Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗的制备及免疫原性评价

目的:建立Sabin株毒种制备脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliovirus vaccine, IPV)生产工艺并评价其免疫原性。方法:采用Vero细胞培养Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒,制备3价Sabin株IPV(Sabin strain IPV, sIPV)。通过ELISA检测D抗原含量。...     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留定量PCR检测法的验证

目的  验证Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留定量PCR（quantitative PCR,qPCR）检测法。方法  用试剂盒提取Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液的DNA,采用qPCR法检测Vero细胞DNA,并验证方法的线性、专属性、准确性、精密度、耐用性及定量限;同时采用DNA探针杂交法检测样品。结果  qPCR检测Vero细胞DNA标准曲线在0.003 0~300.000 pg/μl之间线性良好;对Hep-2细胞、大肠埃希菌、酵母细胞DNA均无扩增反应;高、中、低浓度样品加标回收率在50%~150%,准确性良好;定量检出限为0.003 0 pg/μl;精密度良好（相对标准偏差＜15%）;反应体系配制好后置于2~8 ℃ 30 min后进行检测,相对标准偏差＜15%,耐用性良好。DNA探针杂交法与qPCR结果均小于0.1 pg/μl。 结论  qPCR检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留具有良好的线性、专属性、准确性、精密度和耐用性,可适用于该项检测。     

甲醛溶液对Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活效果研究

 目的  验证4%甲醛溶液使Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎（脊灰）病毒达到预期灭活效果所需要的时间。方法  用4%甲醛溶液对15批Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒在(36.5±1) ℃ 环境进行灭活,同时以15批未加入4%甲醛溶液的病毒纯化液作为对照组,按照企业注册标准采用微量细胞病变法测定病毒滴度。为了消除4%甲醛溶液对Hep-2细胞的影响,取4%甲醛溶液接种Hep-2细胞作为实验组,同时设置Hep-2细胞为对照组,每天观察对比两组细胞形态。对同一个Hep-2细胞悬液的总细胞数和活细胞数采用传统手工计数和全自动细胞计数仪计数,并比较分析结果。结果  实验组随着灭活时间的延长病毒滴度呈下降趋势,在灭活到第4天起,3个型别样品均检测不到病毒滴度;对照组病毒滴度在每毫升9.1～10.6 lg半数细胞培养物感染量范围内,符合企业注册标准的要求。4%甲醛溶液对Hep-2细胞生长有抑制作用,在培养观察到第3天时细胞全部失去活力死亡;对照组细胞形态良好呈多边形长成致密单层,活细胞组t值为18.098,总细胞组t值为4.005,P值均＜0.05,差异有统计学意义。结论  脊灰病毒在第4天能被彻底灭活,在进行此实验时应先消除甲醛对细胞培养的影响,避免结果出现假病变现象,确保结果的准确性;应用全自动细胞计数能提高计数结果的精确度。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化的离子交换层析条件研究

目的  研究Sabin株脊髓灰质炎病毒（Sabin strain polio virus,sPV）纯化的离子交换层析（ion exchange chromatography,IEC）条件。 方法  在不同层析条件下对sPV凝胶层析粗纯液进行IEC,设定的层析参数分别为介质Q Sepharose FF或Eshmuno Q、上样量30%或40%柱体积、流速（150±5）或（240±8） cm/h。分别检测各型sPV纯化液的D抗原含量、蛋白浓度、病毒滴度、宿主细胞蛋白残留量和Vero细胞DNA残留量,计算D抗原回收率和比活。结果  Eshmuno Q IEC纯化的各型sPV纯化液的D抗原回收率均明显高于Q Sepharose FF IEC。在上样量40% 柱体积、流速（150±5） cm/h条件下,Eshmuno Q IEC纯化的各型sPV纯化液的D抗原比活均高于Q Sepharose FF IEC,差异均有统计学意义（Ⅰ型：t=4.23,Ⅱ型：t=5.73,Ⅲ型：t=4.18,P值均<0.05）,而且前者的宿主细胞蛋白残留量（Ⅰ型：t=8.29,Ⅱ型：t=7.89,Ⅲ型：t=8.18,P值均<0.05）和Vero细胞DNA残留量（Ⅰ型：t=4.23,Ⅱ型：t=4.56,Ⅲ型：t=4.78,P值均<0.05）均低于后者,差异均有统计学意义。结论  用IEC纯化sPV进行纯化时,以Eshmuno Q代替Q Sepharose FF可增加上样量和流速,从而缩短IEC时间,提高纯化效率。     

2013-2018年消灭脊髓灰质炎最后阶段战略计划

2013年1月,在全球消灭脊髓灰质炎行动展现胜利曙光之时,全球消灭脊髓灰质炎行动（GPEI）发布了新制订的《2013-2018年消灭脊髓灰质炎最后阶段战略计划》.此文介绍了战略计划的要点.     

