR产物的效果。     

PCR法直接筛选重组阳性克隆

目的　建立一个简便、可靠的重组阳性克隆的筛选方法。方法　应用扩增小鼠生精细胞凋亡相关基因时使用的引物 ,以基因重组扩增后得到的菌落为模板 ,直接进行PCR扩增。结果　在筛选的阳性菌落中可扩增到与小鼠凋亡相关基因片段大小一致的阳性条带 ;以阳性克隆提取质粒进一步进行PCR和酶切鉴定及序列分析 ,证明结果正确。结论　菌落PCR是一种简便、快速、可靠、有效的筛选重组阳性克隆的方法。     

丙型肝炎病毒核酸单引物聚合酶链反应产物的直接序列分析

利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,得到丙型肝炎病毒核酸非编码区引物所引导的扩增片段。用改进的不对称PCR方法,制备单链cDNA,直接作为模板进行序列分析,结果与Takamizawa发表的序列符合。本法简单方便,亦可用于其他类似的研究中。     

仅采用 PCR 进行分子克隆的方法探索

目的：针对目前各种费时且易失败的克隆方法和价格昂贵的试剂盒等问题,对一种仅采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）分子克隆方法进行了探索。方法利用高保真的 DNA 聚合酶具有3＇-核酸外切酶活性的特点,采用 PCR 把载体和插入片段扩增出来,二者的扩增产物先加限制性内切酶 DpnI 后再按一定比例混合来消化甲基化的 DNA 模板,最后把DpnI 消化产物直接转化到感受态细胞来得到克隆基因。结果是一种简单、高效、可靠、且仅采用 PCR 的分子克隆方法,并利用此方法成功地把构建在载体 pET 上的α-突触核蛋白全长基因和构建在 pCDNA3.1上的乙酰胆碱受体亚基的全长基因分别重新构建在载体 pGEX-4T-1和 pGEMHE 上。结论在 PCR 扩增时能够通过引物设计来确定克隆位点,所以该方法可以把任何 DNA片段插入到质粒载体内的任何位置,而不需要考虑载体多克隆位点限制的问题。此外,该方法省去了传统的酶切消化、纯化回收和连接过程。     

应用PCR和RT-PCR检测猪内源性逆转录病毒及其意义

目的 观察猪内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retrovirus,PERV)在中国实验小型猪的感染情况。方法 针对PREV gag区的序列，选用特异性引物，采用PCR方法检测猪肝脏、皮肤前病毒序列；以及RT－PCR方法检测血清中PERV－RNA序列。结果 该法在猪肝脏组织中可检测出PERV前病毒序列；此外，在猪血清标本亦检测出病毒序列，而其它2份HBV、HCV阳性血清及2份其它动物血清（大鼠、兔）检测结果均为阴性，说明该方法特异性较高。结论 中国实验小型猪均携带该病毒，并可以释放到血清中；采用该法具有特异、简便的特点，为进一步研究PERV感染及生物安全性奠定了基础。     

新型隐球菌聚合酶链反应的检测方法

目的：从基因角度为新型隐球菌性脑膜炎的快速诊断提供一种新方法．方法：应用聚合酶链反应技术检测和鉴定脑脊液中的新型隐球菌特异性基因．结果：对引物的特异性试验证明具有较高的特异；对引物的敏感性试验可扩增出１０个菌细胞；用墨汁复染、分离培养、ＰＣＲ技术，对１５例脑膜炎患者的脑脊液同时进行检测，结果分别为：６６．６％、８６．６％、９３．３％．结论：以新型隐球菌特异性基因片段进行体外扩增，对新型隐球菌性脑膜炎的早期诊断具有重要的临床意义．