检测PML—RARα融合基因在小儿急性早幼粒细胞白血病中的意义

应用筑巢式逆转录酶／多聚酶链的以应检测４例小儿急性早幼粒细胞白血病患者中因染色易位ｔ（１５：１７）所形成的早幼粒细胞白血病－维甲酸受体α（ＰＭＬ－ＲＡＲα）融俣基因转录本，发同了二种不同类型的ＰＭＬ－ＲＡＲα异构体，即长型短型。４例患者中２例表达Ｌ型，２例表达Ｓ型。     

急性早幼粒细胞白血病PML—RARα融合基因的检测及其临床意义

目的 探讨PML－RARα融合基因检测对急性早幼粒细胞白血病（APL）诊断的意义。方法 RT－PCR检测PML－RARα融合基因表达。结果（1）APL患者32例中26例PML－RARα融合基因阳性,其中L型10例,S型10例,L型＋S型6例。（2）1例M3患者伴t(9;17)染色体易位,PML－RARα融合基因L型和S型均阳性,未见报道。结论 存在PML－RARα融合基因L型和S型均阳性的M3。PML－RARα融合基因联合染色体检测有助于M3的诊断及指导治疗。     

检测PML－RARα融合基因在小儿急性早幼粒细胞白血病中的意义

应用筑巢式逆转录酶／多聚酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）检测４例小儿急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）患者中因染色体易位ｔ（１５：１７）所形成的早幼粒细胞白血病─维甲酸受体α（ＰＭＬ－ＲＡＲα）融合基因转录本，发现了二种不同类型的ＰＭＬ－ＲＡＲα异构体，即长型（Ｌ）、短型（Ｓ）。４例患者中２例表达Ｌ型（１５１ｂｐ片役），２例表达Ｓ型（１６３ｂｐ片段）。此筑巢式ＲＴ／ＰＣＲ具有高度敏感性，可以从４×１０￣５个正常细胞中检出１个ＡＰＬ细胞。ＲＴ／ＰＣＲ检测ＡＰＬ患者的ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因是一种快速、敏感的方法，对ＡＰＬ的诊断、监测和鉴别诊断具有重要意义。     

PML／PARα融合基因检测临床应用及变异易位的研究

目的：优化PML-RARα融合基因检测方法，观察变异易位及其临床意义。方法：RT-PCR查骨髓及部分外周血PML-RARα融合基因，变异易位产物作测序分析。结果：发病期有8例APL患者（初发4例，复发4例）PML-RARα融合基因均阳性；缓解期APL患者的20人次检查中6人次阳性，而其骨髓涂片早幼粒细胞比率均小于5%；发现一种新的S型变异易位，并见L、S型同时存在于同一个体。外周血中的阳性率低于骨髓中，结论：证实S型206bp的变异产物是一种新的变异易位产物；同一个体L、S型可同时存在；提取骨髓单个核细胞用于RT-PCR查PML-RARα融合基因效果最佳。     

RT—PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML—RARα融合基因的临床意义

目的 研究ＰＭＬ－ＲＡＲα在ＡＰＬ的特异性诊断,疗效判定等方面的作用。方法 采用反转录聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）检测了２２例急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）患者的ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因转录本。结果 １７例为初治患者,地时检测均为阳性,１３例经全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）诱导分化治疗均达完全缓解（ＣＲ）,缓解后检测融合基因转录本均为阳性,将１３例患者随机分为ＭＡ方案组与ＨＡ方案组,化疗４次～５次后     

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立

目的：针对90％以上的急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）患者表达的PML／RARc~融合基因,设计引物及探针。对APL患者进行基因筛查,并构建PMI／RARα环形质粒作为标准品,建立APL患者PML／RARα融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,为APL患者的诊治提供分子生物学依据。方法：设计PML／RARα及ABL引物及Taqman探针,对APL患者进行基因筛查。并以PML／RARα L型及S型阳性的APL患者cDNA为模板,应用PCR技术扩增出453bp和550bp基因片段,构建pMD18T—PML／RARα（L）及pMD18T—PML／RARα（s）标准品。实时荧光定量（real—time quantitative PCR,RQ—PCR）技术对该基因转录本水平的变化情况进行监测。结果：成功构建pMD18T—PML／RARα质粒标准品,应用RQ—PCR技术,以ABL为内参,应用Taqman探针法,对APL患者标本进行检测,技术可行,数据稳定。结论：成功构建APL融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,应用于临床病人的基因诊断,为APL的诊治提供了可靠的分子依据。     