关于2013—2016年全球脊髓灰质炎灭活疫苗及将三价口服脊髓灰质炎疫苗更换为二价疫苗的介绍

此文介绍了目前全球使用的脊髓灰质炎疫苗、全球引入脊髓灰质炎灭活疫苗的进展和2016年4月全球同步将三价口服脊髓灰质炎疫苗更换为二价疫苗的方案及可能产生的影响。     

脊髓灰质炎灭活疫苗抗原含量检测方法的研究进展

脊髓灰质炎灭活疫苗(inactived poliovirus vaccine ,IPV)的问世使全球范围内消灭脊髓灰质炎成为可能,而且IPV在全球致力于消灭脊髓灰质炎中的作用日益增强.通过IPV D抗原检测可以检测IPV效力,因此IPV D抗原的快速定量检测成为亟待解决的关键问题.目前,最常用的体外检测法是ELISA法,然而,尚无国际公认的标准IPV效力检测法.此文就IPV抗原含量检测方法的研究进展加以综述.     

WHO关于脊髓灰质炎疫苗的意见书

此文介绍了脊髓灰质炎病毒的流行病学、目前国际上使用的2种脊髓灰质炎疫苗的安全性、免疫原性和效果以及WHO对脊髓灰质炎疫苗的意见.     

Vero细胞在无血清条件下制备乙型脑炎灭活疫苗

目的 探索Vero细胞在无血清条件下制备乙型脑炎灭活疫苗的工艺. 方法 用无血清培养基培养Vero细胞,并将乙型脑炎病毒P3V2株毒种接种于培养的Vero细胞,观察细胞和病毒的生长情况.收获病毒液,通过灭活、纯化制备乙型脑炎灭活疫苗,检测疫苗各项指标,并与有血清培养工艺制备的疫苗(2013年生产的疫苗)进行比较.结果 无血清培养基培养的Vero细胞生长良好,培养5d的细胞呈致密单层生长.3批无血清培养工艺制备的疫苗的第1、2和3次收获液的平均病毒滴度分别为8.847、8.319和7.194 lgLD50/ml.3批无血清培养工艺制备的疫苗半成品的平均抗原含量(1.51 EU/ml)与有血清培养工艺制备的疫苗(1.41 EU/ml)相当,但前者的宿主细胞蛋白含量(19.69 μg/L)则明显低于后者(63.90 μg/L).结论 乙型脑炎病毒可在无血清Vero细胞中良好生长,Vero细胞无血清培养工艺制备乙型脑炎灭活疫苗是可行的.     

全球首个Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗获批上市

本刊讯2015年1月14日,国家食品药品监管总局批准了全球首个Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(单苗)的生产注册申请。该疫苗是由中国医学科学院医学生物学研究所研发,通过采用现行脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产毒株(Sabin株),经在Vero细胞生物反应器培养收获病毒,结合灭活疫苗生产工艺制备而成。该疫苗主要通过注射途径用于儿童预防脊髓灰质炎病毒的感染,它的上市将对我国彻底消灭脊髓灰质炎发挥至关重要的作用。脊髓灰质炎是一种由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒引起的急性传     