反义寡聚脱氧核苷酸对白血病K562细胞株生物特性的影响

目的：探讨反义核酸对白血病Ｋ５６２细胞株的影响。方法：用人工合成的ｂｃｒ３／ａｂ１２反义寡聚脱氧核苷酸（ＡＳＯ－ｂ）及无义寡聚脱氧核苷酸（Ｎ－ＯＤＮ）处理人急性红白血病细胞株Ｋ５６２细胞系，以观察Ｋ５６２细胞的生长及其ｂｃｒ３／ａｂ１２癌基因的表达。结果：ＡＳＯ－ｂ能抑制体外培养的Ｋ５６２细胞的生长（抑制率为５３．８３±１０．７８，Ｐ＜０．０５），集落形成（４０μＭ的ＡＳＯ－ｂ的抑制率为８８．９，Ｐ＜０．０５），ＤＮＡ及Ｐ２１０蛋白的合成（１２ｈ抑制率分别为７９．６８±１３．５３，６０．３３，Ｐ＜０．０５）；而对照组对Ｋ５６２细胞则无明显的影响。结论：提示ｂｃｒ３／ａｂ１２癌基因是维持Ｋ５６２细胞恶性生长表型的主要因素，也为慢性髓系白血病的治疗指出了新的方向。     

辛伐他汀对NB4细胞分化与凋亡的影响

 目的　探讨磁性纳米Fe3O4颗粒（Fe3O4-MNP）联合多柔比星（ADM）对Raji细胞的影响。方法　采用MTT法检测细胞的增殖,锥虫蓝染色计数细胞的活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测p53和NF-κB的表达水平。结果　ADM及Fe3O4-MNP-ADM对Raji细胞的生长抑制率与药物浓度、作用时间呈正相关（r＝0.412,P＝0.027;r＝0.523,P＝0.014）;12、24、48 h细胞凋亡率二者分别为8.76 % 比 14.85 %、35.08 %比 44.50 %、44 %比69.4 %,差异有统计学意义（P＝0.012、0.041、0.024）;Western blot检测示ADM组与Fe3O4-MNP-ADM组NF-κB蛋白的灰度条带与内参比较分别为4.22±0.32、3.31±0.28,p53蛋白的条带灰度值分别为1.042±0.114、1.270±0.091,差异具有统计学意义（t＝-54.416,P＝0.035;t＝33.963,P＝0.047）。结论　Fe3O4-MNP联合ADM能够有效抑制Raji细胞增殖并诱导其凋亡,作用机制可能与增强p53蛋白活化、抑制NF -κB通路的激活有关。     

反义核酸与维甲酸对NB4和HL-60细胞生长分化的影响

目的：急性早幼粒细胞白血病染色体ｔ（１５；１７）易位形成的ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因作为早幼粒细胞白血病的标志与ＡＰＬ的发病及维甲酸诱导分化效应密切相关。本研究将针对ＰＭＬ－ＲＡＲα基因的反义核酸和维甲酸对ＮＢ４细胞和ＨＬ－６０细胞生长分化的影响加以比较，探讨ＰＭＬ－ＲＡＲα基因对维甲酸诱导分化作用的影响。方法：用反义核酸来封闭ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因的表达并用ＲＴ－ＰＣＲ的方法检测。ＮＢ４细胞的生长、分化及功能通过细胞生长曲线、形态学、细胞表面标志及ＮＢＴ还原试验加以判定，细胞周期应用流式细胞仪进行分析。结果：①反义核酸仅能够抑制ＮＢ４的生长，促进ＮＢ４细胞的分化，具有特异性；②维甲酸能够同时影响ＮＢ４和ＨＬ－６０细胞的生长分化；③反义核酸能够降低ＮＢ４细胞Ｓ期细胞百分比，而维甲酸不能。结论：ＡＳＯＤＮ和维甲酸影响ＡＰＬ细胞的生长分化作用机制可能不同，而且反义核酸作用特异性强，作用时相早。     

氧化酚砷诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞凋亡的研究

目的：了解氧化酚砷（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ ｏｘｉｄｅ,ＰＡＯ）对急性早幼粒细胞性白血病（ＡＰＬ）细胞系ＮＢ４细胞的可能作用。方法：在台盼蓝排除法计数活细胞和细胞活力的基础上,通过细胞形态不和流式细胞仪检测细胞凋亡。通过对细胞进行Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（Ｒｈ）１２３和碘化丙啶双重染色,并应用流式细胞仪检测其荧光强度,以反映细胞线粒体跨膜电位（ΔΨｍ）。结果和结论：低浓度（０．０５和０．０１μｍｏｌ／     

Characterization of arsenic-induced cytogenetic alterations in acute promyelocytic leukemia cell line,NB4

Gain or loss of genes plays important roles in leukemogenesis of APL via cooperation with PML-RARA. Fluorescence in situ hybridization (FISH) was applied to investigate the DNA copy number changes of hTERT, ERG, CDKN1B (P27), CDKN2A (P16), and TP53 genes in an acute promyelocytic leukemia (APL) cell line (NB4). Five bacterial artificial chromosome probes (BAC) for 9p21.3, 17p13.1, 12p13.2, 5p15.33, 21q22.2 regions were prepared using sequence independent amplification (SIA) and were hybridized to NB4 cells treated with different doses of arsenic trioxide (As₂O₃; ATO) at various time intervals. NB4 cells were also karyotyped by G-banded chromosome analysis 24 h after culture initiation. FISH analysis prior to treatment showed CDKN1B, CDKN2A, and TP53 gene deletion but ERG and hTERT gene amplification. After treatment with ATO, the number of the NB4 cells with deleted CDKN1B and CDKN2A as well as the counts of the cells with hTERT amplification was significantly reduced in time- and does-dependent manners. In addition, we observed expressive increase in signal patterns of CDKN1B and CDKN2A along with significant decline in hTERT signal patterns in ATO-treated cells as compared with the control group (in time- and dose-dependent manners). On the other hand, no difference in signal patterns for Erg and p53 was observed in response to ATO exposure. The results of the present study show the cytogenetic alteration in hTERT, CDKN1B, and CDKN2A in NB4 cells after treatment with ATO might introduce a new mechanism of antitumor activities of ATO in APL cell line, NB4.     

甲异靛对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4体外作用的研究

目的 探讨甲异靛对NB4细胞系的抑制增生、诱导凋亡和分化的作用。方法 用锥虫蓝染色方法进行活细胞计数;用NBT还原实验和CD11a、CD11b的表达判定促分化作用;光镜和电镜细胞形态学、TUNEL标记和Sub-G1测定观察细胞凋亡,RT-PCR和流式细胞术分析法检测凋亡调控基因mRNA及蛋白水平表达。结果 20μmol／L和30μmol／L甲异靛可明显抑制NB4细胞的增生,诱导细胞凋亡并下调bcl-2表达,使细胞停滞在G0／G1期。5μmol／L和10μmol／L时NB4细胞的NBT还原能力明显升高,CD11a,表达明显升高。结论甲异靛通过诱导细胞凋亡和使细胞停滞在G0／G1期这两种机制显著抑制NB4细胞增生,此外,还有部分诱导细胞分化的作用。     

塞来昔布抑制NB4细胞增殖并诱导凋亡的体外研究

目的 探讨塞来昔布对急性早幼粒细胞白血病细胞的抑制增殖及诱导凋亡作用.方法 应用光镜和透射电镜观察细胞形态学改变;MTT法分析塞来昔布对细胞增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳进行DNA片段化分析;流式细胞仪检测不同浓度(0、20、40、80、120和160 μmol/L)塞来昔布处理24小时后细胞周期的变化以及凋亡情况.结果 镜下观察细胞出现凋亡形态学表现.MTT示塞来昔布对NB4细胞具有明显的增殖抑制作用,并具有时间和剂量依赖性.琼脂糖凝胶电泳见DNA片段化,形成典型梯状条带.流式细胞仪检测发现塞来昔布处理24小时后,随着作用浓度增加,NB4细胞凋亡率提高;同时细胞周期阻滞于G1/S期.结论 塞来昔布能够抑制急性早幼粒细胞白血病细胞增殖并诱导凋亡.     

C-fms expression correlates with monocytic differentiation in PML-RAR alpha+ acute promyelocytic leukemia.