不同方法配制的DTaP-sIPV中sIPV的免疫原性研究

目的 对采用不同配制方式制备的,含不同剂量Sabin株脊髓灰质炎(脊灰)灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV)的DTaP-sIPV联合疫苗中sIPV的免疫原性进行研究.方法 按照2种不同方式配制含高、低剂量sIPV的DTaP-sIPV联合疫苗.将70只大鼠按简单随机法分成7组,分别为F1H(DTaP-sIPV高剂量组,配制方式1)、F2H(DTaP-sIPV高剂量组,配制方式2)、sIPV-H(sIPV高剂量组)、F1L(DTaP-sIPV低剂量组,配制方式1)、F2L (DTaP-sIPV低剂量组,配制方式2)、sIPV-L(sIPV低剂量组)、赛诺菲巴斯德五联疫苗潘太欣对照组.每组10只大鼠,间隔3周双侧后腿肌内注射,0.5 ml/只,共免疫3针.于第0、3、6、9、13、17、21、25周眼眶采血、分离血清,采用微量细胞病变效应抑制法分别测定血清中抗I、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒中和抗体滴度,并进行多样本均数方差分析.结果 每针免疫后,各组抗各型中和抗体滴度均持续上升,第9周均达到最高水平,第13周开始显著下降,至第25周仍维持在一定水平.3针免疫完成后3周,F2H组的抗Ⅰ型脊灰病毒中和抗体几何平均滴度显著高于潘太欣组(F=0.988,P=0.027);抗Ⅱ型中和抗体,F2H组显著高于F1H组,sIPV-H组显著高于F1H和潘太欣组(F=2.391,P值均＜0.05);抗Ⅲ型中和抗体,各组间差异均无统计学意义.3针基础免疫后各时间点F2H组抗各型中和抗体滴度均为最高,但除第9周其抗Ⅱ型中和抗体显著高于F1H组外,其他差异均无统计学意义.结论 DTaP-sIPV联合疫苗免疫大鼠后可以诱导产生抗各型脊灰病毒中和抗体,且其滴度和持续时间均优于或等同于潘太欣组.DTaP-sIPV诱导的中和抗体滴度不低于相应剂量的sIPV.虽然配制方式2可能更佳,但2种配制方式间sIPV的免疫原性差异无统计学意义.     

测定脊髓灰质炎病毒滴度的结晶紫染色法的建立及验证

目的 建立测定脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)滴度的结晶紫染色法,并对该法进行验证。方法 基于PV的半数细胞培养感染量(50% cell culture infective dose,CCID50),用结晶紫染色和酶标仪确定PV的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并验证该法的准确度、精密度、线性范围和耐用性。分别采用建立的结晶紫染色法和传统的显微镜观察法测定66批口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗的病毒滴度,通过Pearson相关分析评价2种检测方法的相关性。将细胞板浸泡液盲传3代,观察培养物的CPE,并通过逆转录PCR确定病毒灭活情况。结果 用建立的方法测定理论滴度8.00、6.00和4.00 lgCCID50/ml的PV样品,回收率为98%~104%。细胞板内和板间测定结果的变异系数(coefficient of variation,CV)为0%~7.85%,同一工作日和不同工作日测定结果的CV分别不超过6.44%和5.27%,不同实验人员测定结果的CV不超过5.10%。该法测定PV滴度的线性范围为2.00~8.00 lgCCID50/ml。该法具有较好的耐用性,以不同细胞浓度(F=1.624,P=0.215)或不同培养时间(F=2.731,P=0.055)培养对PV滴度的测定结果没有影响。该法与显微镜观察法的检测结果具有相关性,Pearson相关系数0.918。实验用细胞板的浸泡液在Hep-2细胞上盲传3代后,培养物未观察到CPE,逆转录PCR测定结果为阴性。结论 建立的结晶紫染色法具有较好的安全性、准确度、精密度和耐用性,适用于口服脊髓灰质炎减毒活疫苗的病毒滴度测定。     

吸附DTaP-脊髓灰质炎灭活疫苗中D抗原检测预处理的解吸附方法建立和初步验证

目的  建立并初步验证吸附DTaP-脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine，IPV）（DTaP-IPV）D抗原检测预处理的解吸附方法。方法  选用4种不同解吸附剂，在相同条件下对DTaP-IPV进行解吸附，用间接ELISA检测IPV D抗原。根据各型D抗原的检测结果，确定最适解吸附剂和解吸附条件，并对建立的方法进行初步验证。结果  对分别用4种解吸附剂处理的同批疫苗检测D抗原显示，乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine tetraacetic acid disodium，EDTA-2Na）解吸附剂和200 g/L柠檬酸三钠解吸附剂的解离效果好于另2种解吸附剂。进一步对解离效果较好的2种解吸附剂进行作用时间和温度研究显示，EDTA-2Na解吸附剂于25 ℃处理16~20 h的解离效果最好，IPV I、II、III型D抗原的回收率分别为102%、101%、103%。建立的方法的重复性和中间精密度良好，经该法解吸附的DTaP-IPV的I、II、III型D抗原检测结果的变异系数均小于10%。结论  建立的解吸附方法能有效解吸附DTaP-IPV，可用于DTaP-IPV D抗原检测预处理。     