We have investigated the expression of the M-CSF receptor (c-fms) in 16 freshly isolated acute promyelocytic leukemias (APL) expressing the PML/RAR alpha fusion protein. In parallel, we evaluated the capacity of these cells to differentiate along the granulocytic and monocytic pathways. c-fms was constitutively and constantly expressed in all cases sensitive in vivo to all-trans retinoic acid (ATRA) and its expression was further potentiated following in vitro induction with ATRA. Furthermore, gel-shift analysis of APL cells showed elevated levels of PU.1 binding activity to the M-CSF receptor promoter, particularly after ATRA stimulation. Interestingly, the rise of PU.1 binding activity as well as of PU.1 levels after ATRA treatment was significantly higher in APL patients exhibiting monocytic maturation, as compared to those that did not undergo monocytic differentiation. A variable proportion of ATRA-induced APL cells exhibited monocyte-like morphology and immunophenotype: the proportion of monocytic cells was consistently increased by combined treatment with ATRA and diverse hematopoietic growth factors cocktails, which always comprised M-CSF. Monocytic cells originating from in vitro ATRA-induced maturation of APL cells derive from the leukemic clone as suggested by two lines of evidence: (1) monocytic cells harbor the 15;17 translocation; (2) monocytic cells possess Auer bodies. The c-fms(bright) leukemic blasts preferentially showed the capacity for monocytic differentiation as compared to the c-fms(dim/-) subset: indeed, enforced expression of c-fms into NB4, a PML/RAR alpha+ cell line, favored the onset of monocytic maturation. Finally, low c-fms expression was observed in an APL relapsing patient resistant to ATRA, as well as in an APL case with t(11;17), PLZF/RAR alpha+. These observations indicate that PML/RAR alpha+ APL blasts are bipotent for differentiation through both neutrophilic and monocytic lineages, whereby monocytic differentiation is linked to c-fms expression and stimulation.     

WT1基因异构体WTA对NB4细胞基因表达谱影响的研究

目的:探讨WT1基因异构体比例的改变对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4基因表达谱的影响。方法:用电穿孔法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6 转染入白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株NB4/WTA。运用cDNA微阵列技术检测WT1基因异构体表达比例的转变对NB4细胞基因表达谱的影响。并用RTPCR方法验证cyclinA1及CDK7基因表达的改变。结果:转染WT1基因异构体WTA后,外源基因在mRNA及蛋白水平上稳定表达,NB4细胞中共89个细胞周期相关基因、细胞凋亡相关基因、癌基因以及细胞信号和传递蛋白等基因出现2倍以上表达水平的改变。RTPCR证实与细胞周期相关的cyclinA1基因表达上调,CDK7基因表达下调。结论:WT1基因异构体WTA表达比例增加能引起NB4细胞基因表达谱的改变,这些基因的改变可能对白血病细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为产生影响。     

二硫化二砷对维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4-R2增殖和凋亡的影响

目的:研究As2S2对维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4-R2增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。方法:CCK-8法检测不同浓度As2S2作用于NB4-R2细胞24、48和72h对细胞的生长抑制率,计算半数抑制浓度（IC50）,Annexin V-FITC/PI双染法检测As2S2对NB4-R2细胞凋亡的影响,实时定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）和Western blot检测As2S2作用前后NB4-R2细胞PML-RARα融合基因和融合蛋白的表达水平。结果:不同浓度As2S2分别作用于NB4-R2细胞24、48和72h后,细胞增殖均受到不同程度抑制,且该抑制作用呈时间和剂量依赖性,As2S2对NB4-R2细胞的IC50分别为（17.64±2.11）μmol/L、（8.57±1.03）μmol/L和（5.82±0.71）μmol/L。流式细胞术结果表明As2S2处理24、48和72h后细胞凋亡率分别为正常对照组的（4.43±0.12）倍、（6.50±0.09）倍和（8.63±0.36）倍。qRT-PCR结果表明PML-RARα mRNA表达水平较作用前分别降低了（1.47±0.09）倍、（2.86±0.82）倍和（7.46±1.09）倍,同时,PML-RARα融合蛋白表达水平较作用前分别降低了（1.36±0.16）倍、（1.85±0.33）倍和（3.99±0.63）倍（P<0.05）。结论:As2S2可显著抑制NB4-R2细胞增殖并促进细胞凋亡,其机制与诱导PML-RARα融合基因和融合蛋白降解密切相关。