脊髓灰质炎灭活疫苗和减毒活疫苗联合接种效果分析

目的：探讨脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV）和减毒活疫苗（OPV）不同联合接种方式的临床效果。方法本研究为队列研究,将2009~2013年内收集的在管辖区域具备进行计划免疫4个部门的2400例新生儿进行随机分组,其中一组进行1剂IPV和2剂OPV序贯（I-O-O）（A组）,另一组2剂IPV和1剂OPV序贯（I-I-O）（B组）,并观察两组新生儿进行接种后的反应。结果这两种方式对于新生儿计划免疫无明显的差异。结论这两种方式对于新生儿进行脊髓灰质炎的计划免疫无不良反应。     

常用消毒剂对Sabin株脊髓灰质炎病毒的杀灭效果

目的  评价杀孢子剂、“84”消毒液、酸性苯酚盐、碱性苯酚盐对Sabin株脊髓灰质炎病毒的杀灭效果。方法  首先采用中和剂鉴定试验鉴定消毒剂的中和剂,然后通过悬液定量病毒杀灭试验比较4种消毒剂对Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅱ型的杀灭效果。杀灭对数值>4.0 lg半数细胞培养感染量（50% cell culture infective dose,CCID50）/ml,表示达到消毒效果。结果  中和剂鉴定结果表明,0.5% 硫代硫酸钠可有效中和杀孢子剂和“84”消毒液对病毒的杀灭作用,10%胰蛋白胨大豆肉汤培养基可有效中和酸性苯酚盐和碱性苯酚盐对病毒的杀灭作用。杀孢子剂和1.0%“84”消毒液分别与病毒作用30 min,平均杀灭对数值均>4.0 lgCCID50/ml,达到消毒效果。0.5%“84”消毒液、酸性苯酚盐、碱性苯酚盐分别与病毒作用45 min,平均杀灭对数值仍<4.0 lgCCID50/ml,没有达到预期的消毒效果。结论  杀孢子剂和氯含量较高的“84”消毒液对Sabin株脊髓灰质炎病毒的杀灭效果远大于氯含量较低的“84”消毒液以及酸性和碱性苯酚盐。     

白喉-破伤风-无细胞百日咳-脊髓灰质炎灭活疫苗的临床免疫原性研究进展(续)

目前，国内许多疫苗生产厂家都在致力于研制以白喉-破伤风-无细胞组分百日咳疫苗（diphtheria，tetanus，acelluar component pertussis vaccine，DTacP）为基础的联合疫苗，而国外不同厂家该类联合疫苗在临床试验中的免疫后抗体检测方法和保护性评判标准有较大差异。此文旨在通过比较不同DTacP-灭活脊髓灰质炎疫苗的临床免疫原性结果，包括血清保护率/血清阳转率和不同方法测定的抗体几何平均滴度，为临床试验方案设计提供依据和思路。     

检测流感疫苗中宿主细胞DNA残留量的地高辛标记探针杂交法的建立

目的  建立地高辛标记DNA探针杂交法,检测基于Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney,MDCK）细胞生产的流感疫苗中宿主DNA的残留量。方法  提取MDCK细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针。对地高辛标记DNA探针杂交法进行特异性、灵敏度及稳定性验证, 并用此法检测3批MDCK细胞流感疫苗中的DNA残留量。结果 MDCK细胞基因组DNA的质量浓度为33 ng/μl,260 nm与280 nm波长处的吸光度比值为1.9。制备的探针与非同源细胞DNA无杂交,最低检测限度为10 pg。探针在－70 ℃放置9个月后,检测灵敏度仍可达到10 pg。经检测,MDCK细胞流感疫苗成品中的DNA残留量＜10 ng。结论  建立的地高辛标记探针杂交法特异性强、灵敏度高、稳定好,并且操作简便,可用于MDCK细胞流感疫苗中DNA残留量的检测。